CC BY
65
Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N12
Текущий раздел: Молекулярная медицина
Иммунотерапия перевиваемого рака молочных желез интерлейкином-2: зависимость продолжительности жизни от изначального гематологического статуса.
Моисеева Е.В. 1, Семушина С.Г. 1, Аронов Д.А.1, Мурашев А.Н. 1, Шишкин А.М. 2, Боженко В.К. 2
1 ФГБУ науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
2 ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития РФ, г. Москва.
Адрес документа для ссылки: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v12/papers/mois_v12.htm Статья опубликована: 25 октября 2012 года
Контактная информация:
Рабочий адрес: г. Москва, 117997, ул. Миклухо-Маклая 16/10, ИБХ РАН Моисеева Екатерина Викторовна - н.с. лаборатории биотехнологий ИБХ РАН Семушина Светлана Геннадиевна - м.н.с. лаборатории биологических испытаний ИБХ РАН, semushina@fibkh.serpukhov.su Аронов Дмитрий Алексеевич
Мурашев Аркадий Николаевич - д.б.н., профессор, руководитель лаборатории биологических испытаний ИБХ РАН, тел.: +7 (496) 773-37-53, murashev@fibkh.serpukhov.su
Рабочий адрес: 117485, Москва, ул. Профсоюзная, 86, ФГБУ «РНЦРР»
Шишкин Александр Михайлович - с. н.с. клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «РНЦРР», +7(499)120-11-14
Боженко Владимир Константинович - д.м.н., проф., руководитель клиникодиагностической лаборатории ФГБУ «РНЦРР», 117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д. 86, 89037996484, vbojenko@mail.ru Контактное лицо:
Моисеева Екатерина Викторовна, тел.: +7 917 535 65 49, +7905 528 74 75 e-mail: evmoise@gmail.com
Резюме
Ранее мы продемонстрировали прогностическое значение некоторых рутинных лабораторных показателей для предсказания скорости проявления карциномы молочной железы и эффективность интерлейкина-2 (ИЛ-2) у мышей-реципиентов с рано проявляющимся перевиваемым раком молочных желез (РМЖ). Было проанализировано изменение 17 гематологических показателей у интактных стареющих самцов мышей линии BLRB до перевивки им сингенных клеток РМЖ самки и лечении их 2x105 МЕ ИЛ-2 (13 и 22 день после перевивки опухоли). В среднем, лечение привело к статистически значимому замедлению скорости прироста опухоли у пролеченных мышей, однако динамика выживания не была улучшена. Было показано, что успешность иммунотерапии ИЛ-2 зависела от изначального физического состояния стареющих мышей до перевивки им рака молочных желез, о чем свидетельствовали значения пяти рутинных гематологических параметров у интактных самцов.
Ключевые слова. Иммунотерапия, интерлейкин-2, мышиные модели, прогноз,
продолжительность жизни, рак молочных желез.
Interleukin-2 immunotherapy against transplanted mammary cancer: survival time depends on initial hematological status
EV Moiseeva1, SG Semushina1, DA Aronov1, AN Murashev1, AM Shishkin2, VK Bojenko2
1 IBCh RAS, 117997, Ul. Miklukho-Maklaya, 16/10, Moscow, Russia
2 RSCRR, 11799, Ul. Profsoyuznaya, 86, Moscow, Russia
Abstract
Earlier, we demonstrated a prognostic value of some routine laboratory clinical parameters to predict mammary tumor appearance rate and efficacy of interleukin-2 (IL-2) immunotherapy for the only early appearing transplanted mouse mammary carcinoma. In this work, blood samples were taken from intact old mouse BLRB males before mammary carcinoma inoculation and IL-2 treatment (2x105 IU, 13 и 22 days post transplantation). Then seventeen hematological parameters were analyzed for the treated and control mice in connection with their survival time. On average, IL-2 application resulted in a significant tumor growth inhibition; however, survival of treated mice was not improved significantly. In conclusion, the advantage of the IL-2 application in mammary carcinoma bearing mice was dependent on originally good physical condition of intact old mice before carcinoma cell transplantation; and five routine laboratory clinical parameter values predicted the benefit of the IL-2 immunotherapy.
Key words. Immunotherapy, interleukin-2, mouse model, prognosis, survival, breast cancer.
Оглавление:
Введение
Материалы и методы Результаты исследования Обсуждение результатов Выводы
Список литературы
Введение
Иммунотерапия интерлейкином -2 (ИЛ-2) per se или в комбинации с другими видами иммунотерапии является привлекательной альтернативой (и/или дополнением) к существующим стандартным видам лечения рака молочной железы (РМЖ) в клинике и применяется на практике в ряде стран [1,2]. Однако, терапевтический потенциал интерлейкина-2 (ИЛ-2) при применении как в клинике [3], так и в эксперименте на мышиных моделях этого заболевания человека [4,5], до сих пор недостаточно изучен, хотя определенный успех был достигнут [2]. Это объясняется, по-видимому, двойственностью эффекта ИЛ-2 на организм опухоленосителя [5].
Экспериментальные исследования показывают, что, во-первых, только рано
проявляющиеся опухоли молочной железы замедляют рост под действием ИЛ-2 [6]. Более того, даже при наличии достоверного терапевтического эффекта ИЛ-2 в среднем по группе пролеченных мышей и увеличении продолжительности жизни (ПЖ) значительной части группы (успешные реципиенты) в каждом эксперименте наблюдается укорочение ПЖ определённой части экспериментальных животных (неуспешные реципиенты) [7]. Ранее, мы нашли прогностические факторы среди рутинных лабораторных гематологических и биохимических показателей, которые предсказывают время проявления (или, продолжительность субклинического периода) перевиваемого РМЖ [8]. Целью данной работы было: 1) измерить прижизненно 17 стандартных
гематологических показателей у интактных стареющих самцов мыши до перевивки им сингенных опухолевых клеток РМЖ самки, 2) пролечить реципиентов с рано проявившимся РМЖ двукратной инъекцией ИЛ-2, 3) сравнить изначальные
гематологические показатели у пролеченных ИЛ-2 успешных и неуспешных реципиентов по сравнению с контрольными.
Перейти в оглавление статьи >>>
Материалы и методы Мыши
Мыши линии BLRB- Rb(8.17)1lem (далее, BLRB) с высокой частотой возникновения спонтанной карциномы молочной железы разводились и содержались в конвенциональных (не-SPF) условиях вивария лаборатории биотехнологии Института Биоорганической Химии, РАН, г. Москва [5]. Корма и воду животные получали ad libitum согласно «Правилам институтской комиссии по биоэтике» и авторским рекомендациям. Каждая мышь имела индивидуальную метку и наблюдалась как ветеринарный пациент в течение жизни.
Образцы крови
На день 0 (за две недели до инокуляции опухолевых клеток) из ретроорбитального венозного синуса стареющих интактных самцов мыши линии BLRB (n=64) под эфирным наркозом были взяты образцы крови (0.3-0.5 мл/мышь).
С помощью гематологического анализатора «MICROS OT 18» (Рош, Швейцария) были изготовлены мазки и измерены индивидуальные значения семнадцати следующих гематологических показателей: RBC - абсолютное количество эритроцитов, 1012/л; HCT -гематокрит, %; HGB - гемоглобин, г/л; MCV - средний объем эритроцита, фл; MCH -среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците, пг; MCHC - средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/л; RDW - относительная ширина распределения эритроцитов, %; PLT - абсолютное количество тромбоцитов, 109/л; PCT -тромбокрит, %; MPV - средний объем тромбоцитов, фл; PDW - относительная ширина распределения тромбоцитов, %; WBC - абсолютное количество лейкоцитов, 109/л; LY -относительное содержание лимфоцитов, %; MO - относительное содержание моноцитов, %; SN - относительное содержание сегментоядерных лейкоцитов (у мышей это в подавляющем количестве нейтрофилы), %; BN - относительное содержание
палочкоядерных лейкоцитов (как правило, нейтрофилов), %. Лейкоцитарную формулу определяли с помощью стандартных микроскопических методов по мазкам крови, окрашенным красителем Романовского-Гимза.
Дизайн эксперимента На 14 день после забора крови опухолевые клетки (ОК) из спонтанного рака молочных желез сингенной мыши BLRB в количестве 107 ОК/мышь были перевиты 64 самцам BLRB в правую жировую подушечку, расположенную около подмышечных лимфатических узлов. На 13 день после перевивки РМЖ были отобраны 19 самцов в возрасте 12.1±0.7 месяцев (весом 26.5±0.5 г) с рано проявившимися опухолями размером 5.8±0.3 мм.
Восемь самцов со средним диаметром опухоли 6.3±0.5 мм были пролечены ИЛ-2 дважды на 13 и 22 дни в дозе 2.5х105 МЕ ИЛ-2 на мышь на инъекцию. Препарат разводили в 0.5 мл 0.9% физиологического раствора, содержащего 0.1% бычьего сывороточного альбумина. Инъекции производили перитуморально, т.е. подкожно вокруг опухоли. Мышам контрольной группы (п=11) с опухолями со средним диаметром 5.4±0.4 мм был инъецирован растворитель таким же образом в те же сроки. Ежедневно оценивали состояния здоровья мышей, раз в неделю измеряли размер опухолей. На основании измерения трех взаимно перпендикулярных размеров опухоли вычисляли следующие параметры опухолевого роста: диаметр опухоли (ДО, по формуле (а+Ь+с)/3) и относительный диаметр опухоли (ОДО, как отношение текущего ДО к изначальному диаметру на момент начала лечения) [5]. Уровень значимости различий определяли с помощью параметрического 1-критерия Стьюдента (р - достигнутый уровень значимости). Результаты представлены в виде среднее ± стандартная ошибка.
Перейти в оглавление статьи >>>
Результаты исследования
1. Терапевтический эффект двух инъекций ИЛ-2
Терапевтическая эффективность двух инъекций ИЛ-2 была изучена на самцах в возрасте около года с рано проявившимся РМЖ. Не было выявлено значимых различий по росту среднего диаметра опухолей в пролеченной и контрольной группах (данные не показаны). Однако, прирост диаметра (или, относительный диаметр опухолей) был значительно меньше в группе, пролеченной ИЛ-2 (рис. 1А, день 40, р=0.044). Таким образом, применённый метод иммунотерапии вызвал замедление скорости роста опухоли в пролеченной группе. Выживание пролеченной ИЛ-2 группы было в среднем незначительно лучше, чем выживание контрольных мышей; однако все пролеченные животные были живы на 40-ой день после перевивки опухоли (ППО) против выживания 73% мышей контрольной группы (рис. 1Б). На кривых выживания мышей как опытной, так и контрольной групп, выделяются два периода: до 41 дня ППО (относительно короткое выживание) и после 41 дня ППО (относительно долгое выживание). Наличие этих периодов и привело к необходимости поиска параметров, которые могли бы предсказать короткую (КПЖ) и длительную продолжительность жизни (ДПЖ) среди мышей опытной и/или контрольной групп.
Рис. 1. Относительный диаметр опухоли и выживание пролеченных ИЛ- 2 мышей по сравнению с контролем. Мышам с рано проявившейся карциномой молочной железы ИЛ-2 в дозе 2.5х105 МЕ/мышь/инъекцию вводили дважды на 13 и 22 день после перевивки опухолевых клеток (стрелки). Относительный диаметр опухоли (А) и выживание (Б) для всех мышей контрольной (серые столбцы и квадраты, соответственно) и мышей, пролеченных ИЛ-2 (черные столбцы и треугольники, соответственно).
2. Рост опухоли у мышей с короткой и долгой продолжительностью жизни
Средняя продолжительность жизни у мышей с КПЖ в контрольной и пролеченной ИЛ-2 группе не различалась (37±2 и 40±0.3 дней, соответственно). Тем не менее, доля мышей с КПЖ в пролеченной ИЛ-2 группе составила всего 3/8=37% (неуспешные реципиенты)
против 6/11=54% мышей с КПЖ в контрольной группе. Две локальных перитуморальных инъекции ИЛ-2 (2.5х105/мышь/инъекцию) на 13 и 22 день привели у неуспешных реципиентов к увеличению диаметра опухолей (рис. 2А, день 34 ППО, р=0.047).
Средняя продолжительность жизни у мышей с ДПЖ в контрольных и пролеченных группах не различалась (46±1 и 47±1 дней, соответственно). Тем не менее, доля мышей с ДПЖ (успешные реципиенты) была значительно больше в пролеченной группе, чем доля таких мышей в контрольной группе (63% против 46%, соответственно). Для успешных реципиентов терапия ИЛ-2 по применённой схеме привела к торможению опухолевого роста (рис. 2Б, день 40 ППО, р=0.031).
Дни п&елг п*р* винки опухоли Дня поел* п*р1вн*ии остухоли
Рис. 2. Диаметр опухоли в контрольной (серые квадраты) и пролеченной (черные треугольники) группах для мышей с короткой (А) и долгой продолжительностью жизни (Б) после двух инъекций ИЛ-2 (отмечены стрелками), * - р<0.05
3. Связь гематологических показателей с эффективностью иммунотерапии ИЛ-2
о.«
0,43
с.«
0,4
«,39
и,за
идт
4.»
0,15
0,34
Рис. 3. Значения пяти гематологических показателей, измеренных у интактных мышей до начала эксперимента, для пролеченных ИЛ-2 (черные столбцы) и контрольных (серые столбцы) подгрупп мышей с короткой (заштрихованные) и долгой продолжительностью жизни. Достоверные различия выявлены только между значениями показателей пролеченных мышей с короткой и долгой продолжительностью жизни: * - р<0.05; ** -р<0.01.
Различия по значению измеренных 17 параметров крови у опытных и контрольных мышей не было выявлено; различия по возрасту и количеству отобранной у мышей крови не были связаны с коротким или длительным выживанием (данные не показаны). Более того, не было статистических различий между средними значениями гематологических показателей у мышей контрольной группы с ДПЖ и КПЖ, в том числе и по пяти показателям, представленным на рис. 3 (А-Д, серые столбцы). Исключением являлся достоверно повышенный лейкоцитоз мышей с КПЖ как контрольной, так и пролеченной групп по сравнению с его значением у мышей с ДПЖ (данные не показаны). При этом значения пяти гематологических показателей (БК, ЬУ, ЯВС, НОВ и НСТ), измеренные у интактных мышей, достоверно различались в подгруппах пролеченных ИЛ-2 мышей с КПЖ и ДПЖ (рис. 3А-Д, заштрихованные и не заштрихованные черные столбцы). Доля сегментоядерных лейкоцитов (у мыши это основном нейтрофилы) изначально было достоверно выше у тех мышей, которые затем после перевивки опухоли и иммунотерапии прожили недолго - у неуспешных реципиентов, по сравнению с пролеченной подгруппой, прожившей дольше (успешные реципиенты, рис. 3А, черный заштрихованный столбец против незаштрихованного, соответственно, р=0.042). К тому же, относительное содержание лимфоцитов изначально было ниже у тех мышей, которые затем после перевивки опухоли и иммунотерапии попали в подгруппу неуспешных реципиентов по сравнению со значениями показателя у успешных (рис. 3Б, черный заштрихованный столбец против незаштрихованного, соответственно, р=0.009). Абсолютное количество
эритроцитов в крови интактных мышей, которые затем по мере проведения эксперимента и применения иммунотерапии попали в подгруппу с КПЖ, было снижено по сравнению с показателем у мышей с ДПЖ (рис. 3В, черный заштрихованный столбец против незаштрихованного, соответственно, р=0.034). Средние уровни гемоглобина и
гематокрита, измеренные у мышей до начала эксперимента, также различались в пролеченных подгруппах: у мышей с КПЖ оба показателя были исходно ниже по сравнению с теми животными, которые прожили дольше после перевивки опухоли и двух инъекций ИЛ-2 (рис. 3Г и 3Д, р=0.032 и р=0.008, соответственно). Различий в этих показателях контрольных подгрупп выявлено не было.
Перейти в оглавление статьи >>>
Обсуждение результатов
При перевивке опухолевых клеток рака молочной железы мыши от одного и того же донора (самки со спонтанной опухолью) у реципиентов (как самок, так и самцов) всегда обнаруживаются рано и поздно проявляющиеся опухоли [5,6,8]. Ранее нами было показано следующее: 1) определенные сочетания рутинных гематологических и
биохимических показателей крови и сыворотки, определяемые с помощью математических методов моделирования, могут предсказать время проявления перевиваемой опухоли; 2) под действием однократной локальной перитуморальной инъекции ИЛ-2 выживание реципиентов улучшается только у мышей с рано проявившимися РМЖ, когда переход от пальпируемой опухоли в видимый диапазон (более 4 мм) происходит не позднее 2-3 недель после перевивки опухоли [6,9]. Таким образом, полученные нами ранее результаты естественным образом подводили к необходимости пойти дальше и выяснить, смогут ли рутинные гематологические параметры крови, измеренные заранее у интактных мышей, предсказать эффективность терапии ИЛ-2 в мышиной модели рака молочных желез. С целью ответить на этот вопрос мы определили прижизненно гематологический статус 64 интактных стареющих самцов мыши линии ВЬЯВ разного возраста (от 10 до 14 месяцев), измерив значения 17 рутинных клинических гематологических показателей за две недели до инокуляции самцам опухолевых клеток. Спустя две недели после перевивки ОК была выявлена подгруппа с рано проявившимися опухолями (п=19). Восемь самцов были пролечены ИЛ-2, а 11 самцов с такими же размерами опухоли (около 5 мм), проявившимися в то же время, составили контрольную группу. Несмотря на достоверное уменьшение прироста диаметра
опухоли у пролеченных мышей, значительного улучшения их выживания по сравнению с животными контрольной группы не было выявлено.
При анализе индивидуальных данных каждой мыши было замечено, что терапия ИЛ-2 была эффективна только для определенной доли реципиентов (успешные реципиенты с долгой продолжительностью жизни, ДПЖ) при отсутствии положительного эффекта для других (неуспешные реципиенты, КПЖ). Нашей задачей было найти возможную связь значений лабораторных показателей крови, взятой у интактных мышей до перевивки им ОК, с последующим коротким или долгим выживанием пролеченных и непролеченных интерлейкином-2 опухоленосителей. Как и ожидалось, мы не нашли статистически достоверных различий в средних величинах пролеченных и непролеченных мышей. Более того, различий в гематологических показателях среди мышей контрольной группы с КПЖ и ДПЖ также не наблюдалось (за исключением высокого уровня лейкоцитоза у мышей с КПЖ и в опыте, и в контроле по сравнению с уровнем показателя у мышей с ДПЖ). Однако среди пролеченных ИЛ-2 мышей с различиями по продолжительностью жизни были найдены статистически достоверные различия по пяти гематологическим показателям крови, а именно: SN, LY, RBC, HGB и HST. Повышенное содержание в
крови нейтрофилов и пониженное - лимфоцитов и эритроцитов, наряду с пониженным уровнем гемоглобина и гематокрита у неуспешных стареющих реципиентов свидетельствовало о том, что мыши, изначально страдающие анемией и лимфопенией вследствие хронических воспалительных процессов (главным образом, в печени), после инокуляции опухолевых клеток и лечения ИЛ-2 прожили значительно меньше, чем изначально более здоровые животные. Тогда как ослабленные контрольные самцы с одинаковой вероятностью попадали в подгруппы с КПЖ и ДПЖ. Это показывает, что изначально ослабленное физическое состояние мышей сводило на нет эффективность терапии (по крайней мере, по применённой схеме), что согласуется с известными клиническими данными Kedar и Klein, предлагавшими рекомендовать иммунотерапию только онкологическим пациентам с удовлетворительным состоянием (не менее 70% по шкале Карновского). Тогда как назначение иммунотерапии пациентам с выраженной лейкопенией, сердечно-сосудистыми заболеваниями, заболеваниями органов дыхания, печени или почек должно быть ограничено [9].
Использование в доклинических исследованиях стареющих мышей, находящихся в конвенциональных (не-SPF) условиях с естественным образом возникающими хронические воспалительными заболеваниями до перевивки им ОК, позволяет получать перевиваемые модели, адекватно отражающие сопутствующие патологии онкологических пациентов. Тогда как испытания способов и методов иммунотерапии только на
стандартных моделях (молодых и здоровых мышах-опухоленосителях, содержащихся в SPF-условиях) может привести к ложноположительным результатам, которые невозможно перенести в клинику.
Перейти в оглавление статьи >>>
Выводы
Обобщая вышесказанное, можно заключить, что 1) иммунотерапия перевиваемого рака молочной железы путем двукратной перитуморальной инъекции ИЛ-2 может быть как эффективной, так и безуспешной для определенной части пролеченных стареющих мышей в одном и том же эксперименте и 2) выявленные параметры изначального гематологического статуса могут предсказать эффективность лечения и оправданность назначения иммунотерапии по использованной схеме.
Перейти в оглавление статьи >>>
Список литературы:
1. DisisM.L., BernhardH., Jaffee E.M. Use of tumour-responsive T cells as cancer treatment // Lancet. 2009. V.373 (9664). P. 673-683.
2. Nicolini A., Carpi A. Immune manipulation of advanced breast cancer: an interpretative model of the relationship between immune system and tumor cell biology. // Med. Res. Rev. 2009. V. 29(3). P. 436-471
3. Grande C., Firvida J.L., Navas V., Casal J. Interleukin-2 for the treatment of solid
tumors other than melanoma and renal cell carcinoma. // Anticancer drugs. 2006. V. 17(1). P. 1-
12
4. Den Otter W, Jacobs J.J., Battermann J.J., Hordijk G.J., Krastev Z., Moiseeva E.V., Stewart R.J., Ziekman P.G., Koten J.-W. Local therapy of cancer with free IL-2. // Cancer Immunol. Immunother. 2008. V. 57(7). P.931-50
5. Moiseeva E. Anti-breast cancer drug testing. Original Approaches. Novel Set of Mouse Models. Lambert Ac. Publ. 2009. p.p. 220
6. MoiseevaE.V., MerkulovaI.B., BijleveldC., Koten J.W., MiroshnikovA.I., Den Otter W.
Therapeutic effect of a single peritumoural dose of IL-2 on transplanted murine breast cancer. // Cancer Immunol. Immunother. 2003. V. 52, P. 487-496
7. Moiseeva E.V., Semushina S.G., Chaadaeva A.V., Sadovnikova E.S., Kessler Iu.V.
Criteria for the effectiveness of interleukin-2 immunotherapy in a spontaneous murine mammary tumor model. // Vopr. Onkol. 2010. V. 56(4) P. 443-449.
8. Moiseeva EV, Bojenko VK, Fomina GG, Krasnovskaya OR, Krasilshchikova MS, Den Otter W. Can we predict individual mammary tumor growth rate in recipient mice? // Baltic J Lab. Anim. Sci. 2002. V. 12. P. 74-83
9. Semushina S.G., Tan Ju., Shigabutdinov A.F., Chaadaeva A.V., Jacobc J.J.L., Den Otter W., BijleveldC., SvirshchevskayaE.V., VarticovskyL., MoiseevaE.V. Single intratumoural interleukin-2 treatment prior surgery: local and systemic effects on transplantable mouse mammary adenocarcinomas // Eur. J. Nat. Hist. 2009. V.1. P. 66-67
10. Kedar E., Klein E. Cancer immunotherapy: are the results discouraging? Can they be improved? // Adv. Cancer Res. 1992. V. 59. P. 245-322
Перейти в оглавление статьи >>>
ISSN 1999-7264 © Вестник РНЦРР Минздрава России © Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России
