CC BY
65
журнал (Иркутск). — 2012. — №2. — С. 48-51.
4. Крупаткин А.И., Сидоров В.В., Черемис Н.К. и др. Лазерная допплеровская флоуметрия микроциркуляции крови / Под ред. А.И. Крупаткина, В.В. Сидорова. — М.: Медицина, 2005. — 256 с.
5. Лоран О.Б., Пушкарь Д.Ю., Сегал А.С.,
Юдовский С.О. Наше понимание проблемы хронического простатита // Фарматека. — 2002. — № 10. — С. 69-76.
6. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. — М.: МедиаСфера, 2002. — 312 с.
Информация об авторах: Полунин Андрей Андреевич — ординатор кафедры, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 524143, e-mail: agma@astranet.ru; Мирошников Валентин Михайлович — д.м.н., профессор кафедры, e-mail: agma@astranet.ru; Воронина Людмила Петровна — д.м.н., доцент кафедры, e-mail: agma@astranet.ru; Полунин Андрей Иванович — к.м.н., врач-дерматовенеролог.
© СТЕПАНОВ А.В., ЦЕПЕЛЕВ В.Л., МЕЛЬНИКОВА С.Л. — 2013 УДК 616:612.017.1
ИММУНОСТИМУЛЯТОР ИЗ ЦЕНТРАЛЬНОГО ОРГАНА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА — СУМКИ ФАБРИЦИУСА
Александр Валентинович Степанов, Виктор Львович Цепелев, Светлана Леонидовна Мельникова (Читинская государственная медицинская академия, ректор — д.м.н., проф. А.В. Говорин, кафедра медицины катастроф, зав. — д.м.н. А.В. Степанов, кафедра госпитальной хирургии, зав. — д.м.н., проф. Н.И. Богомолов, кафедра нормальной анатомии, зав. — к.м.н., доц. А.Г. Гончаров)
Резюме. Из ткани бурсы Фабрициуса выделен и синтезирован биологически активный пептид — Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu. Установлено, что пептид стимулирует экспрессию дифференцировочных антигенов Т-, В-лимфоцитов и NK-клеток (CD2, CD3, CD4, CD16, CD25, CD21, CD22, CD23). Обнаружена высокая иммуностимулирующая активность синтетического пептида при экспериментальном иммунодефиците. Предполагается, что пептид (Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu) может служить основой для разработки нового иммуноактивного лекарственного препарата для лечения широкого спектра иммунодефицитных состояний.
Ключевые слова: иммунитет, бурса Фабрициуса, синтетический пептид.
MMUNOSTIMULATOR FROM THE CENTRAL BODY OF HUMORAL IMMUNITY — BURSA OF FABRIGUS
A.V Stepanov, V.L. Tsepelev, S.L. Melnikova (Chita State Medical Academy)
Summary. Biologically active peptide Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu was isolated and synthesized from tissue of bursa of Fabricius. The researche has been conducted on lymphocytes of oncological patients. Peptide has been found to stimulate an expression of clusters of differentiation on T-, B-lymphocytic surface and NK-cells (CD2, CD3, CD4, CD16, CD25, CD21, CD22, CD23). High immunity stimulating activity of synthetic peptide was discovered by experimental immunodeficiency. There is ground to believe that peptide (Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu) can form a basis for the development of new immunoregulatory remedy for treatment of a wide spectrum of immunodeficient states.
Key words: immunity, bursa of Fabricius, synthetic peptide.
Поиск средств избирательного воздействия на отдельные этапы развития иммунного ответа, а также на отдельные субпопуляции клеток иммунной системы является одним из ведущих направлений экспериментальной и клинической иммунологии [4, 6]. Наиболее перспективный подход к решению данной проблемы — создание иммуностимуляторов на основе эндогенных биологически активных веществ пептидной природы [3].
Важную роль в качестве продуцентов иммуноактив-ных пептидов играют центральные органы иммунной системы. Достаточно хорошо изучены пептиды тимуса [1, 2] и костного мозга [5]. Значительно меньше данных, касающихся пептидных регуляторов из сумки Фабрициуса — центрального органа гуморального иммунитета птиц, аналог которого у человека не идентифицирован. Известно, что экстракты бурсы Фабрициуса обладают иммунорегуляторными свойствами [6]. В последние годы за рубежом появляется много работ, связанных с выделением и синтезом различных активных пептидов из сумки Фабрициуса [8, 9, 10].
Цель исследования: изучение иммунологической активности пептида, выделенного нами из экстракта бурсы Фабрициуса.
Материалы и методы
Пептиды из ткани бурсы Фабрициуса цыплят выделяли оригинальной методикой, включающей уксус-
нокислую экстракцию с последующим фракционированием с помощью гель-фильтрации и обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате последовательного разделения иммуноак-тивных фракций экстракта бурсы Фабрициуса, нами был выделен пептид, обладающий по результатам скрининговых исследований иммуностимулирующей активностью, и установлена на газофазном секвенаторе (Model 477A, Applied Biosystems) его первичная структура — Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu. Расширенное исследование иммунологической активности пептида проводили на его синтетическом аналоге. Пептид синтезировали на твердой фазе с использованием Boc схемы, структура синтезированного пептида подтверждали масс спектрометрическим анализом.
Исследования пептида проведены на крови 18 больных раком шейки и тела матки после проведенной предоперационной лучевой терапии, операции и последующей химиотерапии.
Лимфоциты у этих больных выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин (r=1,077 г/см3) и использовали в концентрации 2,5 млн. клеток/мл. Пептид вносили в культуру лимфоцитов в концентрации 5 пмоль/мл и инкубировали в течение двух часов при 37°C. В качестве контроля использовали физиологический раствор. Экспрессию дифференцировочных антигенов лимфоцитов определяли методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с моноклональными
Таблица 1
Влияние пептида на экспрессию дифференцировочных антигенов лимфоцитов у онкологических больных (в %), Ме (25-75 процентиль)
Изучаемые кластеры дифференцировки Контроль 1 (n=20) Контроль 2 (n=18) Опыт (n=18)
CD2 81,6 (75,2-85,4) 59,5 (53,8-64,2)* 80,4 (77,1-84,9)**
CD3 70,9 (65,9-74,3) 45,7 (39,8-49,6)* 68,3 (63,7-71,4)**
CD4 39,6 (36,2-43,4) 12,4 (9,8-16,2)* 31,3 (26,3-35,7)**
CD8 25,1 (22,3-29,7) 18,6 (15,8-20,4)* 19,5 (17,7-21,3)
CD16 13,8 (11,9-15,6) 9,2 (7,4-11,1)* 13,3 (11,8-14,6)**
CD25 7,9 (6,7-8,9) 3,2 (2,8-3,5)* 8,2 ± (6,9-9,0)**
CD19 9,5 (7,8-10,7) 5,8 ± (4,9-6,5)* 6,1 (4,8-6,7)
CD21 8,9 (8,1-9,5) 4,6 (4,1-5,2* 8,4 (7,6-9,2)**
CD22 9,9 (9,1-10,8) 5,2 (4,7-5,9)* 7,4 (6,9-7,8)**
CD23 5,8 (5,3-6,2) 3,1 (2,8-3,5)* 6,2 (5,6-6,8)**
CD72 7,3 (6,5-8,0) 5,1 (4,6-5,8)* 5,9 (5,1-6,6)
Примечание: статистическая значимость различий p < 0,05 * — между контролем 1 и 2, ** — между контролем 2 и опытом.
антителами («Сорбент», Москва; «Sigma», США). Флюоресценцию регистрировали с помощью люминесцентного микроскопа ЕС Люмам-РПО11. Просматривали не менее 200 лимфоцитов. Флюоресцентная микроскопия мембранных маркеров сопровождалась морфологическим контролем клеток в фазовом контрасте [7].
Влияние пептида на интенсивность иммунного ответа изучено на 92 цыплятах породы “Смена-2”. Все исследования выполнены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», Хельсинкской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (2000). На 19-е сутки инкубации у 72 эмбрионов произведена бурсэктомия. Остальные эмбрионы в эти же сроки были подвергнуты ложной бурсэк-томии с воспроизведением всех этапов операции за исключением удаления бурсы. В первой серии экспериментов изучали влияние пептида на индуктивную фазу иммунного ответа. С этой целью бурсэктомированные птицы, начиная с месячного возраста, получали исследуемый препарат в дозе 5 нмоль/кг в течение трех дней.
Затем птиц иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) внутрибрюшинно в дозе 7х109 клеток/кг и через 5 суток определяли состояние иммунитета. В следующей серии экспериментов исследовали действие пептида на продуктивную фазу иммунного ответа, для чего исследуемое вещество вводили цыплятам на 2, 3 и 4 сутки после иммунизации. На 5 сутки определяли титр антител к ксеногенным эритроцитам в реакциях гемагглютинации и гемолиза, число антителообразующих клеток (АОК) селезенки методом локального гемолиза в геле [6].
Полученные данные обработаны с помощью пакета статистических программ Statistica, версия 6,0, пакета программ Biostat и Microsoft Excel 2003. Числовые данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного интервала с указанием значения статистической значимости (p).
Результаты и обсуждение
Известно, что лимфоциты несут на своей мембране маркеры CD, способные выполнять функцию рецепторов, сигнальных или адгезивных молекул. Способность
веществ усиливать или ослаблять экспрессию кластеров дифференцировки иммуно-цитов и, тем самым, модулировать их функцию отражает иммунотропную активность препаратов. Нами исследовано влияние пептида на экспрессию поверхностных маркеров лимфоцитов онкологических больных, у которых наблюдается тяжелый комбинированный иммунодефицит. Лимфоциты здоровых доноров служили контролем 1. Клетки онкологических больных инкубировали в питательной среде (контроль 2) и с добавлением в среду пептида (опыт).
У онкологических больных, и особенно после лучевой и химиотерапии, снижается количество лимфоцитов, несущих на своей поверхности все изучаемые кластеры диф-ференцировки, особенно антигены CD3 и CD4. Инкубация же лимфоцитов с пептидом сопровождается увеличением экспрессии дифференцировочных маркеров на мембране лимфоцитов. Изучаемый пептид обладает широким спектром действия, стимулируя экспрессию мембранных молекул Т-, В-лимфоцитов и ЫК клеток: CD2, CD3, CD4, CD16, CD25, CD21, CD22 и CD23 (табл. 1).
Таким образом, синтезированный пептид оказывают стимулирующее влияние на экспрессию ряда кластеров дифференцировки лимфоцитов.
Эмбриональная бурсэктомия представляет собой идеальную модель иммунодефицита с преимущественным поражением гуморального звена иммунитета, сопровождающегося нарушением антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов, снижением их числа, а также угнетением гуморального иммунного ответа как на Т-, так и на В-зависимый антиген. Поэтому, мы решили оценить действие пептида на состояние иммунитета у цыплят с удаленной в период эмбриогенеза бурсой Фабрициуса.
У эмбрионально бурсэктомированных птиц снижается иммунный ответ на введение ксеногенных эритроцитов (табл. 2). Введение изучаемого пептида бурсэкто-мированным птицам в индуктивную фазу иммунного ответа приводит к увеличению титра гемагглютининов и гемолизинов в 2,7 и 2,5 раз соответственно, числа
Таблица 2
Влияние пептида на индуктивную и продуктивную фазы иммунного ответа у эмбрионально бурсэктомированных цыплят Ме (25-75 процентиль)
Изучаемые показатели Ложно-оперированные цыплята (n = 20) Бурсэктомированные цыплята
Индуктивная фаза Продуктивная фаза
Физиол. раствор (n = 19) Пептид (n = 18) Физиол. раствор (n = 18) Пептид (n = 17)
Титр гемагглю- 6,15 0,95* 2,61** 0,78* 1,21
тининов, log2 (5,34-6,89) (0,68-1,14) (2,38-3,09) (0,56-1,08) (0,94-1,42)
Титр гемолизинов 3,85 1,21* 3,06** 1,33* 1,68
log2 (3,12-4,45) (1,03-1,42) (2,74-3,41) (1,12-1,55) (1,32-1,89)
АОК селезенки, 14,15 4,84* 8,67** 3,61* 4,74
х 103 (12,03-16,12) (3,92-5,67) (7,14-9,87) (2,92-4,27) (3,90-5,34)
Примечание: статистическая значимость различий р < 0,05 * — между ложнооперирован-ными и бурсэктомированными цыплятами; ** — между бурсэктомированными цыплятами, получавшими физиологический раствор и пептид.
антителообразующих клеток в селезенке в 1,8 раза. В продуктивную фазу иммунного ответа пептид был неэффективен.
Таким образом, изучаемое соединение обладает выраженным иммуностимулирующим действием, оказывая влияние преимущественно на В-клеточное звено иммунитета. На наш взгляд, клетками-мишенями для него являются лимфоциты, находящиеся
на различных стадиях онтогенеза — начиная от кле-ток-предшественников и заканчивая зрелыми анти-телопродуцентами. Расшифровка структуры, синтез и изучение механизмов действия индивидуальных пептидов бурсы Фабрициуса открывает перспективу для разработки лекарственных средств нового поколения, производящих направленную коррекцию поврежденных звеньев иммунитета.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анохова Л.И., Патеюк А.В., Кузник Б.И., Загородняя Э.Д. Сравнительное действие тималина, тимогена и ронко-лейкина на состояние иммунитета и гемостаза при развитии эндометрита после кесарева сечения. // Сибирский медицинский журнал. — Иркутск, 2012. — Т. 108, №1. — С. 48-51.
2. Вишнякова Т.М., Долина А.Б. Влияние тималина на динамику цитокинов у детей с инфекционным эндокардитом [Электронный ресурс] // Забайкальский медицинский вестник. — 2010. — № 1. — С. 12-14. — Режим доступа: http:// medacadem.chita.ru/zmv (10.01.2010).
3. Гомазков О.А. Нейротрофическая регуляция и стволовые клетки мозга. — М.: ИКАР, 2006. — 330 c.
4. Кузник Б.И., Лиханов И.Д., Цепелев В.Л. Теоретические и клинические аспекты биорегулирующей терапии в хирургии и травматологии. — Новосибирск: Наука, 2008. — 312 с.
5. Петров Р.В, Михайлова А.А., Фонина Л.А. Миело-пептиды. — М.: Наука, 2001. — 184 с.
6. Степанов А.В., Цепелев В.Л., Цепелев С.Л. Пептидные регуляторы гуморального иммунитета. — Чита: Поиск, 2002. — 180 с.
7. Фримель Г. Иммунологические методы. — М.: Медицина, 1987. — 472 с.
8. Feng X.L., Liu Q.T., Cao R.B. Identification and characterization of novel immunomodulatory bursal-derived pentapeptide-II (BPP-II) // J. Biol. Chem. — 2012. — Vol. 3. — P. 801-807.
9. Feng X.L., Liu Q.T., Cao R.B. A bursal pentapeptide (BPP-I), a novel bursal-derived peptide, exhibits antiproliferation of tumor cell and immunomodulator activity. // Amino Acids. — 2012. — Vol. 42. — P. 2215-2222.
10. Liu X.D., Feng X.L., Zhou B. Isolation, modulatory functions on murine B cell development and antigen-specific immune responses of BP11, a novel peptide from the chicken bursa of Fabricius. // Peptides. — 2012. — Vol. 35(1). — P. 107-113.
Информация об авторах: 672000, г. Чита, ул. Горького 39а, ЧГМА, тел. (факс) (3022) 35-43-24, e-mail: avstep@rambler.ru, Степанов Александр Валентинович — д.м.н, заведующий кафедрой; Цепелев Виктор Львович — д.м.н., профессор кафедры; Мельникова Светлана Леонидовна — д.м.н, профессор кафедры.
© ГОРИНА А.С., GOETZE S., КОЛЕСНИЧЕНКО Л.С. — 2013 УДК 577.112.3:616.89
ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА МОНОАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВ В СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ АУТИЗМЕ, СИНДРОМЕ ДЕФИЦИТА ВНИМАНИЯ И ГИПЕРАКТИВНОСТИ И ИХ КОМОРБИДНОСТИ
Анна Сергеевна Горина1, Simon Goetze 2, Лариса Станиславовна Колесниченко3 (1Sick Children Hospital, Toronto, Canada, президент — M.J. Haddad; 2 Клиника медицинского факультета Университета Генриха Гейне, Дюссельдорф, Германия, кафедра молекулярной биологии, зав. — Dr. S. Goetze; 3Иркутский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра химии и
биохимии, зав. — д.м.н., проф. Л.С. Колесниченко)
Резюме. Моноаминерические системы мозга играют важную роль как нейротранмиттеры и регуляторные факторы. Их нарушения участвуют в проявлении симптомов аутизма (синдрома Каннера) и синдрома дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ). Изучалась возрастная динамика содержания серотонина, дофамина и норадре-налина в СМЖ у пациентов с аутизмом, СДВГ и коморбидностью аутизма и СДВГ в возрасте 1-25 лет. Как при СДВГ, так и аутизме нарушена возрастная динамика моноаминергических нейромедиаторов серотонина, дофамина и норадреналина (p<0,05), особенно в 5-7 лет при СДВГ: повышение серотонина (в 1,2-1,4 раза) и норадреналина (в 1,2 раза) и понижение дофамина (в 1,5-1,6 раза); в 1 и 5 лет при аутизме: понижение серотонина (в 4,9-1,2 раза), дофамина (в 2,8 раза) и норадреналина (в 1,2-1,4 раза); в 5-25 лет при коморбидности СДВГ и аутизма: понижение серотонина (в 1,3-2,1 раза), дофамина (в 1,9-3,7 раза) и норадреналина (в 1,4-2,1 раза). Нарушения совпадают с критическими периодами формирования и созревания различных структур головного мозга, что может приводить к проявлению симптомов СДВГ и аутизма.
Ключевые слова: аутизм, синдром дефицита внимания и гиперактивности, серотонин, дофамин, норадрена-лин, спиномозговая жидкость, возрастная динамика.
AGE DYNAMICS OF MONOAMINERGIC NEUROTRANSMITTERS IN CEREBROSPINAL FLUID IN AUTISM, ATTENTION DEFICIT AND HYPERACTIVITY DISORDER AND THEIR COMORBIDITY
АЛ Gorina1, S. Goetze 2, L.S. Kolesnichenko3 (1Sick Children Hospital, Toronto, Canada; 2Heinrich Heine University, Dusseldorf, Germany;
3Irkutsk State Medical University, Russia)
Summary. Brain monoaminergic systems play an important role as neurotransmitters and regulators in ontogenesis. Their disturbances are involved into symptoms of autism (Kanner syndrome) and attention deficit and hyperactivity disorder (ADHD). Age dynamics of serotonin, dopamine and norepinephrine in CSF has been studied in patients with autism, ADHD and comorbidity of autism and ADHD in the age range of 1-25 years. Both in ADHD and autism there were disturbances in age dynamics of CSF serotonin, dopamine and norepinephrine (p<0.05), especially at the age of 5-7 years in ADHD: increase in serotonin (1.2-1.4-fold) and norepinephrine (1.2-fold) and decrease in dopamine (1.5-1.6-fold); at 1 and 5 years in autism: a decrease in serotonin (4.9-1.2-fold), dopamine (2.8-fold) and norepinephrine (1.2-1.4-fold); at the age of 5-25 years in
