CC BY
94
ИММУНОПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ У ЖЕНЩИН,
ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА
СЕМЕНОВ Д.М., НОВИКОВ П.Д., ЗАНЬКО С.Н., ДМИТРАЧЕНКО Т.И.
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский
университет»
Резюме. В статье представлен анализ иммунологических изменений у женщин репродуктивного возраста при различных клинических вариантах папилломавирусной инфекции. Сформулированы прогностические критерии, определяющие течение патологического процесса. Намечены пути повышения эффективности лечения ВПЧ-инфекции.
Ключевые слова: Вирус папилломы человека, иммунный ответ,
интерлейкин 2.
Abstract. In article the analysis immunological changes at women of reproductive age at various clinical variants papillomavirus infection. Are formulated prognosis criteria defining a current of pathological process. Ways of increase of efficiency of treatment HPV of an infection are planned.
Keywords: human papilloma virus, the immune answer, interleukin-2
Адрес для корреспонденции: Республика
Беларусь, 210023, г. Витебск, пр-т Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра акушерства и гинекологии. - Семенов Д.М.
Ключевой концепцией этиопатогенеза рака шейки матки признана вирусная гипотеза, центральное место в которой занимает вирус папилломы человека (ВПЧ), обладающий наибольшим онкогенным потенциалом и являющийся основным экзогенным фактором цервикального канцерогенеза [1, 2]. Среди эндогенных модифицирующих факторов в генезе малигнизации эпителия шейки матки наиболее значимой представляется роль иммунной системы [3]. Иммунологическая недостаточность на фоне ВПЧ приводит к низкой эффективности общепринятых методов лечения и высокому проценту рецидивирования, что ведет к признанию необходимости сочетания этиотропного лечения этих болезней с иммунокоррекцией [4].
Целью данной работы явилось изучение иммунологического статуса у женщин, инфицированных различными типами ВПЧ, и разработка комплексного подхода к лечению женщин репродуктивного возраста с заболеваниями шейки матки, обусловленными папилломавирусной инфекцией.
Методы
Под наблюдением находилось 47 женщин фертильного возраста (23-35 лет) с различными клиническими вариантами течения ВПЧ-инфекции (классификация Lacey CJ., Gross G.) [5]. Определение ВПЧ производилось с помощью полимеразной цепной реакции. Для обнаружения ДНК ВПЧ использовались тест-системы: - АмплиСенс ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 35Н, 39, 45, 52, 58, 59, 67 АмплиСенс ВПЧ (НПФ «ДНК-технологии» г. Москва).
Для оценки напряженности клеточного иммунного ответа к антигенам рекомбинантного основного капсидного белка (L1) ВПЧ 6, 11, 16, 18 типов применяли следующие иммунологические тесты:
• Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) на антигены
ВПЧ.
• Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) на антигены ВПЧ с добавлением в бластные культуры клеток интерлейкина-2.
• Определение иммунофенотипа лимфоцитов с использованием стабильных диагностикумов на основе моноклональных антител (МКАТ) к CD3+, CD4+, CD8+, CD25+, CD22+ - рецепторам лимфоцитов.
• Реакция сенсибилизации лимфоцитов к антигенам, по определению усиления экспрессии на них рецептора к интерлейкину-2 под влиянием антигенов ВПЧ 6, 11, 16, 18 типов.
• Определение в сыворотке крови иммуноглобулинов G, M, A.
Результаты и обсуждение
При проведении реакции бластной трансформации лимфоцитов на антигены ВПЧ, у большинства пациенток с латентной и субклинической формой течения инфекционного процесса, инфицированных высоко онкогенными типами ВПЧ, нами была выявлена сенсибилизация Т-лимфоцитов к антигенам ВПЧ (Таблица 1). В тоже время, у части больных ВПЧ-инфекцией (42%) с клинически выраженными формами заболевания, отсутствует сенсибилизация Т-лимфоцитов к антигенам ВПЧ.
Таблица 1
Частота положительных значений РБТЛ у пациенток с различными клиническими вариантами течения папилломавирусной инфекции при стимуляции клеток антигенами ВПЧ и добавлении в культуру клеток
интерлейкина-2 человека
Частота положительных РБТЛ к АГ ВПЧ абс. (% ±m) Частота положительных РБТЛ к АГ ВПЧ при добавлении IL-2 абс.(% ±m)
Латентная инфекция (n-21) 13 (61.9±10.9) 17 (80.9±8.8)
Субклиническая форма (n-15) 9 (60±13.9) 10 (66.7±12.6)
Клиническая форма (n-11) 5 (45.5±15.8) 7 (63.6±15.2)
Всего (n-47) 27 (57.5±7.3) 34 (72.3±6.6)
С целью выяснения механизмов, препятствующих формированию сенсибилизации Т-лимфоцитов к антигенам ВПЧ, нами дополнительно проведена постановка РБТЛ с добавлением интерлейкина-2 в бластные культуры клеток, стимулированных антигенами ВПЧ. Проведенные исследования показали, что при всех клинических формах течения ВПЧ-инфекции, имело место увеличение частоты положительных значений РБТЛ на антигены вируса после добавления интерлейкина-2. Значительно чаще сенсибилизация лимфоцитов к антигенам ВПЧ после добавления в бластные культуры клеток интерлейкина-2 (1Ь-2) наблюдалась у пациенток с латентным течением ВПЧ-инфекции. Установленные нами факты свидетельствуют о том, что у части больных имеет место недостаточная продукция интерлейкина-2.
Проведенный сравнительный анализ уровня сенсибилизации лимфоцитов к антигенам ВПЧ при постановке РБТЛ с добавлением в культуры бластных клеток и 1Ь-2 и без добавления 1Ь-2 показал статистически значимые различия (критерий Вилкоксона) (Таблица 2).
Таблица 2
Степень сенсибилизации лимфоцитов к антигенам ВПЧ у пациенток с различными клиническими вариантами течения папилломавирусной
инфекции
Средний уровень бластных клеток при стимуляции АГ ВПЧ (М±т) Средний уровень бластных клеток при стимуляции АГ ВПЧ при добавлении 1Ь 2 (М±т) р - ІЄУЄІ
Латентная инфекция (п-21) 4,6±0,15 5,9±0,15 р<0,001
Субклиническая форма (п-15) 4,8±0,21 6,2±0,18 р<0,001
Клиническая форма (п-11) 4,9±1,14 6,2±0,2 р=0,003
Всего (п-47) 4,8±0,2 6,1±0,2 р<0,001
Средний уровень бластных клеток при стимуляции АГ ВПЧ составлял: при латентной инфекции - 4,6%, при добавлении 1Ь-2 в культуру клеток - 5,9% (р<0,001). При субклинической форме средний уровень бластных клеток при стимуляции АГ ВПЧ составлял 4,9%, при добавлении 1Ь-2 в культуру клеток -6,2% (р<0,001). При клинической форме 4,9% и 6,2% соответственно (р=0,003).
Проведенный анализ также подтверждает факт недостаточной продукции эндогенного 1Ь-2 в ответ на антиген ВПЧ при всех клинических вариантах течения папилломавирусной инфекции. Данное обстоятельство может быть объяснено тем, что периферические Т-клетки являются долго живущими и, будучи активированы определенными сигналами, выполняют следующие функции: пролиферацию, дифференцировку, продукцию лимфокинов. Т-клетки (как и В-клетки) могут быть активированы специфически - антиген -специфической (моноклональной) активацией и неспецифически -
индуцированием поликлональными активаторами (митогенами). В первом случае происходит бластная трансформация лимфоцитов с последующими серийными делениями, во втором случае бластная трансформация не происходит - митогены вызывают однократное митотическое деление.
Важным этапом при различных вариантах клинического течения ВПЧ-инфекции является поддержание и регуляция иммунного ответа. Регуляция осуществляется Т-лимфоцитами: Т-хелперами-1 и Т-хелперами-2, в которые в процессе иммунного ответа в периферических лимфоидных органах превращаются выходящие из тимуса Т-хелперы-О. Особой функцией лимфоцитов является предотвращение и подавление иммунного ответа -супрессия. Как прямая антиген - специализированная супрессия, так и опосредованная антиген - специфическая супрессия, играют значительную роль в различных фазах иммунорегуляции, периферической толерантности и сдерживании аутоиммунитета. Установленное нами отсутствие пролиферации в ответ на стимуляцию специфическим антигеном иммунокомпетентных клеток у ряда больных, инфицированных ВПЧ, в большей степени было выражено при наличии клинических проявлений инфекции.
Нельзя исключить, что дефекты специфического клеточноопосредованного иммунного ответа могут быть следствием вмешательства инфекционных агентов. В частности, геном ВПЧ кодирует белок, препятствующий транскрипции и трансляции антигенов главного комплекса гистосовместимости (MHC - major histocompatibility complex) I класса. Другой продукт гена ВПЧ может связываться непосредственно с MHC I класса в цитоплазме клеток и препятствовать их экспрессии на клеточных мембранах. Это приводит к снижению экспрессии молекул MHC I на поверхности клеток и предохраняет инфицированные клетки от атаки CD8+ CTL [6].
Для уточнения механизмов формирования иммунного ответа у больных ВПЧ-инфекцией, нами проведено изучение иммунофенотипа лимфоцитов. При всех вариантах клинического течения ВПЧ-инфекции, у пациенток, инфицированных ВПЧ, статистически значимо чаще, по сравнению с группой контроля, определялось снижение СD2+, СD3+, СD4+ рецепторов лимфоидных клеток и повышение СD22+, СD25+ рецепторов лимфоцитов.
Снижение СD2+ рецепторов на лимфоидных клетках выявлено у 16 (76,2±9,5%) пациенток при латентном течении инфекции (р<0,001). При субклинической форме течения инфекционного процесса снижение СD2+ рецепторов выявлено у 8 (53,3±13,3%) пациенток (р<0,001), при клинической форме у 6 (54,6±15,8%) пациенток (р<0,05), в группе контроля снижение СD2+ рецепторов на лимфоидных клетках выявлено у 2 (10±6,9%) пациенток.
Снижение СD3+ рецепторов на лимфоидных клетках выявлено у 19 (90,5±6,6%) пациенток с латентным течением инфекции (р<0,001), у 11 (73,3±11,8%) пациенток с субклиническими проявлениями инфекции (р<0,001), у 8 (72,7±14,1%) пациенток при клиническом течении инфекции (р<0,001) и только у 2 (10±6,9%) пациенток группы контроля.
Снижение СD4+ рецепторов на лимфоидных клетках выявлено у 17 (80,9±8,8%) пациенток с латентным течением инфекции (р<0,001), у 10
(66,7±12,6%) пациенток с субклиническими проявлениями инфекции (р<0,001), у 7 (63,6±15,2%) пациенток при клиническом течении инфекции (р<0,001) и только у 1 (5±5,0%) пациентки группы контроля.
Снижение иммунорегуляторного индекса (ИРИ) выявлено у 11 (52,4±11,2%) пациенток с латентным течением инфекции (р<0,05), у 7 (46,7±13,3%) пациенток с субклиническими проявлениями инфекции (р<0,05), у 7 (63,6±15,2%) пациенток при клиническом течении инфекции (р<0,001), и только у 1 (5±5,0%) пациентки группы контроля.
Повышение СБ22+ рецепторов на лимфоидных клетках выявлено у 9 (42,9±11,1%) пациенток с латентным течением инфекции (р<0,05), у 3 (20±10,7%) пациенток с субклиническими проявлениями инфекции (р>0,05), у 1 (9,1±9,1%) пациентки при клиническом течении инфекции (р>0,05), у 1 (5±5,0%) пациентки в группе контроля.
Повышение СБ25+ рецепторов на лимфоидных клетках выявлено у 19 (90,5±6,6%) пациенток с латентным течением инфекции (р<0,001), у 14 (93,3±6,7%) пациенток с субклиническими проявлениями инфекции (р<0,001), у 10 (90,9±9,1%) пациенток при клиническом течении инфекции (р<0,001), и только у 2 (10±6,9%) пациенток в группе контроля.
Статистически значимых различий уровня СБ8+ рецепторов на лимфоидных клетках у пациенток, инфицированных ВПЧ, и в группе контроля выявлено не было.
Установленный нами дефект Т-хелперного звена иммунной системы (статистически значимое снижение СБ4+ рецепторов лимфоцитов) у пациенток с различными клиническими вариантами ВПЧ-инфекции объясняет длительное течение инфекционного процесса и склонность к активации с развитием субклинических и клинических проявлений.
Общеизвестно, что высокоаффинный рецептор составляет 10% от количества всех рецепторов 1Ь2 на клетках мишенях. Он состоит из 3 цепей: две цепи 1Ь2Я-а (СБ25,р55), и 1Ь2Я-Р (СБ122, р75) работают в качестве связывающего лиганда, а третья цепь 1Ь2Я-у (СБ132,р64) обеспечивает проведение сигнала. Цепь 1Ь2Я-Р (СБ122) постоянно экспрессируется на покоящихся Т-лимфоцитах и КК клетках. Предшественники Т-лимфоцитов экспрессируют 1Ь2Я-а (СБ25,р55) цепь, но лишены высокоаффинных рецепторов, для появления которых необходима активация клетки. При прямом действии 1Ь2 они отвечают пролиферацией. Следующий тип 1Ь-2Я - это рецептор промежуточной аффинности. Он состоит только из двух цепей: 1Ь2Я-в (СБ122) и 1Ь2Я-у (СБ132) цепи. Рецептор низкой аффинности состоит только из легкой цепи 1Ь2Я-а (СБ25) [7].
С одной стороны, полученные данные вносят дополнения в расшифровку механизмов прогрессии опухолевой трансформации эпителиальных клеток вирусом папилломы человека, с другой стороны - указывает на недостаточность продукции эндогенного интерлейкина-2 у больных, инфицированных ВПЧ.
Данное утверждение подтверждает проведенный нами анализ частоты усиления экспрессии на лимфоцитах рецептора к интерлейкину-2 под влиянием
антигена ВПЧ 6. 11. 16. 18 типов у больных с различными вариантами течения ВПЧ-инфекции (Таблица 3).
Таблица 3
Частота усиления экспрессии на лимфоцитах рецептора к 1Ь-2 под
влиянием антигена ВПЧ 6, 11, 16, 18 типов у больных с различными вариантами течения
ВПЧ-инфекции
Частота усиления экспрессии на лимфоцитах рецептора к ГЬ-2 под влиянием АГ ВПЧ 6, 11, 16, 18 типов у больных с различными вариантами течения ВПЧ инфекции абс. (%±т)
Латентная инфекция (п-21) Субклиническая форма (П-15) Клиническа я форма (П-11) Контроль (п-20)
прирост до 10% - «-» -отрицательная реакция 6 (28,6±10,1) 4 (27,6±11,8) 3 (27,3±14,1) 1 (5±5,0)
прирост 10-15% - «+-» -сомнительная реакция 3 (14,3±7,8) 3 (20±10,7) 0 4 (20±9,2)
прирост 15-25% - «+» -положительная реакция 11 (52,4±11,2) 6 (40±13,1) 4 (36,7±15.2) 7 (35±10,9)
прирост 25-30% - «++» - высоко положительная реакция 2 (9,5±6,6) 0 1 (9,1±9,1) 6 (30±10,5)
прирост более 30% -«+++» - очень высоко положительная реакция 2 (9,5±6.6) 2 (13,3±9,1) 0 2 (10±6,9)
* Статистически значимо по отношению к контрольной группе (р<0,05).
Как видно из представленных в таблице данных. при стимуляции антигенами ВПЧ не наблюдается увеличения экспрессии рецепторов на лимфоцитах к интерлейкину-2 при всех клинических формах течения ВПЧ-инфекции.
Увеличение экспрессии активированными клетками мишенями на своей мембране рецепторов к интерлейкину-2 возникает только при достаточной продукции эндогенного интерлейкина-2. в чем и заключается одна из биологических функций данного медиатора иммунного ответа.
Полученные данные подтверждают данные о недостаточной продукции интерлейкина-2 у больных ВПЧ-инфекцией.
Нами проведен анализ состояния основных ^ (О. М. А) в сыворотке крови у больных с различными вариантами течения инфекционного процесса. Содержание ^ (А. М. О) у женщин с папилломавирусной инфекцией отличалось от пациенток контрольной группы.
При исследовании уровня ^А в сыворотке крови у больных ВПЧ. нами было выявлено статистически значимое снижение его продукции в по отношению к показателю контрольной группы. Снижение ^А было выявлено у 18 (38.3±7.2%) женщин. инфицированных ВПЧ и у 2 (10±6.9%) женщин группы
контроля (р<0.01). Низкий уровень ]^А создает возможность для персистенции и реинфицирования ВПЧ.
Содержание 1^М в крови у пациенток. инфицированных ВПЧ. статистически значимо превышало значение этого показателя контрольной группы. Высокие значения ]^М (более 1.3 г/л) среди пациенток.
инфицированных ВПЧ. выявлено у 38 (80.9±5.8%) женщин и у 3 (15±8.2%) женщин группы контроля (р<0.001). В тоже время. низкие значения ]^М (менее
0.9г/л) выявлялись с одинаковой частотой (5 (10.6±4.5%) женщин.
инфицированных ВПЧ и 2 (10±6.9%) женщин группы контроля).
Установленный нами факт преимущественного синтеза ]^М у пациенток. инфицированных ВПЧ. может служить признаком нарушения регуляторной функции Т-лимфоцитов-хелперов.
Содержание ]^О. важнейшего иммуноглобулина. определяющего завершенность и эффективность иммунного ответа. в группе женщин. инфицированных ВПЧ. было ниже уровня контрольной группы. Низкие значения (менее 8г/л) были выявлены у 10 (21.3±6%) женщин.
инфицированных ВПЧ и у 1 (5±5%) женщины группы контроля (р<0.05).
Таким образом. у большинства пациенток с ВПЧ-инфекцией. имело место недостаточность гуморального звена иммунитета (гипореактивность или снижение продукции ключевого - ]^О. несмотря на наличие инфекции).
В проведенных нами исследованиях с добавлением в бластные культуры клеток АГ ВПЧ и интерлейкина-2. было установлено. что процент положительных значений РБТЛ возрастал. Это указывало на недостаточную продукцию интерлейкина-2 у определенной группы больных. инфицированных ВПЧ.
Полученные результаты вызвали необходимость проведения исследований по определению уровня интерлейкина-2 в крови пациенток с различными вариантами течения ВПЧ-инфекции (Таблица 4). Было установлено. что при всех вариантах клинического течения ВПЧ-инфекции. уровень интерлейкина-2 был статистически значимо ниже по сравнению с группой контроля (р <0.001).
Таблица 4
Уровень интерлейкина-2 (пг\мл) в крови пациенток с различными
вариантами течения
В ПЧ-инфекции
Уровень интерлейкина-2 (М±т) р - ІЄУЄІ
Латентная инфекция (п-21) 23.52±4.96 р <0.001
Субклиническая форма (п-15) 25.27±4.86 р <0.001
Клиническая форма (п-11) 24.82±4.29 р <0.001
Контрольная группа (п-20) 44.95±4.4
Концентрация интерлейкина-2 в сыворотке крови пациенток.
инфицированных ВПЧ. находилась в диапазоне от 0 до 34 пг/мл. в контрольной группе - в диапазоне от 0 до 55 пг/мл. Средний уровень интерлейкина-2 у
7
пациенток с латентным течением инфекции составил 23.52±4.96 пг/мл. Средний уровень интерлейкина-2 у пациенток при субклинической инфекции составил 25.27±4.86 пг/мл. Средний уровень интерлейкина-2 у пациенток с клиническими проявлениями инфекции составил 24.82±4.29 пг/мл. Статистически значимых различий уровня интерлейкина-2 у пациенток с латентной. субклинической и клинической формой течения инфекционного процесса выявлено не было.
Активированные Т-лимфоциты выделяют много цитокинов (у-интерферон. ИЛ-4. ИЛ-5. ИЛ-6). способствующих. главным образом. выработке В-лимфоцитами антител различных подклассов. Цитокины вместе со специфическим антигеном стимулируют бласт-трансформацию В-лимфоцитов. с последующей экспансией именно данного. специфического клона и превращением большинства В-клеток в антителпродуцирующие клетки -плазматические клетки. Учитывая существенное значение медиаторов иммунного ответа в степени ответа лимфоцитов на специфические антигены. нами дополнительно проведены исследования по определению уровня интерлейкина-4 в крови пациенток. инфицированных ВПЧ (Таблица 5).
Таблица 5
Уровень интерлейкина-4 (пг\мл) в крови пациенток с различными
вариантами течения _______________________ВПЧ-инфекции_________________________
Уровень интерлейкина-4 (М±т) р - ІЄУЄІ
Латентная инфекция (п-21) 26.71±6.23 р >0.05
Субклиническая форма (п-15) 24.73±6.39 р >0.05
Клиническая форма (п-11) 26.27±10.53 р >0.05
Контрольная группа (п-20) 24.55±4
Концентрация интерлейкина-4 в сыворотке крови пациенток. инфицированных ВПЧ. находилась в диапазоне от 0 до 54 пг/мл. в контрольной группе - в диапазоне от 0 до 32 пг/мл. Проведенные нами исследования не выявили изменений в уровнях интерлейкина-4 в крови пациенток с различными клиническими вариантами течения ВПЧ-инфекции по сравнению с группой контроля.
Таким образом. проведенные исследования показали. что у пациенток с ВПЧ-инфекцией недостаточность клеточного иммунного ответа обусловлена дефицитом продукции интерлейкина-2.
Заключение. При всех вариантах клинического течения ВПЧ-инфекции. у пациенток статистически значимо чаще определялось снижение СБ2+. СБ3+. СБ4+ рецепторов лимфоцитов. снижение иммунорегуляторного индекса СБ4+/СБ8+.
Установленный нами дефект Т-хелперного звена иммунной системы (статистически значимое снижение СБ4+ рецепторов лимфоцитов) у пациенток с различными клиническими вариантами ВПЧ-инфекции объясняет длительное
течение инфекционного процесса и склонность к активации с развитием субклинических и клинических проявлений.
Установленный нами факт высокой экспрессии IL2R-a (CD25+) и усиления пролиферации Т-лимфоцитов в бластных культурах клеток на АГ ВПЧ после добавления интерлейкина-2. у больных с различными клиническими вариантами течения ВПЧ-инфекции. указывает на недостаточность продукции эндогенного интерлейкина-2.
Нормализация клеточного звена иммунитета и устранение дефицита выработки эндогенного интерлейкина 2 будет способствовать адекватному иммунному ответу и. в конечном итоге. элиминации ВПЧ.
Литература
1. Минкина. Г. Н. Предрак шейки матки / Г. Н. Минкина. И. Б. Манухин. Г. А. Франк. - М. Аэрограф-Медиа - 2001. - С. 76-79.
2. Новиков. А. И. Инфекции. передаваемые половым путем. и
зкзоцервикс / А. И. Новиков. А. В. Кононов. И. Г. Ваганова. - М.: Медицина.
2002. - С. 34 - 59.
3. Benton. C. Human papillomavirus in the immunosuppressed / C. Benton. H. Shahidullah. J. A. Hunter // Papillomavirus Rep. - 2002. - N 3. - P. 23-26.
4. Is therapeutic conization sufficient to eliminate a high-risk HPV infection of the uterine cervix? A clinicopathological analysis/ K. Bodner [et al.] // Anticancer Res. - 2002. - Vol.22. N 6B. - P.3733-3736.
5. Wick. M. J. Diagnosis of human papillomavirus gynecologic infections / M. J. Wick // Clin. Lab. Med. - 2000. - Vol. 20. N 2. - P. 271-287.
6. CD4-Positive and CD8-Positive Cytotoxic T Lymphocytes Contribute to Human Papillomavirus Type 16 E6 and E7 Responses / Mayumi Nakagawa [et al.] // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1999. - Vol. 6. N 4. - Р. 494-498.
7. Carol. B. DNA array analysis of interleukin-2-regulated immediate/early genes / B. Carol. A. S. Kendall // Medical Immunology [Electronic resource] November 2002. - Mode of access: http://www.medimmunol.com/content/1/1/2. -Date of access: April 22. 2008.
