CC BY
70
ЛЕКАРСТВЕННАЯ ТЕРАПИЯ 55
УДК 616-006-085/37:612.017.1
M.A. Baryshnikova1, N.K. Akhmatova2, A.M. Karamzin1
IMMUNOMODULATING ACTIVITY OF SUBLINGUAL FORM OF GALAVIT
!N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 2I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serums RAMS, Moscow
ABSTRACT
A comparative study of immunomodulating activity of sublingual and injection forms of Galavit was conducted in vivo. The ratio of spleen mononuclear leukocytes (MNL) subpopulations and expression of serum cytokines (IFN-Y, TNF-a, IL-ip, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) was measured. The results showed that sublingual and injection forms of Galavit had similar immunomodulating effect, which was registered as increased number of natural killers (NK) and activated CD25+- lymphocytes in MNL population and as enhanced concentrations of IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-12 in mice blood.
Key words: Galavit, mononuclear leukocytes, serum cytokines, immunomodulating activity.
12 1 М.А. Барышникова , Н.К. Ахматова , А.М. Карамзин
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ СУБЛИНГВАЛЬНОЙ ФОРМЫ ГАЛАВИТА
:ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ГУ НИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Проведено сравнительное изучение иммуномодулирующей активности сублингвальной и инъекционной форм галавита in vivo. У животных определяли соотношение субпопуляций мононуклеарных лейкоцитов селезенки и уровень сывороточных цитокинов (IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12). Установлено, что сублингвальная и инъекционная формы галавита оказывают сходное иммуномодулирующее действие, проявляющееся в увеличении содержания NK и активированных СБ25+-лимфоцитиов в популяции мононуклеарных лейкоцитов, а также в повышении уровня концентраций IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-12 в крови мышей.
Ключевые слова: галавит, мононуклеарные лейкоциты, сывороточные цитокины; иммуномодулирующая активность.
ВВЕДЕНИЕ
Иммуномодулятор галавит проявляет противовоспалительную активность вследствие способности обратимо ингибировать синтез гиперактивированны-ми макрофагами провоспалительных цитокинов TNF и IL-1 или стимулировать их при исходной недостаточности. Галавит способен восстановить угнетенную фагоцитарную функцию макрофагов и нейтрофилов и, следовательно, противоинфекционную защиту [3; 8]. Высказывалось предположение, что эффекты галавита опосредовались стимуляцией NK и CD8+ цитотокси-ческих лимфоцитов. При проведении клинических исследований было установлено, что применение инъекционной формы галавита у онкологических больных на фоне химиотерапии приводит к нормали-
зации иммунологических параметров [4-7]. Наряду с инъекционной разработана более удобная для применения сублингвальная форма препарата, которая, как установлено в экспериментальных исследованиях, оказывает стимулирующее влияние на функциональную активность лимфоцитов (пролиферативную способность и КК-активность) [1; 2]. Цель настоящей работы - изучение влияния сублингвальной формы галавита на субпопуляционный состав лимфоцитов и цитокиновый профиль у мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мышам линии СВА вводили галавит 200 мкг однократно, внутрибрюшинно, или сублингвально с помощью зонда по 40 мкг каждый час в течение 5 ч
(суммарная доза составила 200 мкг). Интервал дачи препарата был выбран экспериментально при визуальном контроле рассасывания части таблетки с чередованием сторон ее закладывания. Контрольной группе животных сублингвально давали крахмал. В каждой группе было использовано по 10 животных.
Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Получение суспензии мононуклеарных лейкоцитов и лимфоцитов мышей
Селезенки мышей гомогенизировали в среде 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) и трижды осаждали центрифугированием. Взвесь клеток селезенки центрифугировали при 400 g в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-урографина («Pharmacia», плотностью 1,077 г/см3). Мононуклеарные лейкоциты (МЛ), образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и 3-кратно отмывали средой 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g. Для получения лимфоцитов взвесь МЛ в среде RPMI-1640 разливали во флаконы и не прилипшие клетки переводили в среду культивирования (106 клеток в 1 мл обогащенной среды RPMI-1640).
Иммуноферментный анализ
Уровень цитокинов определяли в сыворотках методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы Biosource (Бельгия).
Проточная цитометрия (FACS-анализ)
Определение экспрессии поверхностных маркеров мононуклеаров и ДК проводили при помощи моноклональных антител (Caltag Laboratories, USA) против соответствующих антигенов. Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с 1 %-ной фетальной телячьей сывороткой (ФТС) и окрашивали FITC (флю-оресциинизотиоционат) и PE (фикоэритрин) мечеными антителами согласно инструкции производителя. Отмы-
вали 2 раза холодным ФСБ с 1% ФТС. Клетки фиксировали ФСБ, содержащим 1 % пароформальдегида. Результаты учитывали на проточном цитометре FacsCali-Ьиг (фирмы ВеСоп Бкйшоп,США) с15 мВт 488 арго-ионным лазерным и 585/42 (ЕЬ2) дискриминационным фильтром. На МЛ исследовались уровни экспрессии дифференцировочных антигенов СБ3, СБ4, СБ8, N£1.1; активационных антигенов СБ25, молекул МНС. В качестве изотипического контроля использовали крысиные ^01 и ^02.
Статистическая обработка материала проведена при помощи программного пакета WINMDI 2.8.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование субпопуляционного состава МЛ селезенки мышей после парентерального и сублингвального введения галавита выявили качественно сходные изменения. При этом отмечалось увеличение экспрессии на мембранах МЛ активационных молекул (CD25) и антигенов ЫК (N£1.1). Содержание в популяции МЛ клеток, экспрессирующих Т-клеточные дифференциро-вочные антигены (CD3, CD4, CD8) и молекулы антигенной презентации (МСН), не отличалось от контрольной серии (см. таблицу и рис. 1). Хотя сублингвальная форма в меньшей степени влияла на увеличение в популяции МЛ CD25+-клеток и НК, тем не менее эти изменения были достоверными по сравнению с интакными особями.
Сублингвальное и внутрибрюшинное введение га-лавита приводит к повышению уровня ГБЫ-у, ТОТ-а, 1Ь-1р, ГЬ-12 (рис. 2). При этом в наибольшей степени по сравнению с контрольной серией повышается уровень ГЬ-1р (с 20,8±3,2 пг/мл у интактных животных до 44,8±4,8 пг/мл и 44,8±2,9 пг/мл при в/бр и сублингвальном введении галавита соответственно; р<0,05) и ТОТ-а (с 13,3±2,1 пг/мл у интактных животных до 28,7±3,1 пг/мл и 24,3±3,2 пг/мл при в/бр и сублингвальном введении галавита соответственно; р<0,05). Кроме того, отмечается очевидная тенденция к увеличению сывороточных концентраций ШЫ-у и ГЬ-12 у мышей, получавших галавит, по сравнению с животными контрольной группы.
Уровни экспрессии поверхностных маркеров МЛ селезенок мышей линии СВА при воздействии инъекционной и сублингвальной форм галавита
МЛ селезенки CD3 CD4 CD8 NK CD25 MHC I MHC II
Интакные особи 45,6±3,5 30,2±2,5 4,3±0,4 1,5±0,3 5,4±0,3 12,3±0,1 12,2±0,2
Галавит инъекционная форма 48,3±5,2 23,7±3,8 7,3±0,5 22,3±3,8* 29,5±3,4* 13,2±0,5 15,7±1,3
Галавит сублингвальная форма 46,2±5,3 26,7±2,0 7,3±0,5 16,3±2,0* 22,2±4,6* 12,2±1,5 14,7±2,4
*Статистически значимые различия (р<0,05) по ^критерию Стьюдента для сопряженных пар признаков по сравнению с МЛ интактных мышей
ЛЕКАРСТВЕННАЯ ТЕРАПИЯ
57
Рис. 1. Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул МЛ селезенок мышей линии СВА после воздействия сублингвальной формы галавита:
Верхний ряд, дотплот (популяция МЛ в очерченной области);
левый пик - аутофлюоресценция клеток при использовании изотипического контроля, правый - флюоресценция (ЕГТС - флюоресциинизотиоционат и ЯРЕ фикоэритрин) после окрашивания соответствующими антителами.
По оси ординат - количество клеток;
по оси абсцисс - интенсивность флюоресценции.
CD — дифференцировочные антигены;
МНС I, II — молекулы главного комплекса гистосовместимости I и II классов.
Полученные данные свидетельствуют о том, что сублингвальная форма препарата галавит оказывает иммуномодулирующее действие, сходное с таковым при воздействии инъекционной формы препарата. Изменение субпопуляционного состава МЛ селезенки
Рис. 2. Концентрации сывороточных цитокинов у мышей при воздействии инъекционной и сублингвальной форм галавита:
по оси ординат - концентрация цитокинов (пг/мл); по оси абсцисс: контроль - контрольная группа; в/бр - внутрибрюшинное введение инъекционной формы галавита, сублингв. - введение сублингвальной формы галавита.
мышеи, получавших галавит, характеризуется прежде всего увеличением содержания NK и повышением количества активированных клеток, экспрессирующих рецептор к IL-2 (CD25). Следует отметить, что в данных условиях в ответ на воздеиствие галавита регистрируется изолированное повышение CD25+-клеток без увеличения уровня экспрессии дифференцировочного антигена CD4+. Эти данные позволяют предположить, что в рассматриваемых условиях галавит, вероятно, не приводит к увеличению супрессорнои субпопуляции лимфоцитов (CD25+/CD4+). Представленные материалы согласуются с высказанными ранее предположениями о способности галавита оказывать опосредованное влияние на NK. Исследования спектра цитокинов при применении галавита позволили установить, что по характеру изменения концентрации этих регуляторных пептидов деиствие сублингвальнои формы препарата не отличается от инъекционной. Сублингвальная форма галавита, так же, как инъекционная, достоверно повышает уровень TNF-a и IL-ip в сыворотке крови животных, что соответствует полученным ранее данным [5] о влиянии изучаемого препарата на продукцию провоспа-лительных цитокинов макрофагами. Кроме того, показано увеличение концентрации IL-12, что может быть связано с усилением секреции этого цитокина дендритными клетками. Тенденция к повышению IFN-y, вероятно, обусловлена активацией NK цитокинами, продуцируемыми макрофагами и дендритными клетками.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, сублингвальная и инъекционная формы галавита оказывают сходное иммуномодулирующее действие в опытах in vivo, проявляющееся в увеличении содержания NK и активированных CD25+-лимфоцитов в популяции МЛ, а также в повышении уровня сывороточных провоспалительных и регуляторных цитокинов (IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-12).
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышникова М.А., Орлова О.Л., Шпрах З.С. Разработка новой лекарственной формы галавита в виде сублингвальных таблеток // РБЖ. - 2006. - Т. 5, № 1. - С. 86-90.
2. Барышникова М.А., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Киселевский М.В. Влияние сублингвальной формы галавита на иммунофенотип и функциональную активность иммунокомпетентных клеток мышей // РБЖ. - 2006. - Т. 5, № 4. - С. 43-6.
3. Галавит в эксперименте и клинике / Под ред. М.Т. Абидова. - М., 1999. - 60 с.
4. Добрица В. П., Ботерашвили Н.М., Добрица Е.В. Современные иммуномодуляторы для клинического применения / Руководство для врачей. - СПб.: Политехника. - С. 164-5.
5. Донцов В.И., Подколзин А.А. Галавит - новый иммуномодулятор с биоактивирующим и реге-
нерирующим эффектом // Ежегодник Национального геронтологического центра. - 2001. - Вып. 4. - С. 70-80.
6. Дудка В.Ю. Опыт применения препарата «Галавит» в терапии урогенитальной герпетической инфекции // ГУЗ «Городской кожно-венерологический диспансер», Материалы XXXVII научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей. - СПб, 2002.
7. Коробкова Л.И., Вельшер Л.З., Германов А.Б. и др. Роль иммуномодулятора Галавит в онкологической и хирургической практике // РБЖ. - 2004. - Т. 3, № 3. - С. 87-92.
8. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Вторичные иммунодефициты: клиника, диагностика, лечение // Иммунология. - 1999. - № 2. - С. 14-7.
Поступила 23.11.2006.
