CC BY
86
медицшшы иммунология Оригинальные статьи
©2002, СПбРОРААКИ
ИММУННЫЙ ОТВЕТ ПРИ ОСТРОМ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗЕ У ДЕТЕЙ
Железникова Г.Ф., Иванова В.В., Васякина Л.И., Монахова Н.Е., Попова Н.А., Павленко М.А., Железова Л.И., Бехтерева М.К., Тихомирова О.В.
Научно-исследовательский институт детских инфекций М3 России, Санкт-Петербург * Институт цитологии РАН России, Санкт-Петербург
Резюме. У 27 детей с острым псевдотуберкулезом выделили три клинические формы болезни: скарлатиноподобную, комбинированную и генерализованную. Сравнили фенотипический состав лимфоцитов крови, сывороточный уровень TNF-a, IFN-y, IL-4, IL-6, IgM, IgA, IgG, IgE у детей с разными формами псевдотуберкулеза. Кроме того, оценили экспрессию апоптоза (по числу CD95+ клеток и уровню спонтанного апоптоза лимфоцитов в культуре) в зависимости от формы болезни. Полученные результаты позволили заключить, что иммунный ответ при псевдотуберкулезе осуществляется с участием обеих форм иммунной защиты - клеточной и гуморальной, с некоторыми отличиями баланса Thl/Th2 при разных формах. Готовность лимфоцитов к апоптозу нарастает по мере генерализации процесса.
Ключевые слова: иммунитет, апоптоз, цитокины, инфекция.
Zheleznikova G.F., Ivanova V.V., Vasjakina L.I., Monachova N.E., Popova N. A.,
Pavlenko M.A., Zhelezova L.I., Bechtereva M.K., Tichomirova О. V.
IMMUNE RESPONSE IN CHILDREN WITH ACUTE PSEUDOTUBERCULOSIS
Abstract. Three clinical forms of acute pseudotuberculosis were differentiated in a group of 27 children: scarlet fever-like, combined, generalizated. We compared the peripheral blood lymphocyte phenotypes, the serum levels of TNF-a, IFN-y, IL-4, IL-6, and total IgM, IgA, IgG, IgE levels in children with different pseudotuberculosis forms. Moreover, we studied the incubation-induced apoptosis of lymphocytes in different forms of the disease. The obtained results allowed us to conclude that host defence in pseudotuberculosis is provided by both cell-mediated and humoral immune responses. The Thl/Th2-type response balances were different in three clinical forms of the disease. The CD95+ lymphocyte amount and the susceptibility of lymphocytes to incubation-induced apoptosis increased in proportion with generalization of the process. (MedJmmunoL, 2002, vol.4, N1, pp 45-58)
Введение водит в общих чертах патогенез иерсиниозов у чело-
Известны три вида иерсиний, вызывающих забо- века и поэтому открывает обнадеживающие перспек-
левания у человека: Yersinia pestis - возбудитель чумы, Yersinia pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулеза и Yersinia enterocolitica - возбудитель
тивы его изучения [28].
Все 3 патогенные для человека иерсинии обладают тропизмом к лимфоидной ткани и общей плаз-
кишечного иерсиниоза. Иммунопатогенез иерсини- мидой вирулентности, которая кодирует ряд факторов вирулентности, способствующих выживанию и размножению иерсиний в лимфоидной ткани раз-
озов у человека изучен крайне недостаточно, что обусловлено трудностями этиологической диагнос-
тики и полиморфностью клинических проявлений личных органов [23, 29, 36]. Среди этих факторов
инфекций. Считают, что экспериментальная инфек- выделены липопротеин, белки теплового шока (Ьзр
ция у грызунов (мыши, крысы, кролики) воспроиз- 6°)’ протеины наружной мембраны, в том числе груп-
_______________________________________________ па (не менее И) белков (Уорэ), секретируемых при
Адрес для переписки: интимном контакте иерсиний с эукариотическими
197022, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 9, мишенями. При этом бактерии остаются на поверх-
НИИ детских инфекций М3 России, ности клетки, а УорБ транслоцируются через клеточ-
Железниковой Галине Федоровне НуЮ мембрану с помощью специального секреторно-
Тел.: (095) 234-90-06, го аппарата (Уэс), включающего, в свою очередь, не
факс: (095) 234-96-91 менее 25 белков, кодируемых той же плазмидой [23].
Если клеткой-мишенью является профессиональный фагоцит, то внедрение Yops ведет к потере его функциональной активности и способствует внеклеточному сохранению иерсиний. Так, на экспериментальной модели иерсиниоза показано, что иерсинии в пейеровых бляшках зараженных животных локализованы, в основном, вне клеток, так как местные нейтрофилы не способны к их фагоцитозу [28].
Однако энтеропатогенные иерсинии (К pseudotuberculosis и Y.enterocolitica) способны активно проникать в клетку-мишень с помощью специального белка 103 KDa-инвазина, который прочно связывается с Р-интегринами клеток хозяина [18]. Таким образом, иерсинии могут быть локализованы в инфицированном организме как вне-, так и внутрикле-точно, что обусловливает сложность иммунопатогенеза данной группы заболеваний.
Yops обладают активностью различных ферментов (протеинкиназы, тирозинфосфатазы), благодаря чему эти белки способны модулировать активность клеток иммунной системы, нарушая механизмы естественного и приобретенного иммунитета [18, 45]. Показано, например, что кратковременная экспозиция с Y. pseudotuberculosis нарушает способность Т- и В-лимфоцитов к активации через рецепторы для антигена. Это проявляется в угнетении секреции цитокинов Т-клетками и экспрессии костимулятор-ной молекулы В7.2 В-лимфоцитами. Установлено, что иммуносупрессивный эффект иерсиний обусловлен белком Yop Н, обладающим активностью тирозинфосфатазы [45].
С другой стороны, инвазин энтеропатогенных иерсиний является комитогеном для Т-клеток и активатором В-лимфоцитов через связывание с Р-ин-тегринами на их поверхности [18]. Инвазин Y. pseudotuberculosis служит хемотаксическим фактором для нормальных Т-лимфоцитов человека, а также усиливает их миграцию по направлению к фибронектину и коллагену типа W [18]. Поскольку инвазин Y.pseudotuberculosis слабо экспрессируется в кишечном тракте при температуре 37°С, его представление иммунокомпетентным клеткам не происходит, в связи с чем антительный ответ против ин-вазина не индуцируется. Это показано как в эксперименте на мышах, инфицированных per os вирулентным штаммом Y. pseudotuberculosis, так и при иммунологическом обследовании больных псевдотуберкулезом [25].
В состав клеточной мембраны Y. pseudotuberculosis входит липополисахарид (LPS), которому придают важную роль в патогенезе инфекции [8]. В эксперименте на инбредных мышах установлено, что резистентность к Y. pseudotuberculosis ассоциирована с высоким антительным ответом против LPS возбудителя. Кроме того, показаны разнообразные иммуномодулирующие эффекты LPS в опытах in vivo и in vitro [8].
В последние годы активно изучается роль программированной клеточной гибели (апоптоза) в механизмах физиологического иммунного ответа и в развитии иммунопатологии [7, 13, 14, 16]. Являясь необходимым механизмом ограничения иммунного ответа на поздних его стадиях, апоптоз активированных Т-клеток в начальной фазе инфекции может послужить причиной неэффективности иммунного ответа и неконтролируемого размножения возбудителя [17]. Экспрессия Fas происходит в течение 24 часов после активации Т-клеток, но чувствительными к Fas-зэвисимому апоптозу они становятся только через несколько дней [14]. В условиях гиперактивации антигеном готовность к апоптозу проявляют прежде всего цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), в том числе CD4+Thl и CD8+ Т-клетки [17].
Программированная гибель Thl - индукторов иммунного воспаления, обладающего не только защитным, но и сильным повреждающим эффектом, в ряде ситуаций биологически целесообразна, так как предохраняет организм хозяина от развития патологии в органах-мишенях [13,14,17]. Апоптоз при иммунном ответе может изменять баланс Thl-Th2, способствуя делеции клона одного из фенотипов и тем самым экспансии конкурирующего клона [13,14,16]. В эксперименте на мышах установлено, что ранняя экспозиция Т-клеток с IL-4 ингибирует их активацию и способность к продукции аутокринного ростового фактора - IL-2, причем эффект IL-4 оказался Fas-зависимым [33].
Известно, что ТЫ и Th2 обладают различной чувствительностью к апоптозным сигналам [22,40,46]. Индукция Fas(CD95) в CD4 Т-лимфоцитах опосредована секрецией IFN-y и TNF-a и приводит к апоптозу в отсутствие IL-2 и IL-4 [39]. IL-2 защищает от апоптоза ТЫ, а IL-4 предотвращает апоптоз Th2 [14]. Однако Т-клетки, продуцирующие IL-4 (Th2), значительно более резистентны к активационному апоптозу, чем Т-клетки, продуцирующие IFN-y (Thl) [22]. Именно Thl, но не Th2 in vitro подвергаются быстрому апоптозу, опосредованному Fas/FasL взаимодействием [46]. Эти различия связаны с неодинаковой экспрессией Thl и Th2 Fas-лиганда и анти-апоптозной молекулы Вс1-2 [22, 40].
Кроме CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, несущих Fas(CD95) на поверхности клеточной мембраны, апоптозу могут подвергаться и В-лимфоциты, снабженные рецептором апоптоза CD95 и являющиеся мишенью для CD4+ или CD8+ ЦТЛ [7, 14]. Однако В-лимфоциты, активированные через В-клеточный рецептор для антигена, предохраняются от гибели через апоптоз и сохраняют свои функции [42]. Таким образом, погибают в основном В-клетки, неспецифически стимулированные в ходе иммунного ответа молекулами межклеточного взаимодействия или цитокинами [42]. Этот механизм Т-клеточного контроля пролиферации В-лимфоцитов особенно
важен в ответе на внедрение инфекционных агентов, так как поликлональную активацию лимфоцитов вызывают суперантигены многих микроорганизмов, к которым может быть причислен LPS Y.pseudo-tuberculosis [8].
Интерпретация роли апоптоза в иммунопатогенезе инфекционных заболеваний сложна, так как, наряду с активационным апоптозом клеток иммунной системы, опосредованным взаимодействием Fas(CD95)/ FasL, или апоптозом, индуцированным TNF-a при связывании его с рецептором II типа на клетках-мишенях, в инфицированном организме осуществляется апоп-тоз отдельных видов клеток, индуцированный непосредственно антигенами возбудителя [7,14].
В экспериментах на мышах, зараженных патогенными для человека иерсиниями, показано, что иер-синии вызывают апоптоз макрофагов мезентериальных лимфоузлов и селезенки, что коррелирует с угнетением продукции TNF-a и IL-8 факторами вирулентности - Yops. Это ведет к редукции воспалительного ответа и способствует диссеминации возбудителя [23,32]. Установлено, что LPS грамотрицатель-ных бактерий (к которым относятся и иерсинии) вызывает in vitro апоптоз макрофагов человека, разнонаправленно регулируемый различными цитоки-нами [20].
В многочисленных экспериментах на мышах твердо установлено, что в иммунном ответе на внедрение энтеропатогенных иерсиний ведущую роль играют Т-лимфоциты и активированные ими макрофаги [19, 28]. Однако результаты экспериментов на животных разного вида противоречивы в отношении оценки протективной роли Thl и Th2, а также продуцируемых ими цитокинов [19,28,35,38,43].
Роль мононуклеарных фагоцитов в патогенезе внутриклеточных бактериальных инфекций двойственна, так как, с одной стороны, они предоставляют для внутриклеточно персистирующих бактерий наилучшее обиталище, укрывающее их от губительного воздействия гуморальных факторов защиты, но с другой - моноциты-макрофаги служат главными эффекторами защиты при инфекциях этого типа [30]. Основными механизмами уничтожения бактерий, персистирующих в макрофагах, являются: генерация активных кислородных и азотных радикалов, ограничение содержания железа в клетке, необходимого для размножения бактерий, закисление фагосом и слияние фагосом с лизосомами [30]. Большинство из этих механизмов начинает функционировать только в результате активации макрофагов, которая достигается при воздействии на них IFN-y [12, 30]. Кроме того, разрушая бактерии и процессируя их антигены, макрофаги представляют бактериальные пептиды в комплексе с молекулами МНС I или II класса Т-лимфоцитам, соответственно CD8+ или CD4+ фенотипов. При этом инфицированные макрофаги сами становятся мишенью для ЦТЛ.
Гибель инфицированных макрофагов может происходить в результате нарушения целостности мембраны перфоринами ЦТЛ или ЕК, цитолиза и некроза [14]. При этом высвобождаются неповрежденные бактерии, что способствует их диссеминации [30]. Кроме того, цитолиз ведет к повреждению окружающих тканей и индукции воспаления продуктами лизированных клеток. Более предпочтительным для хозяина является апоптоз инфицированных макрофагов, который не вызывает столь нежелательных последствий и, к тому же, сопровождается снижением выживаемости персистирующих в макрофагах бактерий [37].
В нейтрофилах фагоцитоз иерсиний имеет незавершенный характер, и при их разрушении жизнеспособные бактерии высвобождаются во внеклеточное пространство, что также способствует генерализации процесса. С другой стороны, в очагах воспаления вследствие распада ядерного вещества лейкоцитов накапливается фракция ядерного гистона НЗ, оказывающего бактерицидное действие на Y.pseudotuberculosis [2].
При генерализованном псевдотуберкулезе в лимфоузлах и внутренних органах формируются гранулемы, напоминающие по морфологической структуре очаги продуктивного воспаления при туберкулезе, что и дало название этой инфекции. Образование гранулем, состоящих в основном из мононукле-аров, характерно для внутриклеточных бактериальных инфекций и представляет собой форму локального иммунного ответа, в котором самое непосредственное участие принимают активированные Т-лимфоциты и макрофаги [30].
В основе разнообразия клинических форм инфекции у больных псевдотуберкулезом могут лежать как вариации вирулентности отдельных штаммов Y. pseudotuberculosis [10], так и генетически обусловленные особенности иммунного ответа на различные антигены возбудителя [8]. Показано, в частности, что рецидивирующее течение псевдотуберкулеза ассоциировано с низким антительным ответом к иммуно-доминантному белку (26 kDa) наружной клеточной мембраны Y. pseudotuberculosis [9].
Несмотря на общепризнанную роль цитокинов в регуляции антигенспецифической иммунной защиты и индукции реакций воспаления в инфицированных тканях и органах [12], цитокиновый профиль ответа у больных псевдотуберкулезом, по нашим сведениям, не изучался. Остается также неясной роль апоптоза клеток иммунной системы в иммунном ответе и в патогенезе тяжелых форм псевдотуберкулеза.
Цель настоящего исследования состояла в сравнительной оценке процессов активации и апоптоза у детей с разными клиническими формами острого иерсиниоза, вызванного Y. pseudotuberculosis.
Материалы и методы
Под наблюдением находились 27 детей в возрасте от 5 до 14 лет с острым псевдотуберкулезом, поступивших в стационар в течение первой недели от начала заболевания.
Этиологическая диагностика псевдотуберкулеза проводилась в бактериологической лаборатории НИИДИ (зав. д.м.н. Кветная А.С.) по обнаружению диагностического титра антител (АТ) к У. pseudotuberculosis в реакции агглютинации с корпускулярным диагностикумом производства ИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург).
Иммунологическое обследование включало подсчет общего числа лейкоцитов и их разновидностей, выделение и фенотипирование лимфоцитов с помощью панели моноклональных антител производства НПЦ “Медбиоспектр” (Москва) в лимфоцитотоксическом тесте [6]. Концентрации IgM, IgA, IgG в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии по Manchini с применением моноспецифических антисывороток Нижегородского предприятия по производству бакпрепаратов. Уровень общего IgE в сыворотке крови устанавливали с помощью иммуно-ферментной тест-системы производства ТОО “По-лигност” (Санкт-Петербург). Содержание цитоки-нов TNF-a, IFN-y, IL-4, IL-6 в сыворотке крови, а также IL-2 в надосадках 72-часовых культур цельной крови, стимулированных фитогемагглютини-ном (ФГА) (“Difco”) в концентрации 10 мкг/мл, определяли с помощью иммуноферментных тест-систем производства ООО “Протеиновый контур” и ООО “Цитокин” (Санкт-Петербург).
Оценку спонтанного апоптоза in vitro осуществляли по методу [27]. Взвесь мононуклеаров получали центрифугированием стерильной венозной крови в градиенте плотности урографина 1,079 (“Schering”, Германия), доводили до концентрации 2х106/мл и инкубировали в круглодонных 96-лу-ночных планшетах в среде 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (“Sigma”, США) и антибиотиков при 37°С в атмосфере с 5% СО . Число погибших клеток в свежевыделенных мононуклеарах через 48 или 72 часа культивирования определяли по поглощению 0,06% раствора трипанового синего. Для подсчета числа клеток с признаками апоптоза (конденсацией или фрагментацией ядра) взвесь мононуклеаров фиксировали на стекле 70% этиловым спиртом, высушивали и красили в течение 30 мин раствором ядерного флюоресцентного красителя propidium iodide (“Sigma”) в концентрации 1 мг/мл, содержащим РНКазу К (“Sigma”) в концентрации 100 ед/мл. Клетки с признаками апоптоза подсчитывали в люминесцентном микроскопе “Axioskop” при длине волны возбуждения 546 нм и длине волны пропускания 590 нм.
Детей обследовали дважды: в острой фазе (первая неделя от начала заболевания) и в фазе ранней реконвалесценции (2-3-я неделя болезни). Была обследована также группа здоровых детей (п=10) соответствующего возраста.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием стандартной прикладной программы Microsoft Excel 7.0 for Windows 98. Оценку достоверности различий долей в сравниваемых выборках определяли методом “ф” [11].
Результаты
Клинические формы острого псевдотуберкулеза
По выраженности общей интоксикации и степени поражения внутренних органов и систем были выделены три клинические формы псевдотуберкулеза - скарлатиноподобная (8 детей), комбинированная (11 детей) и генерализованная (8 детей).
Скарлатиноподобная форма характеризовалась симптомами общей интоксикации, лихорадкой, скарлатиноподобной экзантемой, поражением ротоглотки (ангина), лимфопролиферативным синдромом. Комбинированная форма представляла собой сочетание скарлатиноподобной формы с гастроинтестинальным, абдоминальным, артралгическим синдромами и гепатитом. Генерализованная форма характеризовалась тяжелой общей интоксикацией, высокой и длительной лихорадкой, скарлатиноподобной экзантемой с геморрагическим компонентом, ангиной, максимально выраженными и длительно сохраняющимися проявлениями лимфопролиферативного синдрома, терминального илеита или псевдотуберкулезного мезаденита (синдром правой подвздошной области), паренхиматозного гепатита, поражением мочевыводящих путей. У 5 детей с генерализованной формой наблюдали менингоэнцефа-лический синдром. Сравнительные характеристики основных клинических проявлений псевдотуберкулеза при трех его формах суммированы в таблице 1.
Из представленных данных отчетливо явствует значительное нарастание тяжести клинических проявлений псевдотуберкулеза от наиболее легкой - скарлатиноподобной формы до наиболее тяжелой - генерализованной. Эта тенденция, помимо прочего, легко прослеживается при сравнении степени вовлечения в процесс такого жизненно важного органа, как печень. Только у 2 детей со скарлатиноподобной формой наблюдали незначительное увеличение печени (до 1,5 см ниже реберной дуги), без проявления цитолиза гепатоцитов по уровню аланинаминотрансферазы (АЛТ). У 7 детей с комбинированной формой наблюдали более выраженное увеличение печени - до 3,5 см ниже реберной дуги и диагностировали гепатит по нарастанию уровня АЛТ до 120 ед/л (при “норме” до 50 ед/л). У
Табл.1. ВЫРАЖЕННОСТЬ КЛИНИЧЕСКИХ СИМПТОМОВ ПРИ ТРЕХ ФОРМАХ ОСТРОГО ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ
№ группы:
Показатель 1 Скарлатиноподобная (п=8) 2 Комбинированная (п=11) 3 Генерализованная (п=8) Р
Максимальная температура тела, °С 38,01 ±0,11 38,19*0,15 39,26±0,13 1-3<0,001 2-3<0,001
Длительность лихорадки в днях 5,6±1,2 6,2±0,8 10,5±1,1 1-ЗС0.01 2-3<0,01
Частота симптомов; п(%): артралгии 1(12,5) 10(90,9) 8(100) 8 8 О О V V см со 1 1
миалгии 1(12,5) 7(63,6) 7(87,5) 1-2<0,05 1-ЗС0.001
синдром гастроэнтерита 2(25,0) 8(72,7) 5(62,5) 1-2<0,05 1-2<0,05
абдоминальный болевой синдром 1(12,5) 6(54,5) 8(100) 1-3<0,001 2-3<0,001
увеличение печени 2(25,0) 7(63,6) 8(100) 1-3<0,001 2-3<0,01
увеличение селезенки 0(0) 2(8,2) 6(75,0) 1-3<0,001 2-3<0,01
поражение мочевыводящих путей 0(0) 2(18,2) 5(62,5) 1-ЗС0.001 2-3<0,05
всех 8 детей с генерализованной формой отмечали значительное увеличение печени - до 5,5 см ниже реберной дуги, при этом уровень АЛТ в крови достигал 240 ед/л. Следовательно, биохимически подтвержденный гепатит диагностировали только у части детей с комбинированной формой псевдотуберкулеза и у всех детей с генерализованной формой инфекции. Лечение детей, независимо от формы болезни, включало курсы антибиотикотерапии и, при необходимости, симптоматические средства в виде нестероидных противовоспалительных препаратов.
Популяционный состав лейкоцитов и лимфоцитов крот в динамике острого псевдотуберкулеза
В соответствии с наибольшей общей тяжестью инфекционного процесса в острой фазе генерализованной формы наблюдали наиболее выраженный лейкоцитоз (10,9±0,8 против 5,6±1,6 х10а/л у здоровых детей, р<0,01 и против 6,5±0,7 у детей с комбинированной формой, р<0,001). Одновременно только у детей с генерализованной формой инфекции отметили относительную лимфопению (34,6±0,5%
против 41,1 ± 1,0% у здоровых, р<0,05). Характерным для псевдотуберкулеза в целом было увеличение циркулирующего пула эозинофилов, с максимальной выраженностью у детей с генерализованной формой инфекции (6,7±1,2% против 2,0±0,5% у здоровых, р<0,01 и против 4,1±0,3% у детей со скарлатиноподобной формой, р<0,05).
Кроме того, в острой фазе псевдотуберкулеза мы отметили у большинства детей тенденцию к моноцитопении, которая в наибольшей степени была выражена при относительно легкой скарлатиноподобной форме (2,9±0,4% против 6,5±1,2% у здоровых, р<0,05). Моноцитопения усугублялась в периоде ранней реконвалесценции (1,9±0,4% при скарлатиноподобной форме; 0,6±0,2% при комбинированной и 0,8±0,2% при генерализованной, против б,5±1,2% у здоровых, р<0,01 во всех случаях).
Фенотипический состав лимфоцитов крови в острой фазе болезни представлен в табл. 2. Только у детей с генерализованной формой наблюдали существенное снижение общего числа Т-лимфоцитов (СОЗ+) и С04+ Т-лимфоцитов, при, напротив, по-
вышении числа CD8+ Т-клеток относительно “нормы”. При генерализованной форме имела место некоторая мобилизация циркулирующего пула естественных киллеров (ЕК, CD16+) по сравнению с более легкой скарлатиноподобной формой. Относительное содержание В-лимфоцитов (CD20+) и клеток с маркерами активации CD25 и CD95 у детей с псевдотуберкулезом было достоверно более высоким, чем у здоровых детей, однако различия этих показателей при сравнении форм болезни были разнонаправленными. Так, максимальная мо-
билизация пула В-лимфоцитов крови наблюдалась при генерализованной форме инфекции, тогда как количество лимфоцитов, экспрессирующих рецептор для 1Ь-2 (С025 ), у детей этой группы было, наоборот, относительно низким.
Для ориентировочной оценки соотношения процессов активации и апоптоза лимфоцитов мы ввели коэффициент СБ25/СВ95, отражающий относительную экспрессию маркеров “позитивной” (СБ25) и “негативной” (СБ95) активации [13]. Особый интерес представляет сравнение экспрессии рецепто-
Табл. 2. ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПРИ РАЗНЫХ ФОРМАХ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА
№гр п CD3+, % CD4+, % CD8+, % CD16+,% CD20+, % CD25+, % CD95+, % ШІШ
острая фаза болезни
1 8 52,8±1,1 41,3±1,5 20,5+1,2 15,2±0,9 31,3±1,0* 33,8±1,2* 36,2±1,3* 0,93
2 11 51,2±1,9 40,8±1,8 21,4+1,8 16,8±0,8 32,0±1,5* 31,7±1,4* 42,2±1,8* 0,75
3 8 40,9±2,0* 35,5±1,4* 26,5±1,0* 18,9±1,2 40,2±1,2* 28,8+1,5* 49,5±1,5* 0,58
Р 1-3 <0,001 <0,05 <0,01 <0,05 <0,001 <0,05 <0,001
2-3 <0,05 <0,05 <0,05 <0,001 <0,01
К 10 57,3±3,0 45,5±1,9 21,2±1,8 15,5±1,8 23,5±2,5 18,8±1,8 22,2±1,6 0,85
фаза ранней реконвалесценции
1 8 51,2±0,8 42,7±1,2 19,5±1,4 14,5±0,7 34,3±1,1* 31,5±1,5* 30,5±1,0 ★ ★★ 1,03
2 11 50,1 ±0,9 41,2±0,9 21,2±0,8 15,0±0,5 34,8±0,7* 28,5±1,1* 33,4±0,9 * ★* 0,85
3 8 48,4±1,2 ★ ★★ 40,3±1,3 22,9±1,1 16,1±1,0 36,3±1,2* 35,2±1,2 * 36,5+1,4 ★ ★* 0,96
Р 1-3 <0,01
2-3 <0,001
Примечания: 1 - скарлатиноподобная форма, 2- комбинированная, 3- генерализованная; *- отличие от К (здоровые дети) достоверно при р по крайней мере <0,05; **- отличие от показателя в острой фазе достоверно при р по крайней мере <0,05; # 25/95 - коэффициент соотношения CD25/CD95, по средним данным
Табл.З. СПОНТАННЫЙ АПОПТОЗ МОНОНУКЛЕАРОВ КРОВИ in vitro У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗОМ
Форма болезни п Общее число погибших клеток, % (окраска трипановым синим) Число апоптозных клеток, % (окраска PI)
0 час. # 48 час. 72 час. 48 час. 72 час.
острая фаза болезни
Скарлатиноподобная 5 7,6+0,2* 37,3±1,2* 45,3±2,3* 32,7±1,5* 39,2±1,4*
Генерализованная 5 9,2+0,4* 46,3+3,2* 53,1 ±2,1* 42,5±1,9* 50,8±2,6*
Р <0,01 <0,05 <0,05 <0,01 <0,01
Здоровые дети 5 2,0±1,0 15,0±2,0 18,6±1,5 8,5±1,4 12,2±2,4
фаза ранней реконвалесценции
Скарлатиноподобная 5 4,2±0,4** 32,2±1,6** * 38,5±2,7* 29,2±1,4* 33,8±1,5** *
Генерализованная 5 4,4±0,5** 38,4±1,7** * 47,6±0,9** * 33,5±1,5** * 40,2±2,3** *
Р <0,05 =0,01 <0,05
Примечания: # - свежевыделенные мононуклеары, PI - propidium iodide. Остальные обозначения те же, что и в табл.2.
Табл. 4. КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИТОКИНОВ (ПГ/МЛ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И IL-2 in vitro'J ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗОМ
№ гр. п TNF-a IFN-y IL-4 IFN-y/IL-4 IL-6 IL-2#
острая фаза болезни
1 8 248±35* 89±32 * СМ СМ -н со CD 0,45 87±27 1,29±0,21*
2 11 389±17* 413±12* 88±17 4,7 62+10 1,25±0,11*
3 8 563+24* 985+35* 586+31* 1,7 102±15 1,05+0,10
Р 1-2 <0,001 <0,001 <0,001
1-3 <0,001 <0,001 <0,001
2-3 <0,001 <0,001 <0,001 <0,05
К 10 124±33 92±24 67+28 1,4 59+27 0,66+0,20
фаза ранней реконвалесценции
1 8 142+28** 100+15 85+16** 1,2 62+18 1,08±0,13
2 11 249±14* ** 312±25* ** 109±17 2,9 54+7 0,94±0,08**
3 8 412±21* ** 859+24* ** 415±18* ** 2,1 110+14 1,36±0,13*
P 1-2 <0,001 <0,001
1-3 <0,001 <0,001 <0,001
2-3 <0,001 <0,001 <0,001 <0,01 <0,05
Примечания: 1- скарлатиноподобная форма, 2 - комбинированная, 3 - генерализованная; # - И-2 (ед.опт.пл.) в супернатанте 72-часовых культур цельной крови с добавлением ФГА в конечной концентрации 10 мкг/мл. Остальные обозначения те же, что в табл. 2.
ра апоптоза СБ95 у детей с разными клиническими формами псевдотуберкулеза. Количество клеток, готовых к апоптозу через взаимодействие Ра5(С095)/Ра8Ь, в острой фазе псевдотуберкулеза постепенно нарастало параллельно усугублению общей тяжести инфекционного процесса от скарлатиноподобной к генерализованной форме инфекции. Соответственно этому коэффициент С025/СВ95, рассчитанный по средним данным, снижался в том же порядке (см. табл.2).
В фазе ранней реконвалесценции различия между тремя группами детей с псевдотуберкулезом по числу СОЗ+, СБ4+, С08+, СБ16+ и СБ20+ лимфоцитов сглаживались, хотя % В-лимфоцитов (С020+) оставался существенно более высоким, чем у здоровых детей. Значительно выше “нормы” было также содержание активированных клеток среди лимфоцитов крови. При этом мы наблюдали у детей с генерализованной формой псевдотуберкулеза достоверное увеличение числа лимфоцитов, экспрессирующих 11.-211 (С025) и, напротив, снижение числа СБ95+ клеток по сравнению с острой фазой, с восстановлением “нормального” баланса С025/С095. Несмотря на все еще повышенное содержание С095т клеток относительно “контрольного” уровня, при всех клинических формах псевдотуберкулеза в периоде реконвалесценции имело место существенное (р<0,05) снижение экспрессии данного маркера по сравнению с острым периодом. Однако и в фазе ранней реконвалесценции сохранялись описанные выше различия между формами болезни, с превышением числа С095" лимфоцитов при генерализованной форме по сравнению со скарлатиноподобной (р<0,01).
Спонтанный апоптоз
при псевдотуберкулезе у детей
Наиболее информативным методом оценки апоптоза в инфицированном организме считают определение спонтанного (без дополнительной активации) апоптоза в культуре [21, 24, 27]. Мы сравнили жизнеспособность свежевыделенных мононуклеаров, а также число клеток, подвергающихся спонтанному апоптозу в культуре, у детей с относительно легкой скарлатиноподобной формой инфекции и детей с наиболее тяжелой генерализованной формой псевдотуберкулеза (табл.З). Следует отметить, что моно-нуклеары больных детей обнаруживали повышенную готовность к гибели (в сравнении с клетками здоровых детей) уже в результате самой процедуры выделения взвеси, в прямой зависимости от тяжести болезни. Спонтанная гибель клеток через 48 и 72 часа культивирования в кондиционной среде также значительно превышала “контрольный” уровень в большей степени у детей с генерализованной формой инфекции, чем с относительно легкой скарлатиноподобной формой. При этом основная масса клеток подвергалась апоптозу, о чем свидетельствует число (%) мононуклеаров с морфологическими признаками апоптоза при окраске ядерным красителем propidium iodide.
В фазе ранней реконвалесценции жизнеспособность свежевыделенных мононуклеаров существенно увеличивалась почти до уровня у здоровых детей. Спонтанная гибель клеток при культивировании оставалась высокой, но намечалась тенденция к нивелированию различий между двумя группами больных детей и по состоянию свежевыделенных лим-
фоцитов, и по числу клеток с признаками апоптоза в 48-часовой культуре.
Цитокиновый ответ при разных клинических формах псевдотуберкулеза
У детей с тяжелой генерализованной формой псевдотуберкулеза мы наблюдали системную гиперпродукцию ТОТ-а, 1РЫ-у и 1Ь-4, превышающую уровень у здоровых детей в 5-10 раз (табл.4). Концентрации в крови провоспалительных цитокинов ТЫР-а и 1РК-у в острой фазе нарастали параллельно усугублению тяжести клинических проявлений инфекции - от скарлатиноподобной к генерализованной форме, с сохранением тех же соотношений и в фазе ранней реконвалесценции. В то же время антивос-палительный цитокин 1Ь-4, а также 1Ь-6, обладающий как про-, так и антивоспалительными свойствами [12], менее всего были представлены в циркуляции у детей с комбинированной формой псевдотуберкулеза.
Патогенетическое значение имеет не столько факт усиления или снижения продукции отдельных цитокинов, сколько соотношение оппозитных пулов -провоспалительных и антивоспалительных цитокинов [15]. Исходя из этих соображений, мы рассчитали коэффициент соотношения уровней П^Ы-у и 1Ь-4, который используют для ориентировочной оценки баланса ТЫ/ТЬ2 [34]. В острой фазе болезни соотношение 1РМ-у/1Ь-4 оказалось наименьшим при скарлатиноподобной форме, а наибольшим - при комбинированной. В то же время соотношение цитокинов ТЫ/ТЬ2 у детей с генерализованной формой оставалось относительно близким к “нормальному” (у здоровых детей). В периоде ранней рекон-
валесценции у детей со скарлатиноподобной и комбинированной формами инфекции проявилась тенденция к нормализации баланса IFN-y/IL-4, тогда как у детей с генерализованной формой соотношение IFN-y/IL-4 не претерпело существенных изменений.
Пи при одной из форм псевдотуберкулеза мы не обнаружили статистически значимой (в сравнении с уровнем у здоровых детей) активации синтеза in vivo IL-6, хотя содержание этого цитокина при генерализованной форме в обе фазы болезни было существенно выше, чем при комбинированной.
Дети со скарлатиноподобной формой в острой фазе инфекции имели повышенный (относительно “нормы”) уровень лишь двух из изученных цитокинов - TNF-a и IL-4. Концентрации их возвращались к “нормальным” значениям в фазе ранней реконвалесценции. У детей с комбинированной формой уровни TNF-a и IFN-y, высокие в острой фазе, хотя и значительно снижались в динамике болезни, но оставались повышенными относительно “нормы” и в периоде клинического выздоровления. Генерализованная форма псевдотуберкулеза характеризовалась экстремально высокими концентрациями в крови не только IFN-y (цитокина Thl типа), но и IL-4 (цитокина Th2), как в острой фазе, так и (несмотря на статистически существенное снижение) в фазе ранней реконвалесценции.
Параллельно с усилением системного цитокино-вого ответа, у детей с генерализованной формой в острой фазе болезни отмечалась тенденция к снижению способности активированных Т-лимфоцитов к продукции IL-2 in vitro. В этой группе мы не обнару-
Табл.5. ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗОМ
№ гр. п СГТ AT# IgM, г/л |дА, г/л IgG, г/л ІдЕ, кЕ/л
Острая фаза болезни
1 8 2,36±0,05 1,32±0,08 1,26±0,09 9,76+0,10 142±18
2 11 2,10±0,06 1,18±0,10 0,95±0,15 9,12±0,25 192±11 *
3 8 1,58±0,03 1,54±0,08 1,28±0,18 10,28±0,15 403±18*
Р 1-2 <0,01 <0,05
1-3 <0,001 <0,05 <0,001
2-3 <0,001 <0,01 <0,001 <0,001
К 10 н.д. 1,29±0,08 1,18±0,11 9,38±0,50 100±32
Фаза ранней реконвалесценции
1 8 2,45±0,04 1,28+0,10 1,17±0,18 9,55±0,32 128±19
2 11 2,52±0,05** 1,08±0,05 0,90±0,18 8,89±0,24 90±24**
3 8 2,69±0,03** 1,52±0,12 1,24±0,15 9,82+0,15 252±11* **
Р 1-3 <0,001 <0,001
2-3 <0,01 <0,01 <0,01 <0,001
Примечания: # СГТ АТ — среднегеометрический титр антител к У.рэеисМиЬегси^з, в обратных логарифмах;
1 - скарлатиноподобная форма, 2 - комбинированная, 3 - генерализованная; н.д. - нет данных. Остальные обозначения те же, что в табл. 2.
жили достоверной активации синтеза IL-2 по сравнению с “контрольным” уровнем, тогда как у детей с комбинированной и скарлатиноподобной формами активация IL-2-продуцирующих клеток была статистически существенной. Однако в периоде ранней реконвалесценции соотношения между группами больных по способности к синтезу IL-2 in vitro изменились: у детей с генерализованной формой, но не с комбинированной или скарлатиноподобной, наблюдали позднюю активацию продукции IL-2 Т-лимфо-цитами, что сочеталось, как указано выше, с увеличением числа 1Ь-2Ы-несущих (CD25) клеток среди лимфоцитов крови (см. табл.2).
Обнаруженные особенности фенотипического спектра лимфоцитов крови, уровня спонтанного апоптоза и продукции цитокинов при разных клинических формах псевдотуберкулеза предполагают различия иммунного ответа у детей сравниваемых групп в отношении выраженности двух основных форм иммунной защиты - клеточной и гуморальной.
Реакции гуморального иммунитета при разных клинических формах псевдотуберкулеза
Среднегеометрические титры АТ к Y.pseudotuberculosis, а также содержание в сыворотке крови общих IgM, IgG и IgE в динамике болезни представлены в таблице 5. В острой фазе инфекции обнаружены существенные различия уровня антигенспеци-фического антителообразования у детей, переносящих разные клинические формы псевдотуберкулеза. Наиболее высоким антительный ответ был у детей с относительно легкой скарлатиноподобной формой инфекции, а самым низким - у детей с тяжелой генерализованной формой болезни.
Клиническое выздоровление происходило параллельно с накоплением АТ против возбудителя инфекции, особенно интенсивным у детей с тяжелой генерализованной формой. Так, коэффициент накопления АТ к периоду ранней реконвалесценции относительно острого периода, рассчитанный по средним данным, составлял 1,0 - 1,2 - 1,7 при скарлатиноподобной, комбинированной и генерализованной формах соответственно. Это свидетельствует о выраженной активации гуморальной формы иммунной защиты при генерализованной форме псевдотуберкулеза.
Стимуляция гуморального иммунитета уже в острой фазе болезни проявлялась в усилении продукции поликлональных IgM, IgG и, особенно, IgE (см. табл.5) у детей с генерализованной формой псевдотуберкулеза. При этом концентрации IgM и IgG в обе фазы болезни были достоверно выше, чем у детей с комбинированной формой, а уровень общего IgE, по средним данным, в 2-3 раза превышал значения показателя в двух других группах больных и в 4 раза (острая фаза) - значения у здоровых детей.
Примерно двукратное снижение уровня общего IgE в периоде ранней реконвалесценции свидетельствует о том, что активация синтеза IgE у детей с комбинированной и генерализованной формами осуществлялась в рамках иммунного ответа при данной инфекции. Мы не обнаружили существенных различий содержания IgA в зависимости от формы псевдотуберкулеза.
Обсуждение
Клинические формы псевдотуберкулеза у детей (скарлатиноподобная, комбинированная, генерализованная), выделенные по интенсивности общей интоксикации и выраженности отдельных симптомов, отражающих вовлечение в процесс различных органов и систем, в целом характеризуются нарастанием генерализации инфекции вследствие диссеми-нации Y.pseudotuberculosis в организме хозяина. Причинами различий степени распространенности возбудителя в организме могут быть как особая вирулентность отдельных штаммов иерсиний [10], так и индивидуальные различия резистентности к Y.pseudotuberculosis, в том числе генетически обусловленные [8,19,28].
Поскольку в отдельных регионах циркулирует, в основном, один штамм Y.pseudotuberculosis, обладающий определенным набором факторов вирулентности [10], мы полагаем, что различия тяжести инфекционного процесса у обследованных нами детей
- жителей Санкт-Петербурга - имеют в основе неодинаковую врожденную резистентность к Y.pseudotuberculosis с формированием на начальных этапах инфекции разных уровней бактериальной нагрузки (load).
Тяжесть клинических проявлений псевдотуберкулеза, по представленным данным, ассоциирована с отличиями множества параметров иммунной реактивности и их динамики в ходе инфекционного процесса. В целом, иммунологическими критериями генерализации в острой фазе инфекции могут быть следующие параметры: выраженность лейкоцитоза, относительной лимфопении, эозинофилии, снижение в составе циркулирующего пула лимфоцитов числа Т-клеток фенотипа CD3+, CD4\ CD25+ и, наоборот, повышение доли CD8+, CD16+, CD20+, CD95+ лимфоцитов, гиперпродукция цитокинов с выбросом в кровь больших количеств TNF-a, IFN-y, IL-4, относительно низкая (на уровне значений у здоровых детей) способность Т-клеток к синтезу IL-2 in vitro, значительная активация синтеза общего IgE и умеренная - IgM и IgG.
Сниженный в острой фазе антигенспецифичес-кий антительный ответ также может служить критерием возможной генерализации процесса. Можно предположить, что недостаточность антителообразования в начальной критической фазе иммуно-
генеза является важным патогенетическим фактором генерализации инфекции и развития тяжелых форм псевдотуберкулеза с вовлечением в процесс многих органов и систем. С другой стороны, снижение титров свободных АТ по мере генерализации процесса может быть обусловлено более интенсивным их связыванием в иммунных комплексах с бактериальным антигеном в нарастающей от скарлатиноподобной к генерализованной форме дозе. Выздоровление при генерализованной форме происходило при наиболее интенсивном накоплении АТ, что является свидетельством активации гуморальных механизмов иммунной защиты по мере генерализации инфекции.
Однако при этом у детей с генерализованной формой обнаруживалась гиперпродукция IFN-y и сохранялся практически “нормальный” баланс IFN-y/ IL-4. Дополнительными к CD4+ Thl источниками IFN-y могут быть ЕК, у/5 Т-лимфоциты, CD8+ Т-клетки, не контролируемые Th2 [30]. По-видимому, интенсивная секреция IFN-y как главного медиатора защиты при внутриклеточных инфекциях обеспечивала активное функциональное состояние мо-нонуклеарных фагоцитов и, в синергизме с гуморальными факторами иммунной защиты, приводила к эрадикации патогена с полным клиническим выздоровлением детей с генерализованной формой примерно в те же сроки, что и при менее тяжелых формах инфекции - скарлатиноподобной и комбинированной.
Считают, что экспрессия Fas(CD95) на поверхности Т- и В-лимфоцитов инфицированных лиц отражает уровень их активации in vivo антигенами возбудителя [31]. По данным литературы, у здоровых детей наибольшее число CD95+ клеток регистрируется среди CD4+ Т-лимфоцитов, втрое меньше - среди CD8+ Т-лимфоцитов, примерно столько же среди CD20+ В-лимфоцитов и практически не обнаруживаются среди CD16+ ЕК [31]. Однако в инфицированном организме до 50% CD8+ Т-лимфоцитов могут экспрессировать Fas(CD95) [44].
По представленным нами данным, повышенная спонтанная гибель мононуклеаров в 48- или 72-ча-совой культуре у детей с генерализованной формой псевдотуберкулеза ассоциирована с увеличением числа Fas(CD95)+ клеток среди лимфоцитов крови. Это позволяет предположить, что при данной инфекции реализуются механизмы активационного апоп-тоза, осуществляемые через взаимодействие Fas/ FasL. Возможно, под влиянием избыточных стимулов к активации in vivo часть Т- и В-лимфоцитов, несущих Fas(CD95), приобретали повышенную чувствительность к апоптозным сигналам и подвергались in vitro спонтанному апоптозу. У детей с генерализованной формой псевдотуберкулеза в острой фазе болезни среди лимфоцитов преобладали CD8+ Т-клетки и CD20+ В-клетки, часть из которых мог-
ли экспрессировать CD95 и проявлять повышенную склонность к спонтанной гибели in vitro.
Нельзя исключить также, что среди мононуклеаров детей с генерализованной формой было больше инфицированных клеток, которые являются мишенью для лимфоцитов с цитотоксическими свойствами - CD8+ ЦТЛ и CD16+ ЕК, пул которых повышен именно при этой форме болезни. Клетки-мишени уничтожаются с помощью секретируемых порообра-зующих белков - поринов (перфоринов), при участии Fas- или TNF-a-зависимого апоптоза [12,14]. Однако, при известной тропности к лимфоидной ткани, не доказана персистенция иерсиний в самих лимфоцитах.
Основным местом обитания энтеропатогенных иерсиний являются моноциты-макрофаги. Как указано выше, секретируемые белки наружной мембраны иерсиний (Yops) в эксперименте вызывают апоптоз макрофагов, в ассоциации с угнетением продукции ими TNF-a [23,32]. Неизвестно, участвует ли механизм Yops-индуцированного апоптоза макрофагов в патогенезе иерсиниозов у человека. По нашим данным, наиболее тяжелая генерализованная форма псевдотуберкулеза ассоциирована не с угнетением, а с гиперактивацией продуцентов TNF-a.
Моноцитопению, наиболее выраженную в острой фазе относительно легкой скарлатиноподобной формы, можно рассматривать скорее как результат усиленной миграции моноцитов в очаг размножения возбудителя под влиянием таких цитокинов, как TNF-a, IFN-y, IL-4 и IL-6 [30]. Однако не исключено, что недостаточность пула циркулирующих моноцитов в фазе ранней реконвалесценции, в большей степени выраженная при комбинированной и генерализованной формах инфекции, связана не только с продолжающейся направленной миграцией этих клеток в очаги разрешающегося воспаления, но и с гибелью части инфицированных макрофагов.
По-видимому, ни гиперпродукцию цитокинов, ни повышенную гибель свежевыделенных или культивированных мононуклеаров у детей с генерализованной формой острого псевдотуберкулеза не следует рассматривать как некую иммунологическую катастрофу. Тяжелый инфекционный процесс в результате проведенной этиологической и симптоматической терапии завершался относительно быстрым клиническим выздоровлением, что является действенным критерием адекватности и эффективности не только принятых лечебных мер, но и иммунного ответа, сбалансированности основных его звеньев, включая процессы активации и апоптоза.
Менее благоприятным исходом событий явилось бы развитие затяжных и рецидивирующих форм болезни, столь характерных для бактериальных ин-
фекций с внутриклеточным размножением возбудителя [30] и, в частности, для псевдотуберкулеза [2]. Ранее мы показали, что затяжное течение иерсинио-за (при той же лечебной тактике) ассоциировано с резко сниженным уровнем сывороточного IFN-y [3]. Вероятно, именно недостаточность синтеза IFN-у как главного активатора макрофагов лежит в основе неэффективности иммуногенеза и развития затяжных форм инфекции.
В заключение кратко суммируем особенности иммунного ответа при трех выделенных формах псевдотуберкулеза. Иммунный статус детей при скарлатиноподобной форме, которая не имела клинических признаков генерализации инфекции, в острой фазе характеризовался “нормальным” содержанием среди лимфоцитов крови всех основных субпопуляций (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+), за исключением CD20+ В-лимфоцитов, число которых было увеличено. Количество клеток с маркерами активации CD25 и CD95 было в равной мере повышенным, соотношение CD25/CD95 оставалось близким к показателю у здоровых детей - 0,93 и 0,85 соответственно. Цитокиновый ответ характеризовался умеренно повышенным содержанием в крови TNF-a и IL-4 при “нормальном” содержании IFN-y и IL-6. Т-лимфоци-ты активно продуцировали IL-2 in vitro в ответ на стимуляцию ФГА. Тем не менее, усиление системной продукции IL-4 (соотношение IFN-у/ IL-4=0,45) свидетельствовало о выраженной активации Th2 и гуморальных механизмов иммунного ответа, что согласуется с высокими титрами противоиерсиниоз-ных антител уже в острой фазе болезни.
Частичная генерализация процесса (комбинированная форма) служила дополнительным стимулом клеточной формы ответа, о чем наилучшим образом свидетельствовало значительное (в 5 раз по сравнению со скарлатиноподобной формой) пополнение циркулирующего пула IFN-y (соотношение IFN-y/ IL-4=4,7 vs 0,45 при скарлатиноподобной форме). Концентрации IL-4 и IL-6, напротив, у детей с комбинированной формой были несколько ниже, чем у детей со скарлатиноподобной формой. Некоторое ослабление гуморального звена иммунного ответа иллюстрировали менее интенсивное антителообра-зование в острой фазе и тенденция к снижению синтеза неспецифических IgM, IgA, IgG по сравнению с уровнем при скарлатиноподобной форме, сохранявшаяся и в фазе выздоровления.
Дальнейшая генерализация инфекции (генерализованная форма) сопровождалась нарастающей активацией и клеточного, и гуморального механизмов иммунного ответа под влиянием мощного дополнительного антигенного стимула, исходящего из внеклеточного и внутриклеточного пула иерсиний, персистирующих во множественных вторичных очагах воспаления. О смешанном профиле иммунного ответа при генерализованной форме свиде-
тельствовала одновременная гиперактивация продуцентов цитокинов ТЫ типа (TNF-a, IFN-y) и Th2 типа (IL-4). Лейкоцитарный пул крови, наряду с увеличением доли цитотоксических клеток среди лимфоцитов (CD16+ ЕК и CD8+ ЦТЛ), характеризовался также дополнительной мобилизацией В-лимфоцитов (CD20) и нарастанием эозинофилии
- маркером участия гиперчувствительности немедленного типа в воспалительном ответе [1]. Как известно, мобилизацию и активацию эозинофилов контролирует IL-5 - цитокин Th2, об активации которых при генерализованной форме псевдотуберкулеза можно судить по экстремально высокому содержанию в крови главного медиатора Th2 - IL-
4, достоверному приросту концентраций IgM, IgG и значительному увеличению уровня общего IgE в острой фазе инфекции. Нарастание уровня общего IgE в ходе инфекции считают косвенным признаком экспансии Th2 [26].
Снижение числа CD3+CD4+ Т-лимфоцитов в крови, отмеченное нами только при генерализованной форме инфекции, могло быть связано с их усиленной миграцией в регионарные лимфоузлы и органы-мишени Y.pseudotuberculosis, где эти клетки оказывали необходимую помощь в локальном иммунном ответе. Относительно низкий уровень секреции IL-2 in vitro ФГА-стимулированными Т-лимфоцитами мог быть обусловлен именно уменьшением в циркуляции CD4+ Т-клеток - основных продуцентов IL-2, при нарастании среди Т-лимфоцитов CD8+ клеток, которые интенсивно продуцируют IFN-y, но не IL-2 [12].
Таким образом, о дальнейшей активации клеточного звена при нарастании генерализации инфекции (генерализованная форма псевдотуберкулеза) свидетельствовало значительное увеличение концентраций в крови цитокинов Thl типа - TNF-a и, особенно (более чем в 2 раза по сравнению с уровнем при комбинированной форме), IFN-y. Об одновременной, еще более выраженной, активации Th2 можно было судить по резкому нарастанию в крови уровня IL-4 (в 7 раз по сравнению с комбинированной формой). Отличительной чертой генерализованной формы являлся рост числа лимфоцитов с “негативным” ответом на активацию, несущих рецептор апоптоза CD95. Это ассоциировалось с повышением числа как CD8+ Т-клеток, так и CD20+ В-клеток среди лимфоцитов крови. Возможно, в условиях высокого уровня антигенной стимуляции рост экспрессии CD95 и готовности лимфоцитов к апоптозу направлен на предотвращение поликлональной активации и пролиферации как Т-, так и В-лимфоцитов.
Следует отметить, что повышенная гибель лимфоцитов в культуре (относительно уровня у здоровых детей) наблюдалась и при скарлатиноподобной, и при генерализованной формах псевдотуберкуле-
за, в последнем случае она была лишь более выражена. Из этого можно заключить, что готовность значительной части лимфоцитов крови к апоптозу является характерным феноменом при данной инфекции. При этом фазные изменения апоптоза сравнительно невелики: повышенная экспрессия CD95 и усиленная гибель лимфоцитов в культуре сохранялись и в периоде клинического выздоровления. По-видимому, иммунный ответ при псевдотуберкулезе сопровождается длительной активацией лимфоцитов, с повышением в циркуляции числа как позитивно (CD25+), так и негативно (CD95+) активированных клеток, готовых в дальнейшем к гибели через Fas/FasL взаимодействие. Вероятно, механизм гибели клеток по TNF-зависимому пути также вносит свой вклад в высокий уровень экспрессии апоптоза in vitro, с учетом повышенной продукции этого ци-токина при любой форме псевдотуберкулеза.
Повышенный спонтанный апоптоз лимфоцитов в культуре не является специфической особенностью псевдотуберкулеза. Ранее мы показали сходные уровни спонтанного апоптоза мононуклеаров у детей, переносящих острый инфекционный мононуклеоз, однако с обратными соотношениями между тяжестью инфекции и экспрессией апоптоза [5]. Усиленную гибель лимфоцитов in vitro неоднократно обнаруживали у ВИЧ-инфицированных лиц [21, 24].
По совокупности представленных данных можно заключить, что разрешение острого псевдотуберкулеза у детей требует согласованного участия клеточных и гуморальных механизмов защиты, с определенными вариациями баланса Thl/Th2 при разных клинических формах инфекции. Генерацию ан-тигенспецифических Th2, в дополнение к ТЫ, отмечали неоднократно даже при бактериальных инфекциях с исключительно внутриклеточной локализацией возбудителя (например, при экспериментальном туберкулезе или листериозе у мышей) [30, 34]. По-видимому, протективная роль Th2 и гуморальной формы иммунного ответа значительно возрастает при инфекциях с двойной локализацией бактерий: внутри- и внеклеточной. Псевдотуберкулез принадлежит к инфекциям именно такого типа [2,
18, 23, 28, 29, 43, 45].
Список литературы
1. Беклемишев Н.Д. Т-хелпер 2 - ключевая клетка противометазойного иммунитета и реакции аллергии немедленного типа// Иммунология. - 1995.
- N5. - С.4-8.
2. Беседнова Н.Н., Сомов Г.П. Рецидивы псевдотуберкулеза и их прогнозирование // Эпидемиол. и инфекционные болезни. - 2000. - №2. - С.52-55.
3. Васякина Л.И., Железникова Г.Ф., Иванова В.В., Монахова Н.Е., Павленко М.А., Попова Н.А.,
Бехтерева М.К., Кветная А.С., Железова Л.И. Иммунологические критерии затяжного течения иерси-ниозной инфекции у детей // Медицинская Иммунология. - 2001. - Т.З. - №2. - С.215.
4. Дробков В.И., Маракулин И.В., Погорельский И.П., Дармов И.В., Смирнов Е.В. Спектр антител после введения чувствительным животным бактерий Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis // ЖМЭИ - 1996. - № 2. - С.81-85.
5. Железникова Г.Ф., Васякина Л.И., Монахова Н.Е., Павленко М.А., Новожилова Е.В., Попова Н.А., Родионова О.В. Апоптоз и иммунный ответ у детей с острым инфекционным мононуклеозом // Иммунопатология, аллергология, инфектология - 2000. -№4. - С.87-94.
6. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача.- СПб: ТОО Издательство “Гиппократ”, 1998.- 156 с.
7. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Новые иммуно-патогенетические взгляды: апоптотические иммунодефицита // Иммунология. - 1998. - №6. - С.17-18.
8. Кузнецова Т.А., Беседнова Н.Н. Патогенетическое значение липополисахарида Yersinia pseudotuberculosis //ЖМЭИ - 1997. - №5. - С.37-41.
9. Малов И.В., Шурыгина И.А., Волченко Ю.Е. Анализ антител к белкам наружной клеточной мембраны иерсиний при различном течении псевдотуберкулеза у людей // Тер. архив. - 1994. - Т.66. -№4. - С.62-64.
10. Малов И.В., Марамович А.С., Климов В.Т., Леоненко В.В., Шурыгина И.А., Чеснокова М.В. Некоторые эпидемиологические аспекты и клинико-патогенетическая характеристика псевдотуберкулеза в Восточной Сибири // Патогенетические основы лечения острых инфекционных заболеваний.
- М., 1999. - С.380-383.
11. Плохинский Н.А. Биометрия. - М.: Издательство МУ, 1970.-367 с.
12. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты. Руководство для врачей. - СПб, 1998. - 113 с.
13. Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Апоптоз как важный этап оценки иммунной системы по патогенетическому принципу // Клин. лаб. диагностика. -1997. - №7. - С.31-34.
14. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. - 1996. - №6. - С. 10-22.
15. Ярилин А.А. Система цитокинов и принцип ее функционирования в норме и патологии // Иммунология. - 1997. - №5. - С.7-13.
16. Ярилин А.А., Никонова М.Ф., Ярилина А.А. Литвина М.М., Варфоломеева М.И. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки при клиникоиммунологическом обследовании больных // Медицинская Иммунология. - 2000. - Т.2. - №1. - С.7-16.
17. Alexander-Miller М., Derby М., Sarin A. et al. Supraoptimal peptide-major histocompatibility complex causes a decrease in Bcl-2 levels and allows TNF-aRII-
mediated apoptosis of cytotoxic T-lymphocytes //]■ Exp. Med. - 1998. - Vol. 188. - №8. - P.1391-1399.
18. Arencibia I., Suarez N., Wolf-Watz H., Sundqvist K. Yersinia invasin, a bacterial pi-integrin ligand, is a potent inducer of lymphocyte motility and migration to collagen type W and fibronectin //J. Immunology.
- 1997. - Vol.159. - №4. - P.1853-1859.
19. Autenrieth I„ Beer M., Bohn E., Kaufmann S., Heesemann J. Immune responses to Yersinia enterocolitica in susceptible BALB/c and resistant C57BL/6 mice: an essential role for IFN-y // Infect. Immunity. - 1994. - Vol.62. - №6. - P.2590-2599.
20. Bingisser P., Stey C., Webler M., Groscurth P., Russi E. Apoptosis in human alveolar macrophages is induced by endotoxin and is modulated by cytokines // Amer. J. Res. Cell. Mol. Biol. - 1996. - Vol.15. - №1. -P.64-70.
21. Brugnoni D., Airo P., Timpano S. et al. CD8+CD28- T cells in vertically HIV-infected children // Clin. Exp. Immunol. - 1997. - Vol.109. - №3. -P.412-416.
22. Carbonari M., Tedesco T., Del Porto P., Paganelli R., Fiorilli M. Human T cells with a type-2 cytokine profile are resistant to apoptosis induced by primary activation: consequences for immunopathogenesis // Clin. Exp. Immunol. - 2000. - Vol.120. - №3. - P.454-462.
23. Cornelis G., Boland A., Boyd A., Geuijen C., Iriarte M., Neyt C., Sory M., Stainier I. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome //Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. - Vol.62. - №4. - P.1315-1352.
24. Estaquier J., Idziorek T., Zon W. et al. Th type 1 /Th type 2 cytokines and T cell death: preventive effect of IL-12 on activation-induced and CD95(Fas/APO-l)-mediated apoptosis of CD4+ T cells from HIV-infected persons //J. Exp. Med. - 1995. - Vol.182. -№6. - P.1759-1768.
25. Fortuneau N., Beretti J., Berche P., Simonet M. Lack of antibody response to invasin in human yersiniosis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1994. -Vol.l. - №2. - P.235-237.
26. Galhardo M., Perez M., Morgado M., Almeida S., De Azevedo L., Georg I., Ferreira H., Sarno E. Search for evidence of a Th2 profile in HIV + patients //Int. J. Dermatol. - 2000. - Vol.39. - №2. - P. 109-115.
27. Gorla R., Imberti L., Prain E. et al. Differential priming to programmed cell death of superantigen-reactive lymphocytes of HIV patients // AIDS Res. Human Retrovir. - 1994. - Vol.10. - P.1097-1103.
28. Heeseman J., Gaede K., Autenrieth I. Experimental Yersinia enterocolitica infection in rodents: a model for human yersiniosis // APMIS.-1993.
- Vol.l01.-№6.-P.417-429.
29. Iriarte M., Cornelis G. Molecular determinants of Yersinia pathogenesis // Microbiologia. - 1996. -Vol.12. - №2. - P.267-280.
30. Kaufmann S. Immunity to intracellular bacteria // Annu. Rev. Immunol. - 1993. - Vol.l 1. - P.129-163.
31. Miyawaki T., Uehara R., Nibu R. et al. Differential expression of apoptosis-related Fas antigen on lymphocyte subpopulations in human peripheral blood // J. Immunol. - 1992. - Vol.149. - №11. -P.3753-3758.
32. Monack D., Mecsas J., Bouley D., Falkow S. Yersinia-induced apoptosis in vivo aids in the establishment of a systemic infection of mice // J. Exp. Med. - 1998. - Vol.188. - №11. - P.2127-2137.
33. Morris S., Gause W., Finkelman F. IL-4 suppression of in vivo T cell activation and antibody production //J. Immunol. - 2000. - Vol.164. - №4. -P.1734-1740.
34. Mosmann T., Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Thl, Th2 and more //Immunol. Today.
- 1996. - Vol.17. - P.138-146.
35. Nikolova S., Najdenski H., Wesselinova D., Wesselinova A., Kazatchca D., Neikov P. Immunological and electronmicroscopic studies in pigs infected with Yersinia enterocolitica 03 // Zentralbl. Bakteriol. -1997. - Vol.286. - №4. - P.503-510.
36. Noll A., Roggenkamp A., Heesemann J., Autentrieth I. Protective role for heat shock protein-reactive a/P T cells in murine yersiniosis // Infect. Immun. - 1994. - Vol.62. - №7. - P.2784-2791.
37. Oddo M., Renno T., Attinger A., Bakker T. Fas Ligand-induced apoptosis of infected human macrophages reduces the viability of intracellular Mycobacterium tuberculosis //J. Immunol. - 1998. -Vol.160. - №11. - P.5448-5454.
38. Odinot P., Curfs J., Meis J., Melchers W., Hoogkamp-Korstanje J. Local expression of cytokine mRNA in spleen and Peyer’s patches of rats is involved in resistance against infection with Yersinia enterocolitica // Cytokine. - 1998. - Vol. 10. - №3. -P.206-212.
39. Oyaizu N., McCloskey T., Than S. et al. Cross-linking of CD4 molecules upregulates Fas antigen expression in lymphocytes by inducing IFN-y and TNF-a secretion// Blood. - 1994. - Vol.84. - P.2622-2630.
40. Ramsdell F., Seaman M., Miller R. et al. Differential ability of Thl and Th2 cells to express Fas ligand and to undergo activation-induced cell death // Int. Immunol. - 1994. - Vol.6. - P. 1545-1558.
41. Rojas M., Barrera L., Puzo G., Garcia L. Differential induction of apoptosis by virulent Me. tuberculosis in resistant and susceptible murine macrophages // J. Immunol. - 1997. - Vol.159. - №3. -P.1253-1268.
42. Rothstein T., Wang J., Panka D. et al. Protection against Fas-dependent Thl-mediated apoptosis by antigen receptor engagement in B-cells // Nature. -1995. - Vol.374. - P.163-165.
43. Sukura A., Higgins J., Pedersen N. Compartmentalization of Thl/Th2 cytokine responses to experimental Yersinia pseudotuberculosis infection in cats // Vet. Immunol. Immunopathol. - 1998. -Vol.65. - №2-4. - P.139-150.
44. Tanner J., Alfieri C. Epstein-Barr virus induces Fas(CD95) in T-cells and Fas ligand in B-cells leading to T-cell apoptosis // Blood. - 1999. - Vol.94. - №10. -P.3439-3447.
45. Yao Т., Mecsas J., Healy J., Falkow S., Chien Y. Suppression of T and В lymphocyte activation by a Yersinia pseudotuberculosis virulence factor, yopH //J. Exp. Med. - 1999. - Vol.190. - №9. - P.1343-1350.
46. Zhang X., Brunner Т., Carter L. et al. Unequal death in T helper cell (Th) 1 and Th2 effectors: Th 1, but not Th2, effectors undergo rapid Fas/FasL-mediated apoptosis//J. Exp. Med.-1997.-Vol.185.-P. 1837-1843.
поступила в редакцию 03.07.2001 принята к печати 18.10.2001
