CC BY
79
КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© коллектив авторов, 2015
удк 616.832-004.2-08:615.361.8-013.3]-078.33
Зафранская М.М.1, Нижегородова Д.Б.1, Юркевич М.Ю.1, Борисов А.В.2, Кривенко С.И.3, Иванчик Г.И.1, Кулинич С.С.1, Федулов А.С.2
иммунологический мониторинг пациентов с рассеянным склерозом после аутологичной трансплантации мезенхимальных стволовых клеток
1ГУО Белорусская медицинская академия последипломного образования, 220013, Минск, Республика Беларусь, 2УО Белорусский государственный медицинский университет, 220016, Минск, Республика Беларусь, 3УЗ «9-я ГКБ г. Минска», 220016, Минск, Республика Беларусь
Отсутствие эффективных протоколов лечения рассеянного склероза (РС), направленных на селективное подавление аутореактивных клонов Т-лимфоцитов и восстановление поврежденных участков ЦНС, объясняет все возрастающий интерес исследователей к использованию иммуномодулирующих и нейропротективных свойств мезенхимальных стволовых клеток (МСК). В статье предложен методологический подход к оценке иммуномоду-лирующего действия клеточной терапии у пациентов с РС после аутологичной трансплантации МСК, основанный на определении миелин-стимулированной пролиферации Т-лимфоцитов и изменении поверхностного фенотипа клеток. Показано, что динамика функционального состояния клеток по отношению к миелин-специфическому антигену и экспрессия маркеров CD119 и CD45RO на клеточной мембране Т-лимфоцитов у пациентов с РС после клеточной терапии позволяет установить взаимосвязь между определяемым эффектами МСК in vitro и in vivo. Внутривенное введение аутологичных МСК пациентам с РС приводит к 9-12-му месяцу посттрансплантационного периода к снижению количества циркулирующих Т-клеток-памяти и супрессии миелин-стимулированной пролиферации Т-лимфоцитов. При этом у пациентов с РС после аутологичной трансплантации МСК не происходит выраженного ингибирования функционального состояния Т-лимфоцитов на неспецифическую стимуляцию, что проявляется в низких коэффициентах супрессии митоген-индуцированной пролиферации в течение года после терапии. Определена прогностическая ценность in vitro модели совместного культивирования МСК и лимфоцитов и иммунологических маркеров для оценки in vivo иммуномодулирующего действия клеточной терапии у пациентов с РС с использованием коэффициентов МСК-медиированной супрессии миелин-индуцированной пролиферации Т-лимфоцитов.
Ключевые слова: рассеянный склероз; мезенхимальные стволовые клетки; аутологичная трансплантация; им-муномодуляция.
Для цитирования: Иммунология. 2015; 36 (5): 284-289.
Zafranskaya М.М.1, Nizheharodava D.B.1, Yurkevich M.Yu.1, Borisov A.V.2, Krivenko S.I.3, Ivanchik H.I.1, Kulinich S.S.1, Fedulov A.S.2
IMMUNOLOGICAL MONITORING OF MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS AFTER AUTOLOGOUS MESENCHYMAL STEM CELL TRANSPLANTATION
'Belarussian Medical Academy of Post-Graduate Education, 220013, Minsk, Republic of Belarus, 2Belarusian State Medical University, 220016, Minsk, Republic of Belarus, 3Minsk city Hospital № 9, 220016, Minsk, Republic of Belarus
The absence of protocols for multiple sclerosis effective treatment aimed at autoreactive T-lymphocytes selective suppression and damaged CNS sites repair explains the increasing research interest to immunomodulatory and neuroprotective properties of mesenchymal stem cells (MSC). In this article, the methodological approach based on myelin-stimulated T cells proliferation and cell phenotype changes is proposed for assessing the immunomodulatory effects of cell therapy in MS patients after autologous MSC transplantation. It has been shown that the dynamics of T-lymphocytes functional state to myelin-specific antigen and the expression of CD119 and CD45RO markers on cellular membrane of T-lymphocytes in MS patients after autologous MSC transplantation make it possible to establish the correlation between in vitro and in vivo measured effects of MSC. The predictive value of in vitro model of lymphocytes and MSC cocultivation and immunological markers has been determined for assessing the in vivo immunomodulatory effect of cell therapy in MS patients using the index of MSC suppression of myelin-induced T cells proliferation.
In MS patients after autologous MSC transplantation, there was no marked inhibition of T-lymphocytes functional state on non-specific stimulation that is evidenced by low mitogen-induced proliferation suppression indices within one year after therapy. The intravenous administration of autologous MSC to MS patients resulted in reduced number of circulating memory T cells and suppressed myelin-stimulated T cells proliferation within the 9lh-12lh month after transplantation that evidence the antiproliferative MSC action and, in addition, characterize in vivo immunomodulatory effects of cell therapy in MS.
Keywords: multiple sclerosis; mesenchymal stem cells; autologous transplantation; immunomodulation.
citation: Immunologiya. 2015; 36 (5): 284-289.
Для корреспонденции: Зафранская Марина Михайловна, [email protected] For correspondence: Zafranskaya Marina Mikhaylovna, [email protected]
Рассеянный склероз (РС) рассматривается как аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС) с выраженными воспалительным, миелин- и аксон-дегенеративным компонентами, характеризующееся нарушением баланса между регуляторными и потенциально миелин-реактивными клонами Т-лимфоцитов [1, 2]. Отсутствие эффективных протоколов лечения РС, направленных на селективное подавление аутореактивных клонов Т-лимфоцитов и восстановление поврежденных участков ЦНС, объясняет все возрастающий интерес исследователей к использованию иммуномодулиру-ющих и нейропротективных свойств мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [4]. МСК представляют собой гетерогенную популяцию постнатальных клеток-предшественников стромального происхождения (мультипотентные мезенхи-мальные стромальные клетки), могут быть выделены из различных тканей организма и наряду с регенеративным потенциалом обладают выраженными как in vitro, так и in vivo иммуномодулирующими свойствами [3-7].
Предварительные результаты стартовавших клинических исследований по применению МСК у пациентов с РС указывают на эффективность и безопасность данного метода лечения [8-10]. Тем не менее успешная демонстрация клеточной терапии при РС возможна только после глубокого изучения и понимания применения МСК и идентификации потенциальных иммунологических маркеров терапевтической эффективности [11, 12].
Одна из целей базисного исследования биологии МСК заключается в создании in vivo и in vitro аналитических систем. При этом несмотря на огромное количество работ, посвященных изучению иммуномодулирующих свойств МСК, отсутствует взаимосвязь между определяемыми эффектами МСК in vitro и их эффектами in vivo, что объясняется отсутствием универсального общепринятого in vitro метода определения потенциального in vivo терапевтического эффекта МСК [5]. Кроме того, при исследовании in vivo иммунный статус определяется множеством эндогенных и экзогенных факторов, что создает проблему оценки функционального состояния отдельных пулов аутореактивных клеток при РС.
Важным этапом патогенетической терапии является разработка критериев оценки иммуномодулирующего действия вводимых клеточных культур на иммунный ответ реципиента. В настоящее время описаны гуморальные и лиганд-рецепторные взаимодействия, опосредующие супрессорный/ регуляторный эффект МСК [7, 13]. В то же время изменения функциональной активности и свойств лимфоцитов после клеточной терапии оценивают по узкому спектру параметров c преимущественным анализом экспрессии активационных маркеров на Т-лимфоцитах и дендритных клетках в ранние сроки посттрансплантационного периода [8, 10]. В связи с этим для оценки in vivo регуляторного эффекта МСК на течение аутоиммунного процесса при РС необходимо создание адекватной in vitro модели МСК-индуцированной иммуно-супрессии с патогенетическим обоснованием иммунологических маркеров, которые позволят оценить иммуномодули-рующий эффект клеточной терапии.
В данной работе предложен методологический подход к оценке иммуномодулирующего действия клеточной терапии у пациентов с РС, основанный на определении миелин-стимулированной пролиферации Т-лимфоцитов и изменении поверхностного фенотипа клеток после аутологичной трансплантации МСК.
Материал и методы
В исследуемую группу включено 12 пациентов с рецидивно-ремиттирующей клинической формой РС. Возраст пациентов (м:ж - 6:6) составил 33,0 (25,5^35,5) года, длительность заболевания - 30,0 (9,5^84,0) мес, степень ин-валидизации по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale) - 2,75 (2,00^3,25) балла. Диагноз PC верифицирован на основании критериев McDonald еt а1 (2010) с постановкой диагноза по МКБ-10 [14]. Аутологичная трансплантация МСК
(АуТМСК) в количестве 1,55 (0,92^2,35) млн/кг пациентам с РС проведена на базе УЗ «9-я ГКБ» г Минска. Пациенты не получали иммуносупрессивного или модулирующего течение заболевания лечения в течение 6 мес до проведения АуТМСК. Базисная нейрометаболическая терапия проводилась 1-2 курсами в течение года. Результаты исследования неврологического статуса, показателей нейровизуализации и оптической когерентной томографии после АуТМСК свидетельствовали о стабилизации процесса у пациентов с РС в течение 12 мес посттрансплантационного периода [15].
Мониторинг иммунологических показателей у пациентов с РС проводился на 10-е сутки, а также через 1, 3, 6, 9 и 12 мес после терапии.
Выделение мононуклеаров из периферической венозной крови и пунктата костного мозга. Мононуклеары выделяли путем центрифугирования периферической крови и пункта-та костного мозга на градиенте плотности (Histopaque-1077, Sigma, Германия). Полученные кольца мононуклеаров дважды отмывали в фосфатном буфере (PBS, Gibco, Германия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Hyclone, Великобритания). Мононуклеары костного мозга использовали для получения ранних пассажей МСК.
Культивирование МСК костного мозга. Мононуклеары костного мозга ресуспендировали в среде DMEM (Gibco, Германия) с добавлением 10% ЭТС, 1% антибиотика и 1% L-глутамина, засевали в концентрации 1440-1563 тыс. клеток/см2 в стерильные пластиковые флаконы и культивировали в увлажненной атмосфере с 5% СО2 при 37oC. Через 24 ч и далее каждые 3-4 сут проводили смену культуральной среды. По достижении культурами 70-80% конфлюэнтности клетки снимали с поверхности пластика трипсином/ЭДТА ("Gibco", Германия) и пересевали для получения ранних пассажей [16]. Для микроскопии и мониторинга культур использовали инвертированный микроскоп Axiovert 200 и камеру AxioCamMRm с выдержкой 100 мс (CarlZeiss, Германия).
Совместное культивирование мононуклеаров периферической крови c МСК. Мононуклеары периферической крови (МПК) пациентов с РС, предварительно окрашенные 7 цМ карбоксифлуоресцеином (CFSE, Sigma, Германия), культивировали в концентрации 2*105 клеток/лунку 96-луночного планшета в среде RPMI-1640 c 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 1% антибиотика, 10% ЭТС с добавлением 2,5 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА, Sigma, Германия) или 10 мкг/мл рекомбинантного миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (рМОГ1-125, ГУ «РНПЦ Трансфузиологии и медицинских биотехнологий», Минск, Республика Беларусь) в присутствии МСК в соотношении МПК:МСК - 10:1 в течение 6 дней (при стимуляции ФГА) и 10 дней (при стимуляции рМОГ1-125) в увлажненной атмосфере с 5% СО2 при 37oC. На 6-й день культивирования осуществляли замену половины культуральной среды с добавлением ИЛ-2 (R&DSystems, США) в конечной концентрации 10 U/мл [17].
Проточная цитофлуориметрия. Регистрация пролиферации Т-лимфоцитов, предварительно окрашенных CFSE осуществлялась на 6-й и 10-й дни культивирования с использованием моноклональных антител СD3-PC7, CD45RO-ECD, CD119-PE (BeckmanCoulter, США, R&D, Канада). Пролиферацию лимфоцитов оценивали как процент неподелившихся CFSEhigh и поделившихся CFSElow Т-клеток.
Для оценки фенотипа МПК использовали моноклональ-ные антитела CD3-PC7, CD4-FITC/PE, CD8-PC5, CD45RO-ECD, CD119-PE (BeckmanCoulter, США, R&D, Канада). Измерения осуществляли на 5-канальном проточном цито-флуориметре FC500 («BeckmanCoulter", США). Результат регистрировали на 50 000 событий в пробе.
Статистический анализ. Для характеристики исследуемых групп использовались показатели медианы и интерквар-тильного интервала Me (25^75). Сравнение 2-х групп и определение статистически значимых различий осуществлялось непараметрическим критерием Вилкоксона. Связь между двумя переменными оценивали по коэффициенту ранговой корреляции Спирмена (R) Различия признавались значимы-
ми при р < 0,05. Диагностическую ценность метода определяли путем построения ROC-кривых с оценкой площади под кривой и 95% доверительного интервала, AUROC (95% CI). Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ Statistica 8.0 и MedCalc 12.5.0.0.
Результаты и обсуждение
Основываясь на разработанном ранее подходе оценки in vitro иммуносупрессивных свойств МСК пациентов с РС, лимфоциты периферической крови, стимулированные неспецифическим митогеном ФГА и специфическим миелиновым антигеном рМОГ1-125, предварительно культивировались с аутологичными МСК с последующим расчетом коэффициента супрессии пролиферации Т-лимфоцитов клеточными культурами [18].
На рис. 1 представлены типичные оригинальные гистограммы цитофлуориметрического анализа пролиферации Т-лимфоцитов периферической крови при митоген- (верхняя панель) и миелин-индуцированной (нижняя панель) стимуляции в присутствии и отсутствии аутологичных культур МСК пациентов с РС до проведения АуТМСК. Добавление МСК в культуру клеток снижало in vitro пролиферацию как ФГА-, так и рМОГ-стимулированных Т-лимфоцитов, выражавшуюся в уменьшении количества поделившихся CFSElow клеток при культивировании.
Для характеристики степени выраженности ингибирую-щего влияния МСК на пролиферацию Т-клеток предложена формула расчета коэффициента супрессии пролиферативно-го ответа k (%):
ПТп+МСК ■ 100
к = 100--,
ПТп
где ПТп+МСК - количество поделившихся Т-лимфоцитов в ко-культуре МПК и МСК, стимулированных митогеном/ан-тигеном, %; ПТп - количество поделившихся Т-лимфоцитов, стимулированных митогеном/антигеном, % [18].
Коэффициенты супрессии (к) пролиферации Т-лим-фоцитов при in vitro исследовании варьировали от 20,0 до 80,0% и медианы составили 39,1 (23,9^52,9)% при стимуляции ФГА и 52,2 (20,9^59,5)% при стимуляции рМОГ1-125 соответственно.
При этом наряду с уменьшением количества поделившихся клеток в присутствии МСК наблюдалось изменение фенотипа Т-лимфоцитов. Добавление МСК в культуру митоген/миелин-стимулированных лимфоцитов пациентов с РС приводило к статистически значимому снижению экспрессии одного из маркеров клеток-памяти CD45RO, наиболее выраженное в популяции CD3+4+45RO+ клеток, наряду с увеличением количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD119 (табл. 1).
Рис. 1. Количество поделившихся GFSElow Т-лимфоцитов при ми-тоген- (а) и миелин- (б) индуцированной пролиферации в присутствии и отсутствии аутологичных МСК.
Примечание. ФГА - пролиферация Т-лимфоцитов при культивировании с ФГА; ФГА + МСК - пролиферация Т-лимфоцитов при культивировании с ФГА в присутствии аутологичных МСК; рМОГ - пролиферация Т-лимфоцитов при культивировании с рМОГ; рМОГ + МСК - пролиферация Т-лимфоцитов при культивировании с рМОГ в присутствии аутологичных МСК.
Ведущая роль в развитии РС отводится миелин-специфическим CD3+CD4+ Thl-лимфоцитам, а также ци-тотоксическим CD3+CD8+ T-лимфоцитам с фенотипом клеток-памяти (CD45RO+) [19, 20]. В связи с этим популяция Т-клеток-памяти рассматривается как мишень для патогенетического лечения РС, основанного на иммуносупрессии или индукции толерантности, в том числе опосредованного и МСК [4, 21]. Полученные данные позволили в дальнейшем использовать фенотип CD45RO+ Т-лимфоцитов для характеристики функциональных свойств эффекторных CD4+ и CD8+ Т-клеток-памяти как in vitro, так и in vivo. CD119 представляет собой внеклеточный домен a-цепи рецептора IFNy
Таблица 1
Фенотипическая характеристика митоген/миелин-стимулированных субпопуляций Т-лимфоцитов пациентов с рс при культивировании с аутологичными МсК и в их отсутствие, %
Фенотип Тип клеточной культуры (n = 12)
Т-лимфоцитов ФИ Фт + МСК рМOГ рМOГ + МСК р
СD3+45RO+ 74,3 (64,1+79,4) 48,4 (35,5+61,9) 58,1 (48,9+68,0)
GD4+45RO+ 69,5 (66,1+78,0) 41,1 (32,1+58,9) 60,7 (53,9+74,4)
GD8+45RO+ 77,6 (70,5+85,0) 50,0 (36,3+67,7) 37,4 (30,4+45,6)
СD3+119+ 42,6 (32,5+56,4) 66,9 (50,9+76,9) 37,7 (33,7+48,5)
GD4+119+ 38,3 (30,3+40,8) 66,7 (42,7+76,5) 32,8 (28,7+38,5)
GD8+119+ 25,0 (16,5+48,3) 46,8 (36,3+59,0) 25,2 (18,8+34,3)
48,0 (39,5+60,4)
55,7 (39,3+63,8)
35,5 (16,5+50,0) 62,4 (45,8+74,1)
56,4 (51,8+82,0)
40,3 (29,5+50,5)
р1-2 =
рз-4
Р1-2 =
РЗ-4
Р1-2 = р1-2
РЗ-4 р1-2 РЗ-4 р1-2
РЗ-4 =
0,002 = 0,04 0,002 = 0,03 0,002 0,002 = 0,01 0,002 = 0,02 0,002 0,013
Таблица 2
Динамика количества Т-клеток-памяти и CD119-позитивных Т-лимфоцитов в периферической крови пациентов с рс после АуТМсК (п = 12), %
Фенотип лим- До лечения Период наблюдения после АуТМСК
фоцитов 10 дней 1 мес 3 мес 6 мес 9 мес 1 год Р
CD3+45RO+ 28,1 24,0 27,0 27,0 25,7 23,1 23,3
22,6+37,6 18,6+36,9 20,5+39,6 16,5+32,4 20,6+34,8 19,2+31,6 15,1+35,4 р1-2 = 0,028 Р1-2 = 0,047 р1-7 = 0,017
CD4+45RO+ 32,9 29,1 30,3 31,8 31,1 27,8 30,7 р1-2 = 0,025
27,0+45,1 22,8+41,5 23,5+45,1 19,5+40,0 22,7+43,3 22,9+42,4 19,0+45,0 р1-3 = 0,008 Р1-4 = 0,034 Р,-5 = 0,023 А_7 = 0,031
CD8+45RO+ 15,5 15,1 15,4 15,5 15,5 13,2 12,9 р16=0,059
12,8+22,9 10,2+24,0 13,5+24,5 8,8+24,3 13,6+21,7 10,0+18,4 9,3+19,1 р1-7 = 0,025
CD3+119+ 65,6 63,8 63,0 67,0 61,0 66,0 68,7
62,9+73,3 48,7+78,1 58,5+73,1 62,1+77,8 51,3+72,2 51,9+77,1 57,9+83,0
CD4+119+ 70,7 68,1 65,5 73,7 63,2 73,4 70,9
62,7+74,0 51,9+82,2 58,4+75,7 59,0+80,9 57,4+73,2 55,1+82,2 61,7+87,5
CD+119+ 58,1 54,2 56,9 62,5 50,4 56,0 60,4
52,1+66,4 45,8+68,0 54,2+63,9 55,1+72,7 37,7+62,0 44,3+72,8 46,8+77,2
(IFNyR1), включающий центр связывания лиганда. Воздействие IFNy, опосредованное через IFNyR, является необходимым условием для проявления иммунорегуляторных свойств МСК [7, 13, 21], а цитокиновые рецепторы являются феноти-пическими маркерами функционального состояния лимфоцитов. Показано, что в процессе ответа на стимуляцию, экспрессия CD119 повышается на этапе G1 клеточного цикла до вступления Т-лимфоцитов в S фазу, а затем снижается при переходе в S и G2/M [22], что может быть сопряжено с ми-тоген/миелин-индуцированной активацией и последующей пролиферацией Т-лимфоцитов.
Экспрессия маркеров на Т-лимфоцитах коррелировала с клеточной пролиферацией. Так, установлены высокая степень корреляционной связи между количеством Т-клеток-памяти и пролиферацией Т-лимфоцитов (r = 0,75;p < 0,001), а также между количеством Т-лимфоцитов, экспрессирую-щих CD119, и пролиферативным ответом клеток (r = -0,65; p < 0,01). Снижение экспрессии CD45RO и повышение cD119 характеризует антипролиферативный эффект МСК. При этом модуляция экспрессии IFNyR1 может также выступать одним из механизмов МСК-зависимой супрессии пролиферации Т-лимфоцитов; CD119 наряду с CD45RO отражает функциональное состояние Т-лимфоцитов и может выступать в качестве дополнительного критерия для иммунологического мониторинга пациентов с РС.
Таким образом, исходя из патогенеза заболевания и возможных механизмов регуляторного действия МСК, для оценки иммуномодулирующего эффекта клеточной терапии у пациентов с РС после АуТМСК предложены следующие показатели: 1 -количество циркулирующих Т-клеток-памяти,
2 - количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD119,
3 - пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в присутствии неспецифического митогена (ФГА) и специфического миелино-вого антигена (рМОГ).
Динамика количества Т-клеток-памяти у пациентов с РС после проведения АуТМСК представлена в табл. 2. У всех пациентов через 10 дней после АуТМСК установлено ста-
АуТМСК дней
б
« 801
АуТМСК дней
Период наблюдений
Рис. 2. Динамика in vitro экспрессии CD119 маркера на CD3+ Т-лимфоцитов (а) и пролиферативного ответа миелин-стимулированных CD3+CD119+ Т-лимфоцитов (б) у пациентов с РС после АуТМСК (n = 12).
Примечание: * - p < 0,05; ** - p < 0,01 по сравнению с показателями до АуТМСК.
о о аз а.
D s J
s ■&
■a
m £
60-
45-
30"
15-
o-
-15-
-30
к pMOr¡nvitro~52'2% т
к ФГА in vitm =39,1%
рМОГ
ФГА
10 дней 1 мес Змее 6 мес 9 мес 12мес Период наблюдения после АуТМСК
Рис. 3. Динамика коэффициентов супрессии k неспецифической (ФГА) и антиген-специфической (рМОГ) пролиферации Т-лимфоцитов у пациентов с РС после АуТМСК (n = 12). Примечание: пунктирными линиями указаны коэффициенты супрессии неспецифической (черная линия) и антиген-специфической (серая линия) пролиферации Т-лимфоцитов у пациентов с РС при in vitro исследовании до проведения АуТМСК.
тистически значимое снижение CD3+45RO+ лимфоцитов за счет, в основном, снижения cD4+45RO+ Т-клеток. Выявленная тенденция сохранялась на протяжении 9-12 мес периода наблюдения.
Количество CDП9-позитивных Т-лимфоцитов в периферической крови пациентов с РС не изменялось на протяжении посттрансплантационного периода по сравнению с количеством клеток до клеточной терапии, что может свидетельствовать об отсутствии общего выраженного ингиби-рующего in vivo влияния МСК на функциональное состояние нестимулированных клеток иммунной системы.
Противоположная картина наблюдалась при анализе динамики изучаемых показателей в условиях in vitro митоген/ миелин-индуцируемой стимуляции лимфоцитов. К 9-му ме-сяду после АуТМСК у пациентов с РС наблюдалась тенденция к увеличению количества Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+119+ (p = 0,07) при культивировании с рМОГ при статистически значимом увеличении анализируемого показателя к 1-му году после трансплантации (рис. 2, а). Наряду с этим к 6-му месяцу после АуТМСК выявлено статистически значимое снижение пролиферации Т-лимфоцитов при стимуляции специфическим антигеном (рис. 2, б). Экспрессия CD119 на Т-лимфоцитах находилась в обратной зависимости от количества поделившихся CD3+119+ клеток (r = -0,44; p < 0,001). Кроме того, к 9-му месяцу после трансплантации установлена
100-1
л
Ti 80-
о
X л 60-
s 40-
m >. 20"
T
0 -
20 40 60 80 Специфичность
100
20 40 60 80 100 Специфичность
Рис. 4. Диагностическая ценность индексов МСК-медиированной супрессии миелин-индуцированной пролиферации CD4+CD45RO+ Т-лимфоцитов in vitro (а), CD3+CD45RO+ через год после трансплантации (б) и CD4+CD45RO+ Т-лимфоцитов через 6 мес после трансплантации (в) в установлении терапевтической эффективности АуТМСК у пациентов с РС (ROC-кривые).
прямая корреляция между количеством СD3+119+лимфоцитов и коэффициентом супрессии к пролиферации СD3+ лимфоцитов при стимуляции рМОГ (r = 0,9; p < 0,05), т. е. более высокая экспрессия СD119 на лимфоцитах ассоциировалась с более выраженной супрессией миелин-специфической пролиферации. Выявленная тенденция характерна как для cD4+, так и, в большей степени, для cD8+ Т-клеток, и сохранялась на протяжении 12 мес периода наблюдения.
Для подтверждения установленного факта индукции МСК-медиированной супрессии проведен анализ коэффициентов супрессии ФГА- и рМОГ-стимулированной пролиферации Т-лимфоцитов у пациентов с РС после АуТМСК. На рис. 3 представлена динамика коэффициентов супрессии митоген/миелин-стимулированной пролиферации по отношению к аналогичным показателям, полученным при предварительном in vitro исследовании. После АуТМСК не наблюдалось выраженного ингибирования неспецифической пролиферации Т-лимфоцитов, характеризующей общее функциональное состояние клеток, что выражалось в низких коэффициентах супрессии в течение 12 мес после терапии, и анализируемый показатель не достигал величины
при in vitro исследовании (к i год = 17,6% кфГА n v¡iro = 39,1%;
р = 0,036 соответственно). Полученные данные подтверждают результаты ряда авторов о том, что МСК не снижают уровень противоинфекционного иммунитета и обладают свойственной пластичностью по отношению к иммунной системе, что зависит от их способности отвечать на агонисты TLR в микроокружении и модифицировать иммуносупрес-сивные свойства, не препятствуя развитию иммунного ответа на определенные возбудители [23, 24].
При анализе коэффициентов супрессии специфической пролиферации Т-лимфоцитов после АуТМСК установлено статистически значимое увеличение коэффициента супрессии к 6-9-му месяцам посттрансплантационного периода до величины к году после трансплантации, полученной при in vitro исследовании (к „„„, „ = 48,5%, k . . = 52,2%;
^ v рМОГ 1 год ' ' рМОГ in vitro ' '
р = 0,61, соответственно), что позволяет предположить об определенном in vivo селективном действии МСК на миелин-стимулированную пролиферацию Т-лимфоцитов.
На рис. 4 представлены графические изображения результатов расчета специфичности и чувствительности использования in vitro и in vivo коэффициентов МСК-медиированной супрессии миелин-индуцированной пролиферации Т-лимфо-цитов и эффективности лечения, критериями которой явились показатели изменения слоя перипапиллярных нервных волокон сетчатки, результаты исследования нейровизуализа-ции и неврологического статуса пациентов после АуТМСК. Качество диагностического/прогностического фактора определялось по величине площади под кривой. Для in vitro коэффициента супрессии рМОГ-индуцированной пролиферации CD4+CD45RO+ Т-лимфоцитов площадь под ROC-кривой составила 0,88 (0,55-0,99), p = 0,001 (рис. е 4, а); для in vivo коэффициента супрессии рМОГ-индуцированной пролиферации -у CD3+CD45RO+ через год после трансплантации - 0,87 (0,46-0,99), p = 0,019 (рис. 4, б) и для in vivo коэффициента супрессии рМОГ-индуцированной пролиферации / CD4+CD45RO+ Т-лимфоцитов через 6 мес / после трансплантации - 0,93 (0,54-0,99), p = 0,0001 (рис. 4, в) и т.д. Специфичность и чувствительность используемых показате-_,_,_г лей варьировала от 67 до 100%, что свидетельствует о высокой диагностической ценности предложенных иммунологических критериев для прогнозирования терапевтической эффективности аутологичной трансплантации МСК у пациентов с РС.
20 40 60 80 Специфичность
100
Выводы
1. Экспрессия GD45RO и количество Т-клеток-памяти, соответственно, а также
cD119 зависят от функционального состояния Т-лимфоцитов и являются маркерами иммуномодулирующего действия МСК. Динамика функционального состояния Т-лимфоцитов по отношению к миелин-специфическому антигену и экспрессия маркеров cD119 и cD45RO на клеточной мембране Т-лимфоцитов у пациентов с РС после АуТМСК позволяет установить взаимосвязь между определяемым эффектами МСК in vitro и их эффектами in vivo.
2. У пациентов с РС после АуТМСК не происходит выраженного ингибирования функционального состояния Т-лимфоцитов на неспецифическую стимуляцию, что проявляется в низких коэффициентах супрессии митоген-индуцированной пролиферации в течение года после терапии.
3. Внутривенное введение аутологичных МСК приводит к 9-12-му месяцу посттрансплантационного периода к снижению количества циркулирующих Т-клеток-памяти и супрессии миелин-стимулированной пролиферации Т-лимфоцитов, что свидетельствует об антипролиферативном действии МСК in vivo и дополнительно характеризует иммуномодули-рующий эффект клеточной терапии при РС.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Республики Беларусь, Грант № 20081618 и № 20112544.
литература
15. Федулов А.С., Борисов А.В., Зафранская М.М., Ионова О.А. Динамика неврологического статуса пациентов с рассеянным склерозом после аутологичной трансплантации мезен-химальных стволовых клеток. Актуальные проблемы и достижения в медицине. Сборник научных трудов по итогам международной межвузовской научно-практической конференции. Самара; 2014: 75-82.
Поступила 18.03.15
references
1. Hafler D., Slavik J., Anderson D., O'Connor K., De Jaqer P., Baecher-Allan C. Multiple sclerosis. Immunol. Rev. 2005; 204: 208-31.
2. Sospedra M., Martin R. Immunology of multiple sclerosis. Annu Rev. Immunol. 2005; 23: 683-747.
3. Darlington P., Boivin M., Bar-Or A. Harnessing the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in multiple sclerosis. Expert Rev. Neurother. 2011; 11 (9): 1295-303.
4. Uccelli A., Zappia E., Benvenuto F., Frassoni F., Mancardi G. Stem cells in inflammatory demyelinating disordes: a dual role for immunosuppression and neuroprotection. Expert Opin. Biol. Ther. 2006; 6: 17-22.
5. Singer N. and Caplan A. Mesenchymal stem cells: mechanisms of inflammation. Annu Rev. Pathol. Mech Dis. 2011; 6: 457-78.
6. Tyndall A. Successes and failures of stem cell transplantation in autoimmune diseases. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2011; 2011: 280-4.
7. Nasef A., Ashammakhi N., Fouillard L. Immunomodulatory effect of mesenchymal stromal cells: possible mechanisms. Regen. Med. 2008; 3 (4): 531-46.
8. Karussis D., Kassis I., Kurkalli B., Slavin S. Immunomodulation and neuroprotection with mesenchymal bone marrow stem cells (MSCs): a proposed treatment for multiple sclerosis and other neuroimmunological/neurodegenerative diseases. J. Neurol. Sci. 2008; 265 (1-2): 131-5.
9. Connick P., Kolappan M., Patani R., Scott M., Crawley C., He X. et al. The mesenchymal stem cells in multiple sclerosis (MSCIMS) trial protocol and baseline cohort characteristics: an open-label pre-test: post-test study with blinded outcome assessments. Trials. 2011; 2: 12-62.
10. Connick P., Kolappan M. Autologiusmesenchymal stem cells for the treatment of secondary progressive multiple sclerosis: an open-label phase 2a proof-of-concept study. Lancet Neurol. 2012; 11 (2): 150-6.
11. Uccelli A., Laroni A., Freedman M. Mesenchymal stem cells as treatment for MS - progress to date. Mult. Scler. 2013; 19 (5): 515-9.
12. Harris V., Sadiq S. Biomarkers of therapeutic response in multiple sclerosis: current status. Mol Diagn. Ther. 2014; 18 (6): 605-17.
13. Newman R., Yoo D., Le Roux M., Danilkovitch-Miagkova A. Treatment of inflammatory diseases with mesenchymal stem cells. Inflamm Allergy Drug Targets. 2009; 8 (2): 110-23.
14. Polman C., Reingold S., Banwell B. Clanet M., Cohen J., Filippi M. et al. Diagnostic criteria for multiple sclerosis: 2010 revisions to the McDonald criteria. Ann. Neurol. 2011; 69 (2): 292-302.
15. Fedulov A.S., Borisov A.V., Zafranskaya M.M., Ionova O.A. Neurological status of patients with multiple sclerosis after autol-ogous transplantation of mesenchymal stem cells. Current issues and advances in medicine. Collection of scientific papers to the international interuniversity scientific and practical conference. [Sbornik nauchnykh trudov po itogam mezhdunarodnoy mezh-vuzovskoy nauchno-prakticheskoy konferentsii]. Samara; 2014: 75-82. (in Russian)
16. Gnecchi M., Melo L. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, characterization, viral transduction, and production of conditioned medium. Methods Mol. Biol. 2009; 482: 281-94.
17. Zafranskaya M., Oschmann P., Engel R., Weishaupt A., van Noort J., Jomaa H. et al. Interferon-beta therapy reduces CD4+ and CD8+ T-cell reactivity in multiple sclerosis. Immunology. 2007; 121 (1): 29-39.
18. Zafranskaya M., Nizheharodova D., Yurkevich M., Lamouskaya N., Motuzova Y., Bagatka S. et al. In vitro assessment of mes-enchymal stem cells immunosuppressive potential in multiple sclerosis patients. Immunol. Lett. 2013; 149: 9-18.
19. Okuda Y., Okuda M., Apatoff B., Posnett D. The activation of memory CD4+ T cells and CD8+ T cells in patients with multiple sclerosis. J. Neurol. Sci. 2005; 235: 11-7.
20. Crawford M., Yan S., Ortega S., Mehta R., Hewitt R., Price D. et al. High prevalence of autoreactive neuroantigen-specific CD8± T cells in multiple sclerosis revealed by novel flow cytometric assay. Blood. 2004; 103 (11): 4222-31.
21. Auletta J., Bartholomew A., Maziarz R., Deans R., Miller R., Lazarus H. et al. The potential of mesenchymal stromal cells as a novel cellular therapy for multiple sclerosis. Immunotherapy. 2012; 4 (5): 529-47.
22. Novelli F., Bernabei P., Ozmen L., Riqamonti L., Allione A., Pestka S. et al. Switching on of the proliferation or apoptosis of activated human T lymphocytes by IFN-gamma is correlated with the differential expression of the alpha- and beta-chains of its receptor. J. Immunol. 1996; 157 (5): 1935-43.
23. Nemeth K., Mayer B., Mezey E. Modulation of bone marrow stromal cell functions in infectious diseases by toll-like receptor ligands. J. Mol. Med. (Berl.). 2010; 88 (1): 5-10.
24. Auletta J., Deans R., Bartholomew A. Emerging roles for multipotent, bone marrow-derived stromal cells in host defense. Blood. 2012; 23 (119): 1801-9.
Received 18.03.15
