CC BY
13
© Коллектив авторов, 2016
А.В. Трембач12, Е.И. Кондратьева1,3,4, Е.В. Лошкова4, Н.В. Колесникова3, Н.В. Тарасенко5, Т.В. Асекретова12, В.В. Лебедев2, А.И. Тлиф2
ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОТДЕЛЬНЫХ ФЕНОТИПОВ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
1ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» МЗ РФ, 2ГБУЗ «Детская краевая клиническая больница» МЗ Краснодарского края, 3ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», 4ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ, 5ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики», РФ
Цель — проанализировать состояние цитокинового статуса (IL1ß, IL4, IL10, TNFa, IFNy, антагониста рецептора IL1 — ILIRa) и выявить ассоциации полиморфизмов генов-модификаторов иммунного ответа семейства интерлейкина 1 (VNTR полиморфизм гена IL1RN, IL1B (rs1143634), TNFA*G-308A (rs1800629) и фенотипов онкогематологических заболеваний (ОГЗ), а также их осложнений. Обследованы 70 детей (37 (53%) мальчиков и 33 (47%) девочки), средний возраст 7,6±2,59 лет с ОГЗ. На фоне патогенетической терапии все пациенты реализовали фебрильную нейтропению и неконтролируемый системный воспалительный ответ, на этом фоне уровни IL1ß, IL1Ra, IL10, IL4 были значительно повышены по сравнению с контрольной группой (р=0,001), концентрация INFy оказалась ниже в группе ОГЗ без Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (р=0,043). Наибольшую диагностическую значимость при прогнозировании неблагоприятного исхода приобретает оценка содержания INFy и TNFa, а при нарушении функции почек — IL1ß (р=0,001), а также концентрация INFy (р=0,003). Зарегистрирована ассоциация генотипа A2A2 (0R=3,01; 95% CI: 1,48-6,16; х2=9,91; р=0,002) гена IL1RN*VNTR с риском развития ОГЗ. Получена ассоциация генотипа A2A2 (0R=19,09; 95% CI: 4,08-82,23; х2=25,6; р=0,001) гена IL1RN*VNTR с отсутствием летального исхода и нарушением функции почек (0R=20,89; 95% CI: 2,7-196,5; х2=13,020; р=0,001) при гемобла-стозах. Таким образом, показана высокая активность воспаления при ОГЗ в виде повышения про- и противовоспалительных цитокинов. Обнаружена ассоциация генотипа А2А и аллеля А2 гена IL1RN*VNTR с ОГЗ, неблагоприятными исходами (летальность).
Ключевые слова: полиморфизм генов цитокинов, онкогематологические заболевания, дети.
A.V. Trembach12, E.I. Kondrateva1,3,4, E.V. Loshkova4, N.V. Kolesnikova3, N.V. Tarasenko5, T.V. Asekretova1,2, V.V. Lebedev2, A.I. Tlif2
IMMUNOLOGICAL AND GENETIC CHARACTERISTICS OF HEMATOLOGICAL DISEASES INDIVIDUAL PHENOTYPES
1Kuban State Medical University; 2Children's Regional Clinical Hospital, Krasnodar Region; 3Medical Genetic Research Center; 4Siberian State Medical University; 5Scientific Research Institute of Medical Genetics, Russia
Objective of the research - to analyze the cytokine status state (ILip, IL4, IL10, TNFa, IFNy, IL1 receptor antagonist — ILIRa) and to identify association polymorphisms of interleukin 1 family immune response genes-modifiers (VNTR polymorphism of gene IL1RN, IL1B (rsi 143634)), TNFA*G308A (rs1800629) and oncohematological diseases (OHD) phenotypes and their complications. The study included 70 children (37 (53%) boys and 33 (47%) girls), average age 7,6±2,59 years with OHD. During pathogenetic therapy all patients realized febrile neutropenia and uncontrolled
Контактная информация: Кондратьева Елена Ивановна - д.м.н., проф., руководитель научно-консультативного отдела муковисцидоза ФГБНУ «Медико-генетический научный центр»
Адрес: Россия, 115478, г. Москва, ул. Москворечье, 1
Тел.: (495) 111-03-03, E-mail: elenafpk@mail.ru Статья поступила 10.05.16, принята к печати 15.07.16.
Contact Information:
Kondratieva Elena Ivanovna - MD., prof., Head of Scientific Advisory Department of Cystic Fibrosis, Medical Genetic Research Center Address: Russia, 115478, Moscow, Moskvorechie str., 1
Tel.: (495) 111-03-03, E-mail: elenafpk@mail.ru
Received on May 10, 2016,
submitted for publication on Jul. 15, 2016.
28
systemic inflammatory response, so ILip, ILIRa, IL10, IL4 levels were significantly increased compared with the control group (p=0,001), INFy concentration was lower in group without OHD without T-ALL (p=0,043). The highest diagnostic value in predicting unfavorable outcome gets INFy TNFa content evaluation, and in impaired renal function - ILip (p=0,001) and INFy concentration (p=0,003). The study revealed association of A2A2 genotype (0R=3,01; 95% CI: 1,48-6,16; X2=9,91; p=0,002) of IL1RN*VNTR gene with risk of OHD development. It also revealed association of A2A2 genotype (0R=19,09; 95% CI: 4,08-82,23; x2=25,6; p=0,001) of IL1RN*VNTR gene with fatal outcome absence and impaired renal function (0R=20, 89; 95% CI: 2,7-196,5; x2=13,020; p=0,001) at hemoblastoses. Thus, it showed high activity inflammation at OHD in form of increased pro and anti-inflammatory cytokines. It found association of A2A2 genotype and A2 allele gene IL1RN*VNTR with OHD and adverse outcomes (lethality). Keywords: gene polymorphism of cytokines, oncohematological diseases, children.
Изучение особенностей цитокиновой и генетической регуляции иммунного ответа при лим-фопролиферативном воспалении у больных с онкогематологическими заболеваниями (ОГЗ) является актуальным и может иметь значение в прогнозировании течения заболевания, развитии осложнений, что в конечном итоге открывает новые возможности для разработки подходов к терапии [1-5].
Цель исследования - проанализировать состояние цитокинового статуса (IL1ß, IL4, IL10, TNFa, IFNy, антагониста рецептора IL1 (ILIRa)) и выявить ассоциации полиморфизмов генов-модификаторов иммунного ответа семейства ин-терлейкина 1 (VNTR полиморфизм гена IL1RN, IL1B (rs1143634)), TNFA*G-308A (rs1800629) с фенотипами ОГЗ и их осложнениями.
Материалы и методы исследования
Обследование детей с гемобластозами проводили на базе ГБУЗ ДККБ ДЗ КК г. Краснодара (заведующий отделением к.м.н. В.В. Лебедев, главный врач д.м.н., проф. Е.И. Клещенко). Для проведения исследования было получено разрешение этического комитета Кубанского государственного медицинского университета (протокол № 4 от 20.06.2011). Обследованы 70 детей (37 (53%) мальчиков и 33 (47%) девочки), средний возраст 7,6±2,59 лет) с ОГЗ, находящихся на лечении в гематологическом отделении ГБУЗ ДККБ г. Краснодара. Из них 39 детей наблюдались с Т-клеточным острым лимфобластным лейкозом (Т-ОЛЛ), 4 ребенка - с В-клеточным острым лимфобластным лейкозом (В-ОЛЛ), у 4 детей был диагностирован острый миелобласт-ный лейкоз (ОМЛ), 8 пациентов - с Т-клеточной неходжскинской лимфомой (Т-НХЛ), 4 пациента - с В-клеточной неходжскинской лимфомой (В-НХЛ), 3 ребенка - с лимфомой Ходжкина (ЛХ). Больные получали следующие протоколы лечения: ALL-MB (2008); AML (2007); ВНХЛ 2010 mab, EURO - LB 02; SAA 94-Pilotstudie; LCH - 2005; OEPA, COPDAC, BEACOPE ЛГМ -2007.
В работе использованы данные, полученные авторами при исследовании детей и взрослых с сахарным диабетом 1-го типа (n=285, возраст от 6 до 53 лет) с диабетической нефропатией (32 ребенка, средний возраст 13,7±0,4 лет) [6] и хро-
ническим пиелонефритом с нарушением функции почек (20 больных, из них 8 мальчиков и 12 девочек, с острой почечной недостаточностью (ОПН) наблюдались 13 детей и с хронической почечной недостаточностью (ХПН) - 7 пациентов, средний возраст 8,01±3,26 лет) [7]. Для подтверждения полученных нами ранее генетических ассоциаций группы детей с нарушением функции почек на фоне диабета и пиелонефрита были объединены вместе с больными ОГЗ, реализовавшими нарушение функции почек, в объединенный фенотип - «Нарушение функции почек».
В качестве популяционного контроля использовали группу из 243 человек, принадлежащих к славянскому населению (база данных ДНК ФГБНУ «НИИ медицинской генетики», г. Томск) и не имеющих по данным анамнеза полиэтиологичного воспалительного процесса, признаков сердечно-сосудистых нарушений, сахарного диабета, а также других аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний. Средний возраст контрольной группы составил 44,3±0,7 лет. Контрольная группа для оценки цитокинового статуса включала 40 практически здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту, не имеющих симптомов ОРЗ в течение 2 месяцев перед обследованием.
Иммунологическое исследование (определение уровня 1Ь1Р, ¡ЫИа, 1Ь10, ЮТу, ТОТа, 1Ь4 (пг/мл) ИФА (наборы ООО «Протеиновый контур») проведено 57 пациентам с ОГЗ.
Выбор генов для исследования осуществляли в соответствии со следующими критериями: вклад генов-модификаторов иммунного ответа и продуктов экспрессии генов в воспалительный процесс или патогенез заболевания, показанные в работах разных авторов (в настоящее время данные по большинству ассоциаций противоречивы), доказанное влияние гена на функциональную активность, количество конечного продукта. Выделение тотальной ДНК проводили из лимфоцитов периферической крови с использованием стандартной фенол-хлороформной методики. Выделенную ДНК замораживали и хранили при -20 0С до проведения генотипирования. Определение генотипов полиморфных локусов проводили методом оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ). Характеристика исследованных
29
Характеристика исследованных полиморфизмов генов
Гены Хромосомный локус/ OMIM rs Полиморфизм Локализация в гене
IL1RN [8] 2q14.2/147679 нет VNTR Интрон 2
IL1B [9] 2q14/147720 1143634 (+3953)А1/А2 Экзон 5
TNFA*G-308A [10] 6p21.3/191160 1800629 G(-308)A Промотор
полиморфных маркеров представлена в табл. 1. Для проведения ПЦР использовали структуры праймеров и условия генотипирования, описанные в литературе. При анализе таблиц сопряженности оценивали значения статистики Пирсона Хи-квадрат (х2), достигнутый уровень значимости (р). Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости р принимали равным 0,05. Частоту аллелей определяли методом простого счета (n/2N, где n - число раз встречаемости аллеля (у гомозигот он учитывался дважды) в выборке N генотипов. Статистическую достоверность отличия между группами определяли по точному двустороннему критерию Фишера с поправкой на количество выявленных аллелей. Достоверными считали различия при р<0,05. Для сравнения частот аллелей и генотипов, оценки связи аллелей генов с заболеванием использовали критерий х2 Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность при числе степеней свободы равном 1, а также двусторонний точный тест Фишера в случае, если ожидаемое значение хотя бы в одной ячейке таблицы сопряженности было меньше 5. Ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеваниям оценивали по величине отношения шансов (OR) (Pearce, 1993). Доверительный интервал (ДИ) для OR вычисляли по методу Woolf [6, 7].
Результаты
Основными клиническими признаками ОГЗ были слабость, лихорадка, недомогание, боли в костях и суставах, кровоточивость слизистых оболочек, кожный геморрагический синдром, бледность. Лихорадка была связана с наличием бактериальной, вирусной, грибковой или про-тозойной инфекций, особенно на фоне глубокой нейтропении, и отмечалась у всех пациентов. Слабость в результате анемии и интоксикации отмечена у 100% детей. Распространение бла-стов в лимфатические узлы, приводящее к развитию лимфоаденопатии, наблюдалось у 97% детей. Увеличение размеров печени и селезенки отмечено у 100% детей и проявлялась болями в животе, расширением средостения, инициальным увеличением яичек у мальчиков (? пацие-та). Геморрагический синдром проявлялся развитием петехий, экхимозов, кровоизлияний и регистрировался у 70% детей. Кровотечение из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) наблюдалось у 16 детей и было вызвано тромбоцитопе-нией, коагулопатией или токсическим воздействием химиотерапии на слизистую оболочку ЖКТ. Анемический синдром, проявляющийся слабостью, бледностью, изменениями в общем
анализе крови (ОАК), наблюдался у 100% детей. Кардиомиопатия развивается в результате применения кардиотоксических препаратов и интоксикации (выявлено у 20% детей в процессе терапии основного заболевания. Нарушение функции почек выявлено у 13 (19%) пациентов. Нейролейкоз, возникающий при инфильтрации бластами головного и спинного мозга отмечен у 35 детей с ОЛЛ. Поражение глаз - кровоизлияние в сетчатку, инфильтрация сосудов, отек соска зрительного нерва отмечены у 11 детей с ОГЗ. Снижение минеральной плотности костной ткани (МПКТ) ниже -2,0 регистрированы у 19 детей (после стандартизации фактических значений BMD по отношению к длине тела). В 14 (20%) случаях был зарегистрирован летальный исход.
На первом этапе исследования было проанализировано количественное содержание цито-кинов при изучаемых фенотипах ОГЗ. На фоне терапии все пациенты реализовали фебрильную нейтропению и неконтролируемый системный воспалительный ответ, на этом фоне уровни IL10, IL1Ra, IL10, IL4 были значительно повышены по сравнению с контрольной группой (р=0,001), концентрация INFy оказалась ниже в группе ОГЗ без Т-ОЛЛ (р=0,043) (табл. 2).
Показано также, что при летальном исходе, который был отмечен в 20% (14 пациентов) случаев, содержание IL10 и IL4 продолжает нарастать, превышая исходный уровень или уровень в отсутствии летального исхода в среднем в 2,5 раза и в 1,5 раза соответственно (табл. 3, рис. 1). Между тем наибольшую диагностическую зна-
10 000 9000 8000 7000
° . 6000
os
g 5000
ь
^ 4000 3000 2000 1000
IL1P
ILIRa
IL10
IL4
Рис. 1. Изменение цитокинового профиля крови у больных ОГЗ в зависимости от их исхода.
Здесь и на рис. 2: 1-й столбик - ОГЗ б/л - онкогематологи-ческие заболевания без летального исхода; 2-й столбик -ОГЗ л/и - онкогематологические заболевания с летальным исходом; 3-й столбик - ОГЗ - онкогематологические заболевания, 4-й столбик - контроль - условно здоровые лица.
30
Содержание цитокинов в периферической крови при ОГЗ (Ме (Ql—Qз))
Показатели, пкг/мл Общая группа (п=57) Т-ОЛЛ (п=39) Другие фенотипы (п=18) Контроль (п=40)
1Ь1Р 224 (149,1-314,9) ро-з=0,001 203,9 (149,1-з14,9) рх_з=0,001 з4з,7 (1з7,7-з74,з) р1-з=0,764 р2-з=0,001 6,95 (1,24-15,92)
1Ь№а 68,18 (25,25-168,8) р0-з=0,001 5з,57 (24,0з-168,8) рх_з=0,001 74,07 (24,5-181) р! з=0,зз9 р2-з=0,001 12,72 (10,85-1з,04)
1Ь10 69,16 (0,09-109,2) р0-з=0,001 69,16 (0,08-119,2) рх_з=0,001 72,5 (19,4-101,1) р1-з=0,949 р2-з=0,001 2,55 (0-11,41)
ЮТу 44,29 (12,61-112,7) р0-з=0,238 51,з5 (19-116,7) р1-з=0,257 зз,8 (0,07-120,9) р! з=0,066 р2-з=0,04з 50,87 (50,25-52,46)
ТОТа 28 (16-42) р0-з=0,714 27 (14-45) р1-з=0,892 з5 (21-4з,5) р! з=0,286 р2-з=0,91з з5,з8 (22,9з-50,85)
1Ь4 19 (11-33) р0-з=0,001 21 (1з-з7) рх_з=0,001 16,0 (5,8-27,8) р1-з=0,587 р2-з=0,001 0,з (0,1-5,15)
Таблица 3
Содержание цитокинов в периферической крови при ОГЗ в зависимости от их исхода
(Ме ^х^з))
Показатели, пкг/мл Общая группа (п=57) ОГЗ без летальности (п=4з) ОГЗ и летальность (п=14) Контроль (п=40)
1Ь1Р 224 (149,1-з14,9) р0-з=0,001 204,8 (149,1-з14,9) р1-з=0,001 199,7 (166,1-297,2) р1-з=0,9з4 р2-з=0,001 6,95 (1,24-15,92)
1Ь№а 68,18 (25,25-168,8) р0-з=0,001 5з,57 (19,29-172) р1-з=0,001 58,5 (42,6-97,1) р1-з=0,646 р2-з=0,001 12,72 (10,85-1з,04)
1Ь10 69,16 (0,09-109,2) р0-з=0,001 59,16 (0,08-115,8) р1-з=0,001 150,85 (59,6-219,2) р1_з=0,1з9 р2-з=0,001 2,55 (0-11,41)
ЮТу 44,29 (12,61-112,7) р0-з=0,2з8 44,11 (19-98,87) р1-з=0,51з 1з7,6 (64,6-20з,6) р1-з=0,279 р2-з=0,017 50,87 (50,25-52,46)
ТОТа 28 (16-42) р0-з=0,714 26 (12-45) р1-з=0,708 68,5 (21-1з2,5) р! з=0,608 р2-з=0,036 з5,з8 (22,9з-50,85)
1Ь4 19 (11-зз) р0-з=0,001 21 (1з-з7) р1-з=0,001 27,5 (1з,5-Э8,5) р1-з=0,9з1 р2-з=0,001 0,з (0,1-5,15)
чимость при прогнозировании неблагоприятного исхода приобретает оценка содержания INFy и TNFa, посколько только при летальном исходе ОГЗ их уровень достоверно возрастает (табл. 3, рис. 2).
Проведенное исследование показало, что
наличие системной воспалительной реакции при ОГЗ не зависит от их фенотипов и носит сходный характер продукции цитокинов. Оценка таких цитокинов периферической крови, как INFy и TNFa, позволяет прогнозировать неблагоприятный исход у больных ОГЗ.
31
Содержание цитокинов в периферической крови при ОГЗ при НФП в составе мультиорганной недостаточности (Ме (Ql—Qз))
Показатели, пкг/мл Общая группа (п=57) ОГЗ без НФП (п=44) ОГЗ и НФП (п=13) Контроль (п=40)
1Ь1Р 224 (149,1-314,9) р0-3=0,001 146,8 (120,7-159,5) р1-3=0,001 311,8 (244,8-390,9) р! 3=0,001 р2-3=0,001 6,95 (1,24-15,92)
1Ь№а 68,18 (25,25-168,8) р0-3=0,001 36,08 (14,03-175,3) р1-3=0,001 87,4 (30,9-168,8) р! 3=0,169 р2-3=0,001 12,72 (10,85-13,04)
1Ь10 69,16 (0,09-109,2) р0-3=0,001 59,16 (2,46-102,5) р1-3=0,001 72,5 (0-119,2) р1-3=0,44 р2-3=0,001 2,55 (0,-11,41)
INFy 44,29 (12,61-112,7) р0-3=0,589 28,27 (0,9-60,5) р1-3=0,024 95,6 (21,6-182,7) р! 3=0,003 р2-3=0,008 50,87 (50,25-52,46)
TNFa 28 (16-42) р0-3=0,714 27 (14-38) р1-3=0,671 31,5 (18-45) р1-3=0,518 р2-3=0,636 35,38 (22,93-50,85)
1Ь4 19 (11-33) р0-3=0,001 15 (10-27) р1-3=0,001 22 (13-37) р1-3=0,109 р2-3=0,001 0,3 (0,1-5,15)
Нарушение функции почек (НФП) выявлено у 13 (19%) пациентов в виде ОПН в составе мультиорганной недостаточности на фоне нейтропени-ческой лихорадки. При этом наиболее высокими оказались значения 1Ыр (р=0,001), а также концентрации INFy (р=0,003), по сравнению с пациентами без НФП и контрольной группой (табл. 4).
На втором этапе исследования проведен поиск ассоциаций полиморфных вариантов генов-модификаторов иммунного ответа между контрольной группой, общей группой больных и отдельными фенотипами ОГЗ (В-ОЛЛ, Т-ОЛЛ, ОМЛ, Т-НХЛ, В-НХЛ, ЛХ), а также исходами и осложнениями ОГЗ.
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера УЫТЯ гена 1Ь1ЯЫ в группе детей с ОГЗ и в контрольной группе показал наличие досто-
верных отличий. Зарегистрирована ассоциация генотипа А2А2 (0К=3,01; 95% С1: 1,48-6,16; Х2=9,91; р=0,002) и аллеля А2 (0И=2,26; 95% С1: 1,31-3,92; х2=9,04; р=0,003) гена 1ЫНЫ*УЫТН с риском развития ОГЗ (табл. 5).
Ассоциативный поиск между отдельными фенотипами ОГЗ и контрольной группой показал наличие значимых ассоциаций. Так, при сравнении с контрольной группой продемонстрирована ассоциация генотипа А2А2 (0И=21,69; 95% С1: 4,18-150,5; х2=28,59; р=0,001) и аллеля А2 (0И=2,52; 5% С1: 1,32-4,81; х2=9,509; р=0,002) гена 1Ь1ЕМ*УМТЕ с развитием фенотипа Т-ОЛЛ (табл. 5). Сравнение с контрольной группой показало ассоциацию генотипа А2А2 (0И=13,43; 95% С1: 1,12-167,5; х2=8,134; р=0,017) гена 1ЫНЫ*УЫТН с развитием Т-НХЛ (табл. 5).
Получена ассоциация генотипа А2А2 (0И=19,09; 95% С1: 4,08-82,23; х2=25,6; р=0,001) аллеля А2 (0И=2,4; 95% С1: 1,35-4,27; Х2=9,44; р=0,002) гена 1ЫНЫ*УЫТН с отсутствием летального исхода (табл. 5).
Сравнение группы пациентов с НФП и контрольной группой показало наличие положительной ассоциации генотипа А2А2 (0И=20,89; 95% С1: 2,7-196,5; х2=13,020; р=0,001) и аллеля А2 (0И=3,05; 95% С1: 1,15-8,02; х2=5,280; р=0,021) полиморфного варианта VNTR гена 1Ь1ЯЫ с НФП на фоне нейтропенической лихорадки при ОГЗ (табл. 5).
Для повышения достоверности полученных результатов и проверки найденных ассоциаций было проведено сравнение контрольной группы и группы пациентов с сахарным диабетом, пие-
32
Сравнительный анализ ассоциаций аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов цитокинов среди пациентов с различными фенотипами ОГЗ
Ген, предрасполагающий аллель/генотип Аллели Генотипы
OR CI х2 (Р) OR CI х2 (Р)
Фенотип ОГЗ и контроль
IL1B (rs1143634) А2, А2А2 1,24 0,74-2,08 0,56 (0,453) 1,18 0,3-4,61 0,00 (0,958)
IL1RN*VNTR А2, А2А2 2,26 1,31-3,92 9,04 (0,003) 3,01 1,48-6,16 9,91 (0,002)
TNFA*G-308A (rs1800629) G, GG 1,02 0,53-1,99 0,01 (0,935) 1,06 0,48-2,35 0,00 (0,984)
Фенотип Т-ОЛЛ и контроль
IL1RN*VNTR А2, А2А2 2,52 1,32-4,81 9,509 (0,002) 21,69 4,18-150,5 28,59 (0,001)
Фенотип Т-НХЛ
IL1RN*VNTR А2, А2А2 2,11 0,66-6,55 2,68 (0,102) 13,43 1,12-167,5 8,13 (0,017)
Фенотип ОГЗ без летального исхода и контроль
IL1RN*VNTR 2,4 1,35-4,27 9,44 (0,002) 19,09 4,09-82,23 25,6 (0,001)
Фенотип ОГЗ, осложненный НФП, и контроль
IL1RN* VNTR А2, А2А2 3,05 1,15-8,02 5,28 (0,021) 20, 89 2,7-196,5 13,02 (0,001)
Объединенный < >енотип «Нарушение функции почек» и контроль
IL1RN* VNTR А2, А2А2 1,84 1,13-3 6,25 (0,012) 7,29 1,57-46,72 9,98 (0,007)
р - приведено для теста х
лонефритом, ОГЗ, сопровождающимися НФП (объединенный фенотип «Нарушение функции почек»). В результате получена ассоциация с генотипом А2А2 (OR=7,29; 95% CI: 1,57-46,72; Х2=9,980; р=0,007) и аллелем А2 (OR=1,84; 95% CI: 1,13-3; х2=6,25; р=0,012) полиморфного варианта VNTR гена IL1RN для пациентов с фенотипом «Нарушение функции почек» на фоне различных заболеваний (сахарный диабет 1-го типа, пиелонефрит, ОГЗ), представляющих собой разные модели воспаления (аутоиммунное, микробное, лимфопролиферативное) (табл. 5).
На третьем этапе исследования было проанализировано содержание цитокинов в сыворотке крови в зависимости от генотипов пациентов.
Анализ цитокинового статуса пациентов с ОГЗ в зависимости от изучаемых генов-модификаторов иммунного ответа показал, что среди носителей генотипа А2А2 гена IL1RN (VNTR) зарегистрировано высокое содержание IL10 (р=0,041) по сравнению с носителями генотипа А1А1 (табл. 6). Анализ содержания цитокинов у детей с ОГЗ в зависимости от генотипов гена IL1B (rs1143634) выявил повышение концентрации IL10 у обладателей генотипа А2А2 (р=0,027) по сравнению с носителями А1А1 (табл. 6). Анализ содержания цитокинов у больных в зависимости от генотипов гена TNF (rs1800629) показал, что среди носителей генотипа GA зарегистрировано высокое содержание TNFa (р=0,035) по сравне-
нию с носителями генотипа ОО и общей группой (табл. 6).
Обсуждение
ОГЗ представляют лимфопролиферативную модель воспаления [11]. Определение иммунологического варианта ОГЗ позволяет в настоящее время отслеживать наличие достигнутой ремиссии, ее сохранение и угрозу развития рецидива заболевания на клеточном уровне [12]. В то же время роль цитокинового статуса пациента и его генетического контроля в патогенезе ОГЗ и их клинических проявлений требует изучения и может быть полезна в разработке подходов биологической, в т.ч. антицитокиновой терапии [2, 13].
Активно изучается продукция цитоки-нов на фоне онкологических заболеваний различной локализации, по данной проблеме ежегодно публикуются десятки исследований. Подавляющее большинство работ, в т.ч. метаана-лизов, демонстрирует многократно повышенную выработку основных провоспалительных цито-кинов на фоне злокачественных новообразований различной локализации, в т.ч. при раке крови [3, 14-16]. В нашей работе была продемонстрирована высокая продукция основных провоспалитель-ных (1Ыр, 1Ь4; р=0,001) и противовоспалительных (1ЫКа, 1Ь10; р=0,001) цитокинов на фоне ОГЗ при развитии фебрильной нейтропении.
Таким образом, проведенными исследованиями выявлено, что наличие системной вос-
33
Уровень цитокинов в зависимости от генотипов генов-модификаторов иммунного ответа,
Ме (Qi-Qa)
Группа 0 1 2 3 р
Показатели/ полиморфизм Общая группа (n=55) А1А1, (n=33) А1А2, (n=8) А2А2, (n=14) Р1 2=1 р! 3=0,041 р2-3=0,262
IL10/IL1RN (VNTR) 69,16 (0,08-109,2) 52,49 (0,07-102,5) р0-1=0,314 85,83 (29,14-107,5) РО-2=1 89,17 (45,82-155,9) р>-3=0,22
IL10/IL1B (rs1143634) Общая группа (n=55) А1А1, (n=33) А1А2, (n=21) А2А2, (n=1) р1-2=0,027 Р1-3=1 Р2-3=1
69,16 (0,08-109,2) 59,16 (0,07-102,5) R>-1=0,195 85,84 (25,81-145,9) р>-2=0,130 32,48 (32,48-32,48) ро-3=1
TNFa/ TNF (rs1800629) Общая группа (n=55) GG, (n=47) GA, (n=8) р0-1=0,335 р0-2=0,035 р1-2=0,035
28 (16-45) 27 (14-38) 44,5 (25,5-65)
Р1-2 3 - достоверность различия показателей между группами пациентов с генотипами А1А1, А1А2, А2А2 и генотипами ОС, ОА; единицы измерения - пкг/мл.
палительной реакции при ОГЗ не зависит от их фенотипов и носит сходный характер продукции цитокинов. Однако обращает на себя внимание тот факт, что при ОГЗ в наибольшей степени возрастает продукция 1Ь4 Т-хелперами 2-го порядка, что свидетельствует о более резком усилении гуморального компонента в системной воспалительной реакции, а в наименьшей степени увеличивается содержание противовоспалительного 1Ь1Ка, который, существенно уступая в сывороточном содержании 1Ыр, свидетельствует о мощном провоспалительном характере цитокинов в семействе 1Ь1, играющем ведущую патогенетическую роль в системном воспалении при ОГЗ. Оценка таких цитокинов периферической крови, как ЮТу (р=0,017) и ТОТа (р=0,036) позволяет прогнозировать неблагоприятный исход у больных ОГЗ, так как их достоверное возрастание наблюдается при летальном исходе.
На фоне развития нефропатии у пациентов максимальными оказались концентрации 1Ь1р (р=0,001) и INFy (р=0,003), что свидетельствует о влиянии цитокинового дисбаланса на органы-мишени, где наиболее подверженными цитоки-новой «агрессии» являются почки.
Во многих исследованиях было показано, что носительство генотипа А2А2 гена 1Ь1ЯЫ связано с высокой продукцией провоспалительных цито-кинов и неблагоприятными исходами на фоне развития септического состояния при различных заболеваниях [3, 13]. Так, в 2013 г. опубликованы результаты генетического исследования, включившего 57 детей с ОЛЛ, показавшие многократное увеличение риска развития септического шока (0И=45,0; р=0,001) среди гомозиготных (1Ь1К^2/1Ь1К^2) и гетерозиготных (1ЬК^1/ 1ЬК^2) носителей гена 1Ь1ЯЫ [14]. В нашей работе получены аналогичные результаты, показавшие ассоциацию генотипа А2А2 (0И=3,01; р=0,002) и аллеля А2 (0И=2,26; р=0,003) гена
IL1RN с риском развития ОГЗ. Для носителей генотипа A2A2 гена IL1RN*VNTR показано значительное увеличение риска (OR=21,69; р=0,001) развития ОЛЛ. Активно исследуются полиморфизмы генов цитокинов и в отношении различных клинических фенотипов ОГЗ, в частности, фебрильной нейтропении. Так, в работе турецких авторов, включившей исходы острого лейкоза у 60 детей, показано отсутствие связи между развитием фебрильной нейтропении и изучаемыми полиморфизмами генов IL4 и IL1RA [5]. Было выявлено, что обладатели генотипа A2A2. Нарушение функции почек (OR=19,09; р=0,001) и аллеля A2 (OR=2,4; р=0,002) гена IL1RN*VNTR имеют гораздо меньший риск развития летального исхода, что совпало с нашими данными.
НФП может развиваться на фоне хронического пиелонефрита, сахарного диабета 1-го типа (диабетическая нефропатия), острые нарушения функции почек реализуются при химиотерапии ОГЗ. В нашем исследовании продемонстрирован высокий риск развития нарушений почечной функции среди носителей генотипа А2А2 (0R=20,89; р=0,001) и аллеля А2 (0R=3,05; р=0,021) гена IL1RN*VNTR при ОГЗ, а также при объединенном фенотипе «Нарушение функции почек».
В проведенном исследовании было показано, что аллель A2 VNTR полиморфизма гена IL1RN в гомозиготном состоянии ассоциирован с активной выработкой противовоспалительного цитокина IL10 (р=0,041). Носительство генотипа А2А2 гена IL1B (rs1143634) связано с высокой продукцией IL10 (р=0,027). Концентрация TNFa была максимальной у носителей аллеля G в гетерозиготном состоянии гена TNF (rs1800629). Носители аллеля G полиморфизма rs1800629 гена TNF в гетерозиготном состоянии характеризуется высокой активностью одного из
34
мощных провоспалительных цитокинов - TNFa (р=0,035), высокая активность которого также была продемонстрирована при ОГЗ [17].
Воспалительный процесс лежит в основе заболеваний различного генеза (бактериальных, аутоиммунных, аллергических, лимфопролифе-ративных, метаболических) и характеризуется как общностью изменений цитокинового статуса, так и его особенностями. В наших работах [18, 19] было показано, что микробно-воспали-тельный и лимфопролиферативный процессы ассоциированы с генотипом А2А2 и аллелем А2 гена 1ЫЕЫ*УЫТЯ, что требует дальнейшего осмысления и проведения исследований в этом направлении. Полученные ассоциации будут иметь значение для прогнозирования состояния почек (выделение групп риска и проведение превентивных мер) на фоне различных по патогенезу заболеваний в педиатрии.
В приложении к современным геномным исследованиям воспаления концепция исследования генов цитокинов позволяет разработать подход к более фокусированному анализу гене-
тического разнообразия, закономерному сужению спектра генов-кандидатов и их маркеров, рассматриваемых с точки зрения возможной предрасполагающей к общим патологическим процессам. Полученные результаты могут быть транслированы в практическую медицину для прогнозирования течения патологического процесса. Долгосрочный индивидуальный прогноз для конкретного лица и проведение необходимых терапевтических мероприятий необходимы для предотвращения развития заболевания или снижения тяжести его течения и профилактики осложнений.
Заключение
Показана высокая активность воспаления при ОГЗ в виде повышения про- и противовоспалительных цитокинов. Установлена их особенность при различных фенотипах и генотипах. Обнаружена ассоциация генотипа А2А2 и алле-ля А2 гена 1Ь1Ш*УЫТЯ с ОГЗ, отдельными их фенотипами (ОЛЛ), неблагоприятными исходами (летальность) и осложнениями в виде НПФ.
Литература
1. Urayama KY, Chokkalingam AP, Manabe A, Mizutani S. Current evidence for an inherited genetic basis of childhood acute lymphoblastic leukemia. Int. J. Hematol. 2013; 97 (1): 3-19. Epub. 2012 Dec 13.
2. Zhou X, Zhou S, Li B, Li Q, Gao L, Li D, Gong Q, Zhu L, Wang J, Wang N, Huang L, Zhao L, Li Z, Zhou J. Transmembrane TNF-a preferentially expressed by leukemia stem cells and blasts is a potent target for antibody therapy. Blood. 2015; Sep. 17 126 (12): 1433-1442. doi: 10.1182/blood-2015-01-624833. Epub. 2015 Jul 29.
3. ZhangAQ, Pan W, Gao JW, Yue CL, ZengL, Gu W, Jiang JX. Associations between interleukin 1 gene polymorphisms and sepsis risk: a meta-analysis. BMC Med. Genet. 2014 Jan 16; 15: 8. Epub. 2014 Jan 16.
4. Zapata-Tarrés M, Arredondo-Garcia JL, Rivera-Luna R, Klünder-Klünder M, Mancilla-Ramírez J, Sánchez-Urbina R, Vázquez-Cruz MY, Juárez-Villegas LE, Palomo-Colli MA. Interleukin 1 receptor antagonist gene polymorphism increases susceptibility to septic shock in children with acute lymphoblas-tic leukemia. Pediatr. Infect. Dis. J. 2013; 32 (2): 136-139. doi: 10.1097/INF.0b013e31827566dd.
5. Pehlivan M, Sahin HH, Ozdilli K, et al. Gene polymorphisms and febrile neutropenia in acute leukemia no association with IL4, CCR5, IL1RA, but the MBL2, ACE, and TLR4 are associated with the disease in Turkish patients: a preliminary study. Genet. Test Mol. Biomarkers. 2014; 18 (7): 474-481.
6. MaHuamuc T., 0pun Э., CaMÓyK flm. MeTOflbi reHe-TH^ecKOH HH^eHepHH. Mo^eKy^apHoe K^oHHpoBaHHe. M.: Mnp, 1984: 480 c.
7. Bland JM, Altman DG. Statistics notes. The odds ratio. BMJ. 2000; 320 (7247): 1468.
8. Patel R, Lim DS, Reddy D, et al. Variants of trophic factors and expression of cardiac hypertrophy in patients with hypertrophic cardiomyopathy. J. Mol. Cell. Cardiol. 2000; 32 (12): 2369-2377.
9. Tarlow JK, Blakemore IF, Lennard A, et al. Polymorphism in human IL-1 receptor antagonist gene intron 2 is caused by variable number of an 86-bp tandem repeat. Hum. Genet. 1993; 91: 403-404.
10. Wilkinson RJ, Patel P, Llewelyn M, et al. Influence of polymorphism in the genes for the interleukin (IL) 1 receptor antagonist and IL1p on tuberculosis. J. Exp. Med. 1999; 189 (12): 1863-1873.
11. Somintara S, Leardkamolkarn V, Suttiarporn P, Maha-theeranont S. Anti-Tumor and Immune Enhancing Activities of Rice Bran Gramisterol on Acute Myelogenous Leukemia. PLoS One. 2016; 11 (1): 0146869. doi: 10.1371/journal. pone.0146869. Collection 2016.
12. Bock S, Murgueitio MS, Wolber G, Weindl G. Acute myeloid leukaemia-derived Langerhans-like cells enhance Th1 polarization upon TLR2 engagement. Pharmacol. Res. 2016 Jan 18. pii: S1043-6618(16)00022-0. doi: 10.1016/j. phrs.2016.01.016.
13. Meyer NJ, Ferguson JF, Feng R, Wang F, Patel PN, Li M, Xue C, Qu L, Liu Y, Boyd JH, et al. A functional synonymous coding variant in the IL1RN gene is associated with survival in septic shock. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2014; Sep. 17 190 (6): 656-664.
14. Xiao H, Chen L, Luo G, et al. Effect of the cytokine levels in serum on osteosarcoma. Tumour Biol. 2014; 35 (2): 1023-1028.
15. Demeter J, Messer G, Rämisch S, Mee JB, di Giovine FS, Schmid M, Herrmann F, Porzsolt F. Polymorphism within the second intron of the IL1 receptor antagonist gene in patients with hematopoietic malignancies. Cytokines Mol. Ther. 1996; 2 (4): 239-242.
16. Zhang Y, Liu C, Peng H, et al. IL1 receptor antagonist gene IL1-RN variable number of tandem repeats polymorphism and cancer risk: a literature review and meta-analysis. PLoS One. 2012; 7 (9): e46017.
17. Kim MS, Kang JW, Jeon JS, Kim JK, Kim JW, Hong J, Yoon DY. IL-320 gene expression in acute myeloid leukemia suppresses TNFa production. Oncotarget. 2015; 6 (38): 4074740761. doi: 10.18632/oncotarget.5688.
18. Кондратьева Е.И., Терентьева АА., Тарасенко Н.В., Лошкова Е.В., Тлиф А.И. Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов цитокинов с клиническими вариантами пиелонефрита. Вопросы современной педиатрии. 2014; 6 (1): 28-32.
19. Кондратьева Е.И., Лошкова Е.В., Тарасенко Н.В., Тлиф А.И., Янкина Г.Н., Терентьева АА, Степаненко Н.П., Гаприндашвили Е.Г., Асекретова Т.В., Трембач А.В., Мозго-ногова С.В., Горев В.В. Изучение вклада генов семейства интерлейкина 1 (IL1RN, IL1B) на примере различных моделей воспаления в детском возрасте. Цитокины и воспаление. 2015; 14 (1): 43-50.
35
