CC BY
55
УДК 597.442.111.1
Т. Ю. Переварюха
ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ СЕЗОННЫХ РАС СЕВРЮГИ
Введение
В настоящее время севрюга (Acipenser stellatus Pallas, 1771), как и другие представители отряда Acipenseriformes, отнесена к группе редких видов и включена в Приложение II CITES. Катастрофическое снижение численности осетровых рыб обусловлено интенсивным строительством гидротехнических сооружений и чрезмерным выловом [1]. Восполнение численности севрюги в значительной мере осуществляется за счет её воспроизводства на рыбоводных заводах. В Каспийском бассейне доля искусственно воспроизведенных рыб достигает 50 % [2]. Именно поэтому действия по поддержанию численности севрюги должны учитывать сохранение её устойчивости, обусловленной генетической гетерогенностью и, соответственно, требуют знаний об эволюционно сформировавшейся популяционной структуре вида [3].
В настоящем сообщении представлены новые данные, отражающие характер различий между сезонными расами севрюги по антигенам сывороточных белков.
Материал и методы исследований
В работе обобщаются результаты сравнительного иммунохимического изучения белков сыворотки крови севрюги, отловленной в дельте Волги (тони «9-я Огневка» и «10-я Огневка»), в устье р. Урал (тоня «Нижне-Дамбинская»), а также в Северном и Среднем Каспии. Для имму-нохимического анализа из индивидуальных сывороток готовили сборные (пул), используя только самцов, чтобы исключить влияние половых фракций. Использование пулов сывороток позволяет оперировать со спектром антигенов, в большей степени характерным для исследуемой группировки рыб в целом, чем сыворотки отдельных особей. Сыворотки консервировали борной кислотой и хранили в холодильнике при температуре +4 °С в плотно закрытых пробирках.
Продуцентами антисывороток служили кролики пород шиншилла и белый великан. Иммунизацию проводили по новой, разработанной нами схеме, позволившей получить антисыворотки с более высокими разрешающими способностями. Основной цикл включал в себя, как правило, серию из 4-х подкожных инъекций в брюшную область животного с 10-12-дневными интервалами. Вводили возрастающие дозы эмульсии сыворотки с адъювантом Фрейнда в соотношении 1 : 1, начиная с 1 мл и доводя до 3 мл на каждое животное к концу основного цикла. Первые две инъекции выполняли с полным адъювантом, последующие - с неполным. Через 10-12 дней после последней инъекции прижизненно брали 40-50 мл крови из краевой вены уха. Спустя 1-1,5 месяца проводили реиммунизацию 3 мл эмульсии с неполным адъювантом подкожно. Через 10-12 дней снова брали кровь. Каждую последующую реиммунизацию проводили аналогично. В работе использовали антисыворотки, полученные после 4-5-ти реиммунизаций. На каждую популяцию иммунизировали не менее 4-х кроликов. В работе использовали нормальные и абсорбированные антисыворотки. Абсорбцию антисывороток проводили с целью выявления специфических антигенов, по которым одна популяция может отличаться от другой. Наличие подобных антигенов у осетровых на внутривидовом уровне показано многочисленными исследованиями [4, 6, 7].
Иммунохимический анализ выполнен с использованием методов двойной иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза. Двойную иммунодиффузию ставили в 1 %-м растворе агара фирмы «Дифко» (США), приготовленном на физиологическом растворе, руководствуясь рекомендациями по микрометоду. Основным штампом служил вариант «семёрка» с диаметром лунок и расстоянием между ними 4 мм [8, 9]. Иммуноэлектрофорез проводили на предметных стеклах. Использовали 1 %-й агар «Дифко», приготовленный на веронал-мединаловом буфере, или 1 %-й гель агарозы «Н» на трис-барбитуратном буфере. Ионная сила буфера - 0,02, рН - 8,6. Консервированные сыворотки перед анализом диализировали против кюветного буфера и выравнивали по белку до концентрации 35 мг/мл. Электрофорез проводили в модифицированной камере прибора ПЭФ-3, снабженной охлаждающей плитой. Благодаря этому поддерживался темпера-
турный режим +11...+13 °С. Продолжительность электрофореза при напряжении 10 В/см составляла, в зависимости от условий опытов, около 45 или 75 минут. Преципитация длилась 24-48 часов во влажной камере с раствором антисептика. При расшифровке результатов реакций учитывали число полос преципитации, их форму, интенсивность и локализацию [10-12].
Результаты исследований и их обсуждение
В опытах двойной иммунодиффузии антисыворотка против белков яровой севрюги формирует с гомологичными сывороточными белками до 9 дуг преципитации, а в опытах с сывороточными белками озимой севрюги эта же антисыворотка формирует до 8 дуг преципитации. Антисыворотка против сывороточных белков озимой севрюги в опытах с гомологичными и ге-терологичными сывороточными антигенами формирует до 8-9 линий преципитации, плавно переходящих из одной зоны в другую.
Дальнейшее изучение антигенного состава сывороточных белков сезонных рас волжской севрюги проводилось с помощью иммуноэлектрофоретического анализа. И действительно, методом иммуноэлектрофореза сывороточные белки яровой и озимой волжской севрюги удается разделить на 20-21 самостоятельный в антигенном отношении компонент против 8-9, выявляемых с помощью двойной иммунодиффузии. Анализ полученных данных показывает, что наиболее подвижные альбумины и наименее подвижные у-глобулины представлены одним компонентом (табл. 1).
Таблица 1
Общее число и распределение антигенных компонентов по зонам электрофоретической подвижности у сезонных рас волжской севрюги
Антисыворотка Антигены Общее число компонентов Зоны электрофоретической подвижности
А1Ь аі- а2- Рі- 02- у-
СВО СВО 21 1 4 7 5 3 1
СВО СВЯ 21 1 4 7 5 3 1
СВЯ СВЯ 21 1 4 7 5 3 1
СВЯ СВО 20 1 4 6 5 3 1
Примечание. СВО - севрюга волжская озимая, СВЯ - севрюга волжская яровая.
В зоне подвижности аі-глобулинов антисыворотка против сывороточных белков озимой и яровой севрюги формирует по 4 дуги преципитации как с гомологичными, так и с гетерологич-ными антигенами. Наиболее гетерогенные а2-глобулины в опытах с антисывороткой против сывороточных белков озимой севрюги удается разделить на 7 компонентов в гомологичной и гете-рологичной постановках. Иммуноэлектрофорез с антисывороткой против сывороточных белков яровой севрюги позволил выявить в зоне электрофоретической подвижности а2-глобулинов в гомологичной постановке 7 компонентов и в гетерологичной постановке - до 6 компонентов. В зоне электрофоретической подвижности р1-глобулинов выявляется по 5 компонентов у обеих сезонных рас волжской севрюги. В зоне электрофоретической подвижности р2-глобулинов у обеих рас удается выделить по 3 антигенных компонента.
Опыты с абсорбированными антисыворотками позволили установить, что антисыворотка против сывороточных белков яровой севрюги, абсорбированная сывороточными белками озимой севрюги, продолжала реагировать с гомологичным антигеном, формируя в опытах двойной иммунодиффузии одну линию преципитации. Антисыворотка против сывороточных белков озимой севрюги, абсорбированная сывороточными белками яровой севрюги, переставала реагировать с сывороточными белками обеих рас севрюги.
Заключение
Таким образом, исследование особенностей антигенного состава сывороточных белков яровой и озимой рас волжской севрюги показало, что в антисыворотке, полученной против сывороточных белков яровой севрюги, имеется один антиген, отличающий её от озимой севрюги. В опытах двойной иммунодиффузии он проявляется в виде четкой дуги, слегка изогнутой по направлению к лункам с антигеном. Этот специфический антиген по данным иммуноэлек-
трофоретического анализа является а2-глобулином (рис. 1). На иммунофореграмме он представлен в виде интенсивной, короткой среднеизогнутой дуги, расположенной примерно посередине между лункой с антигенами и траншеей с антисывороткой. Эта дуга преципитации локализуется целиком в зоне а2-глобулинов.
Рис. 1. Иммуноэлектрофоретический анализ локализации специфического антигенного компонента в сыворотке яровой севрюги волжской популяции. В траншее - антисыворотка яровой севрюги, истощенная сывороточными белками озимой севрюги той же популяции.
Антигены: 1 - яровой севрюги; 2 - озимой севрюги
Полученные нами данные свидетельствуют о четкой репродуктивной изоляции сезонных рас волжской севрюги. Следует отметить, что специфический для яровой севрюги антиген выявляется у сеголетков, а также у самцов и самок с половыми железами на II, III, ІІІ-ІУ стадиях зрелости гонад, а также у отнерестившихся (покатных) рыб. Специфический для яровой расы севрюги антиген представляют собой хороший молекулярный маркер, позволяющий отличать рыб яровой расы от особей озимой расы.
Интересно, что антиген, выявленный нами у яровой волжской севрюги, выявляется и у яровой расы уральской севрюги. Результаты постановки реакции двойной иммунодиффузии с антисывороткой против белков яровой расы волжской севрюги, абсорбированной белками озимой расы, представлены на рис. 2.
Рис. 2. Выявление общего специфического антигена в сыворотке яровой севрюги волжской и уральской популяций. Антигены: 1 - яровой волжской севрюги;
2- озимой волжской севрюги; 3- озимой уральской севрюги; 4 - яровой уральской севрюги;
5 (в центре) - антисыворотка яровой волжской севрюги, абсорбированная сывороточными белками озимой волжской севрюги: А - специфический антиген яровой расы севрюги
В сыворотке крови яровой волжской севрюги 1 и яровой уральской севрюги 4 имеется один и тот же антигенный компонент А, плавно переходящий из зоны преципитации волжской севрюги 1 в зону уральской севрюги 4, без образования шпор и перекрестов. В зонах преципитации озимой волжской 2 и озимой уральской севрюги 3 этого антигена нет, что свидетельствует о полной иммунохимической идентичности специфического компонента у яровых рас волжской и уральской севрюги и позволяет идентифицировать на принадлежность к той или иной расе рыб не только волжской, но и уральской популяций.
Суммируя результаты сравнительного изучения антигенного состава сывороточных белков у сезонных рас севрюги, мы должны отметить прежде всего высокую гетерогенность антигенного состава этих белков у севрюги яровой и озимой рас, сопоставимую с гетерогенностью у других видов осетровых рыб. Например, методом иммуноэлектрофореза в сывороточных белках русского осетра удалось выявить 15-18 самостоятельных в антигенном отношении индивидуальных белков, у белуги - от 16 до 19 компонентов [6]. Нам удалось, используя новую схему иммунизации кроликов, выявить от 20 до 21 антигенных компонента.
У всех видов осетровых альбумины оказались гомогенными в антигенном отношении, а глобулины - наиболее высокогетерогенными. Следует отметить, что у севрюги наиболее гетерогенными являются а-глобулины (аі- и а2-), а у русского осетра и белуги гетерогенность различных фракций глобулинов (а- и Р-) более или менее одинакова. Наконец, у-глобулины, представляющие собой наиболее тяжёлые и наименее подвижные сывороточные белки, у всех исследованных видов каспийских осетровых гомогенны в антигенном отношении. И в этом проявляется их сходство с наиболее легкими и наиболее подвижными сывороточными белками - альбуминами.
Оценивая полученные нами данные по антигенной дифференциации сывороточных белков у различных сезонных рас, севрюги, а также соответствующие данные по русскому осетру, белуге и персидскому осетру в свете современных представлений популяционной генетики, мы должны прийти к выводу об иммуногенетической специфичности сезонных рас севрюги и, следовательно, об их репродуктивной самостоятельности. Отсюда следует, что широко известные экологические и физиологические особенности сезонных рас каспийских осетровых наследственно детерминированы, а степень вариации в пределах нормы изменчивости этих особенностей у каждой популяции контролируется генетически и поддерживается стабилизирующим отбором.
Н. Л. Гербильский [13-17] разработал теорию биологического прогресса осетровых рыб. Согласно этой теории, главными показателями прогресса осетровых рыб являются их высокая численность, широкий ареал и адаптивная радиация. Для видов рода Acipenser Гербильским была сформулирована система адаптаций, охватывающая те из них, которые обеспечивают расширение степени эврибионтности, интенсификацию размножения и снижение смертности потомства. Пользуясь схемой системы адаптаций, предложенной Гербильским [14, 17], взаимосвязанные особенности, характеризующие адаптивную радиацию в пределах вида: дифференциация по расположению нерестилищ и срокам нереста, относят к первой группе адаптаций. Гербиль-ский назвал её «многогранной экологической приспособленностью» или «расширением степени эврибионтности». Иными словами, в эту группу адаптаций им были включены особенности видов, характеризующие в первую очередь их популяционную структуру.
Адаптивная радиация осетровых рыб, обитающих в бассейне Каспийского моря, как раз и была направлена на образование экологических форм. Следует отметить, что различия между сезонными расами, по нашему мнению, определяются не временем захода половозрелых рыб в реку, а протяженностью речного участка миграционной трассы, т. е. в конечном счете длительностью речного периода жизни производителей осетровых рыб. В частности, наличие озимых рас позволяет осетровым рыбам осваивать нерестилища в верховьях рек. Половозрелые особи озимых рас максимально адаптированы к условиям длительных миграций. У них отмечена максимальная интенсивность активного и генеративного обмена. Яровой вариант нерестовой миграции позволяет размножаться на нижних нерестилищах. Миграция в этом случае оказывается короткой, что не ведёт к особым энергетическим затратам. Подобные структуры нерестовых контингентов и типы миграций свойственны и другим видам, обитающим, например, в бассейнах Черного и Азовского морей.
Функциональной основой дифференциации осетровых рыб на популяции сезонных рас является совокупность физиологических и биохимических процессов. Эти процессы определяют интенсивность активного и генеративного обменов, различную динамику накопления, а главное,
последующего расходования энергетических запасов организма в условиях повышенных мышечных нагрузок, а также различный уровень реактивности генеративной ткани к гормонам. Основным у осетровых рыб является отбор по физиологическим и биохимическим параметрам, позволяющим оптимальным образом приспособиться к длительному нахождению в осмотически различных средах (море, река). Именно эти параметры определяют изменения генетической структуры популяций при относительном постоянстве морфологических признаков.
Изолирующие механизмы, действующие на разных нерестовых реках или в пределах одной реки, принципиально сходны. В обоих случаях это территориальная разобщенность нерестилищ и разновременность нереста. В результате создаётся экологическая дифференциация на самом важном этапе онтогенеза - периоде размножения. Генетические различия между сезонными расами - это продукт длительной эволюции популяций в конкретных условиях данного водоёма, которые так же претерпевали радикальные изменения (трансгрессии и регрессии). Сохранившаяся до сих пор у осетровых рыб популяционная структура является результатом адаптации к той физико-географической обстановке, которая сложилась в далеком прошлом, а не в последнее столетие. В связи с этим мы полагаем, что к идее исключительной «адаптационной пластичности осетровых рыб», и в частности севрюги, необходимо относиться весьма осторожно.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ходоревская Р. П., Рубан Г. И., Павлов Д. С. Поведение, миграции, распределение и запасы осетровых рыб Волго-Каспийского бассейна. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2007. - 242 с.
2. Иванов В. П., Мажник А. Ю. Рыбное хозяйство Каспийского бассейна (Белая книга). - М.: ТОО «Журнал «Рыбное хозяйство», 1997. - 40 с.
3. Алтухов Ю. П. Внутривидовое генетическое разнообразие: мониторинг и принципы сохранения // Генетика. - 1994. - Т. 31, № 10. - С. 1333-1357.
4. Лукьяненко В. И., Переварюха Ю. Н. Внутрипопуляционная антигенная дифференциация сывороточных белков севрюги Acipenser stellatus Pallas из Северного Каспия // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 1985. - Т. 21, № 2. - С. 126-129.
5. Берг Л. С. Яровые и озимые расы у проходных рыб // Очерки по общим вопросам ихтиологии. -М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1953. - С. 242-260.
6. Каратаева Б. Б. Антигенная дифференциация сывороточных белков сезонных рас каспийских осетровых: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Севастополь, 1977. - 20 с.
7. Субботкин М. Ф. Антигенная дифференциация сывороточных белков осетровых рода Acipenser: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1991. - 24 с.
8. Гусев А. И. Микрометод преципитации в агаре // Иммунохимический анализ. - М.: Медицина, 1968. - С. 99-119.
9. Ouchterlony O. Diffusion-in-gel methods for immunological analysis // Prog. Allergy. - 1958. - N 5 (1). - P. 1-78.
10. Грабар П., Буртэн П. Иммуноэлектрофоретический анализ: применение для исследования биологических жидкостей человека. - М.: Изд-во иностр. лит., 1963. - 207 с.
11. Зильбер Л. А., Абелев Г. И. Вирусология и иммунология рака. - М.: Гос. изд-во мед. лит., 1962. - 457 с.
12. Никулина Д. М. Практическое освоение иммунохимических методов: методические рекомендации. Астрахань, 1991. - 36 с.
13. Гербильский Н. Л. Пути развития внутривидовой биологической дифференциации, типы анадромных мигрантов и вопрос о миграционном импульсе у осетровых // Учен. зап. ЛГУ. Сер. биол. наук. -1957. - Т. 44, № 228. - С. 11-32.
14. Гербильский Н. Л. Теория биологического прогресса осетровых и её применение в практике осетрового хозяйства // Учен. зап. ЛГУ. Сер. биол. наук. - 1962. - Т. 48, № 311. - С. 5-18.
15. Гербильский Н. Л. Теория биологического прогресса и её использование в рыбном хозяйстве // Теоретические основы рыбоводства. - М.: Наука, 1965. - С. 77-84.
16. Гербильский Н. Л. Изучение функциональных основ внутривидовой эволюции в связи с проблемой численности и ареала в рыбном хозяйстве // Вестн. Ленинград. гос. ун-та. - 1967. - № 15 (3). - С. 5-21.
17. Гербильский Н. Л. Теория биологического прогресса осетровых и её применение в практике осетрового хозяйства // Осетровые и проблемы осетрового хозяйства. - М.: Пищ. пром-сть, 1972. - С. 101-111.
Статья поступила в редакцию 3.03.2010
IMMUNOCHEMICAL ANALYSIS OF SERUM PROTEINS OF THE STURGEON SEASONAL RACES
T. Yu. Perevaryukha
With the help of the methods of immunochemical analysis the antigenic composition of serum proteins of the seasonal races of sturgeon Acipenser stella-tus in the Volga and Ural rivers has been studied. The antigens of serum proteins of sturgeon with normal homo- and heteroantiserums are immunoelectrophoreti-cally differentiated into 20-21 components. The cross absorption of antiserum has revealled the presence of specific antigens. Spring Volga sturgeon differs from winter sturgeon in one antigen, which is referred to a2-globulin. Beside winter sturgeon has no specific antigens. The antigen found in spring Volga sturgeon is also discovered in spring race of Ural sturgeon. The revealed antigen is peculiar to fish of both sexes and is found both in sea and river periods of life. The conclusion on the possibility to distinguish the sturgeon of the different races by presence or absence of this antigen and thereby control the population structure of sturgeon in the Caspian Sea basin has been made.
Key words: sturgeon Acipenser stellatus, Caspian Sea, immunochemical analysis, seasonal races.
