CC BY
22
УДК 616.155.16-053.31
Ю. Л. КРИВЕНЦЕВ Д. М. НИКУЛИНА Р. А. БИСАЛИЕВА Н. В. БОРИСОВА
Астраханская государ< таенная медицинская академия
ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ БОЛЬНЫХ С ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ
Иммунохимический анализ НЬР методом РИД по Оухтерлони впервые показал значительный процент выявления НЬР у больных с эритромами (66,67 %), сублейкемическими миелозами (36,36%), острыми миелолейкозами НЬР (22,22%) случаев, при острых и хронических лимфолейкозах НЬР иммунохимическими методами не выявляется.
Гемоглобины человека изучаются уже на протяжении почти века, но, тем не менее, эмбриональный гемоглобин (НЬР, синоним - НЬЕ) является одним из самых малоизученных белков человеческого организма. Сведения о НЬР в научной литературе до сих пор крайне скудны. Такой парадоксально низкий интерес ученых к этому белку можно объяснить следующими причинами: а) методологический фактор: получение препарата НЬР крайне затруднительно из-за сложностей получения биоматериала (НЬР синтезируется только в раннем эмбриогенезе, с 5 по 18 гестации), экстрагирования и очистки белка; б) практический фактор: по мнению большинства клиницистов, данный белок не представляет прикладной (диагностическо-прогностической) ценности, т.к. активность его гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых [1; 2; 3].
В данной работе авторы исходили из предположения, что активация гена НЬР в постнатальном периоде жизни человека возможна при патологии, связанной с понижением степени дифференцировки, т.н. «омоложением» клеток эритроцитарного ростка. Кта-ким состояниям можно отнести некоторые онкологические заболевания тканей красного костного мозга, в первую очередь, эритремии, сублейкемические мие-лозы, а также, возможно, некоторые миелолейкозы.
Цель: иммунохимический качественный анализ наличия эмбрионального гемоглобина в эритроцитах больных эритромами, сублейкемическими миелозами и лейкозами различных типов.
В процессе научно-экспериментального исследования физико-химических свойств эмбрионального гемоглобина авторами разработан оптимальный алгоритм выделения этого белка.
Исходным биоматериалом для выделения и очистки НЬР служил абортивный материал сроком 7-9 недель (отделение неонатологии больницы № 5 г. Астрахани) . После промывки и сортировки эмбриональные ткани подвергались механическо-термической гомогенизации путем двукратного замораживания
и оттаивания. После экстрагирования цитозольных белков взвесь центрифугировали при 8000 д в течение 30 мин., после чего осадок отбрасывали.
Поскольку устойчивость эмбрионального гемоглобина несколько ниже, чем у фетального [2|, для очистки НЬР нами была модифицирована стандартная методика щелочной денатурации для выделения фетального гемоглобина |3, 4], состоящая в 40-секундной обработке смеси 1,2 М раствором ЫаОН с последовательным осаждением белков раствором сульфата аммония (до 50%-й насыщенности). После центрифугирования при 8000 об/мин. в течение 30 мин. осадок отделяли. В надосадочной жидкости оставался эмбриональный гемоглобин с незначительным количеством белковых примесей.
Полученный белковый препарат подвергали обес-соливанию путем гель-проникающей хроматографии на колонке с сефадексом С-25, рабочий буфер — 0,05 М, фосфатный буферный раствор рН 7,4.
Окончательную очистку НЬР от оставшихся ще-лочеустойчивых компонентов в полученном на предыдущем этапе препарате проводили пугем ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе С-50 на 0,01 М трисхлоридном буфере рН 8,1 в градиенте ионной силы.
Анализ чистоты полученных препаратов осуществляли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле.
Полученные очищенные препараты НЬР использовали, в частности, для получения специфических антисывороток на данный белок методом иммунизации кроликов. Иммунизация проводилась с полным адьювантом Фрейнда по стандартной методике (5].
Для контроля качества антисывороток проводили их иммунохимическое сопоставление с другими антигенными композитами, а также специфическую окраску полученных преципитатов бензидиновым методом [4). При наличии дополнительных линий преципитации проводили дробное истощение антисыворотки соответствующей белковой фракцией.
Таблица 2
Результаты иммунохимической индикации НЬР в крови онкогематологических больных
Таблица 1
Перечень использованного в работе материала
Исследуемый материал (кровь) Количество проб
Здоровые 36
Больные эритремиями 12
Больные сублейкемическими миелозами 11
Больные хроническими миелолейкозами 22
Больные острыми миелолейкозами 9
Больные острыми и хроническими лимфолейкозами 17
ВСЕГО 107
Исследуемый материал Количество проб Количество положительных результатов на НЬР Процент положительных результатов на НЬР
Здоровые 36 0 0,0
Больные эритремиями 12 8 66,67
Больные сублейкемическими миелозами И 4 36,36
Больные хроническими миелолейкозами 22 1 4,55
Больные острыми миелолейкозами 9 2 22,22
Больные острыми и хроническими лимфолейкозами 17 0 0,0
В результате проведенной работы разработаны специфические иммунохимические тест-системы на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат НЬР (полученный вышеописанным способом) в рабочем разведении: 1/2 или экстракт тканей эмбриона (срок — 6-9 недель) в рабочем разведении 1/8-1/16. Тест-системы не использовали для иммунохимической индикации НЬР в исследуемом материале.
Объектом нашего исследования являлась гепа-ринизированная кровь больных некоторыми гематологическими онкозаболеваниями, Всего было обследовано 96 образцов крови. Из них: 12 больных эрит-ромами, 11 больных сублейкемическими миелозами, 31 больной острыми и хроническими миёлолейкоза-ми, 17 больных острыми и хроническими лимфолей-козами, а также 36 образцов крови здоровых людей (группа контроля) (табл. 1).
Сбор биоматериала проводили в гематологическом отделении 1 -й областной больницы г. Астрахани.
Подготовка проб к анализу состояла в их предварительном гемолизе путем двухкратного замораживания (при -18°С) и оттаивания.
Индикация НЬР в образцах осуществлялась путем иммунодиффузии по Оучтерлони [5]. В ходе работы использовались моновалентные иммунохимические тест-системы на НЬР (см. выше).
После иммунопроявления агаровые стекла высушивали и подвергали специфическому окрашиванию на гемоглобины гваяколовым методом, модифицированным авторами: 0,2 г гваякола в 50 мл ледяной уксусной кислоты, затем добавляли этот раствор в 0,1М ацетатный буфер рН 4,6 с 0,2% хлоридом марганца (II) до 0,3% концентрации. Туда же добавляли
перекись водорода до концентрации 1%. Экспозиция 45 мин. В результате окраски гемоглобиновые преципитаты приобретали голубой цвет.
Стёкла фотографировали в отраженно-рассеянном свете. Считывание результатов проводили только по отчетливым окрашенным линиям преципитации.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистических компьютерных программ.
В результате проведенного иммунохимического анализа исследуемого материала на эмбриональный гемоглобин методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони получены следующие результаты (табл. 2). Не выявлено НЬР в крови здоровых (контрольная группа), а также больных острыми и хроническими лимфолейкозами, что объяснимо исходя из цитологической специфики данных опухолей. Отмечена единичная регистрация НЬР в крови больных хроническими миелолейкозами (4,55%), не являющаяся статистически достоверной. Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эрит-ремиями (частотавыявления -66,67%), сублейкемическими миелозами (36,36%) и острыми миелолейкозами (22,22%).
Публикация приведенных данных наряду с внедрением иммунохимического метода определения эмбрионального гемоглобина в прикладную медицину способствует повышению качества диагностики ряда онкогематологических заболеваний.
Библиографический список
1. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. - СПб, ООО "ЭЛБИ-СПб", 2000. - 384 с.
2. Стародуб Н.Ф. Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко. - АН УССР, Институт молекулярной биологии и генетики. Киев: Наукова думка, 1987. - 198 с.
3. Зайчик А.Ш. Основы патохимии / А.Ш.Зайчик, Л.П Чурилов. - С.-ГШ. «Элби-СПб». - 2000. - 182 с.
4. Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии / Й. Тодоров. - София. Медицина и физкультура. - 1968. - С. 278-310.
5. Никулина Д.М, Практическое освоение иммунохими-ческих методов / Д.М. Никулина. - Метод, рекомендации. -Астрахань. - 1991. - 36 с.
КРИВЕНЦЕВ Юрий Алексеевич, кандидат медицинских наук, доцент.
НИКУЛИНА Дина Максимовна, кандидат медицинских наук, доцент, профессор. БИСАЛИЕВА Рината Альбкалиевна, ассистент. БОРИСОВА Наталья Владимировна, клинический ординатор.
Статья поступила в редакцию 10.10.06. © Кривенцев Ю. А., Никулина Д. М., Бисалнсва Р. Л., Борисова Н. В.
УДК 617.55-007.43-053.31-089.844 Д Д ПЛОХИХ
Кемеровская государственная медицинская академия
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ПЕРВИЧНОЙ И ОТСРОЧЕННОЙ ПЛАСТИКИ ПЕРЕДНЕЙ БРЮШНОЙ СТЕНКИ НОВЫМ СПОСОБОМ У БОЛЬНЫХ С Г АСТРОШИЗИСОМ _
Целью настоящей работы было сравнение результатов первичной пластики передней брюшной стенки и пластики новым способом у больных гастрошиэисом с висцероабдо-минальной диспропорцией (ВАД).
Разработанный нами новый способ хирургического лечения гастрошизиса исследован у 15 больных с гастрошиэисом — основная группа. Группу сравнения составили 22 новорождённых ребенка с гастрошиэисом, которым проводилась первичная пластика передней брюшной стенки местными тканями.
В результате исследования получены следующие данные. У больных группы сравнения операция приводила к значительному ухудшению состояния. В16 наблюдениях отмечен синдром повышенного внутрибрюшного давления (СПВД). Умерло 9 детей. В основной группе послеоперационный период протекал легче, проявлений СПВД не было. Умер 1 ребенок. Таким образом, разработанный способ хирургического лечения гастрошизиса может стать операцией выбора при гастрошизисе с ВАД.
Вопрос оптимальной хирургической коррекции гастрошизиса до настоящего времени остается спорным [5, 7, 13, 17, 19]. Большинство хирургов отдает предпочтение первичной пластике местными тканями, дополняя ее мануальным растяжением передней брюшной стенки и удалением кишечного содержимого (1-5,7,10, 12]. Однако осложнения, связанные с повышением внутрибрюшного давления, возникающие у больных с висцероабдоминальной диспропорцией, вынуждают применять различные методики отсроченной пластики и вести поиск новых, более рациональных способов хирургического лечения [5, 6,11, 14].
Целью настоящей работы было сравнение результатов первичной пластики и отсроченной пластики передней брюшной стенки разработанным нами новым способом у больных гастрошиэисом с висцероабдоминальной диспропорцией.
Материал и методы
Работа основана на результатах лечения 46 новорожденных детей с гастрошиэисом, поступивших с
января 1995 по май 2006 года в клинику детской хирургии МУЗ ДГКБ № 5 г. Кемерова.
Новый способ хирургического лечения гастрошизиса исследован у 15 больных гастрошиэисом — основная группа.
Группу сравнения составили 22 новорожденных ребенка с гастрошиэисом, которым проводилась первичная пластика передней брюшной стенки местными тканям и.
Исследование одобрено Комитетом по этике и доказательности медицинских научных исследований ГОУ ВПО Кемеровской государственной медицинской академии. Группы сформированы методом простой рандомизации.
В исследование включены только случаи гастрошизиса с висцероабдоминальной диспропорцией (ВАД). В качестве критериев исключения были приняты: 1. Наличие сопутствующей патологии (сочетан-ные пороки, другие заболевания), которая стала непосредственной причиной смерти больного или существенно повлияла на течение заболевания; 2. Ятроген-ные осложнения, повлиявшие на исход заболевания.
