CC BY
24
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
DOI: 10.23868/202112005
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ МАРКЕРОВ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ И Рй-М В ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ГЛИОМАХ ВЗРОСЛЫХ ПАЦИЕНТОВ
К.А. Сулин, Б.Э. Гальковский, А.А. Петров, Д.В. Рыжкова, П.В. Красношлык, Д.А. Гуляев, И.А. Макаров, О.Н. Гайкова, В.С. Сидорин, Л.Б. Митрофанова
Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург, Россия
Поступила: 01.12.2021 Принята к печати: 25.12.2021 Опубликована on-line: 30.12.2021
IMMUNOHISTOCHEMICAL DETECTION OF STEM CELL MARKERS, TRANSCRIPTION FACTORS AND PDL1 IN MALIGNANT GLIOMAS IN ADULTS PATIENTS
K.A. Sulin, B.E. Galkovsky, A.A. Petrov, D.V. Ryzhkova, P.V. Krasnoshlyk, D.A. Gulyaev, I.A. Makarov, O.N. Gaycova, V.S. Sidorin, L.B. Mitrofanova
Almazov National Medical Research Centre, St. Petersburg, Russia
e-mail: lubamitr@Yandex.ru
Прогноз течения глиобластомы неблагоприятный: 5-летняя выживаемость составляет менее 10%. Практически у всех пациентов наблюдается рецидив после хирургического вмешательства по стандарту лечения: резекция, лучевая терапия и темозоломид. Варианты лечения на сегодняшний день при рецидиве ограничены, и никакая терапия не продлевает жизнь пациентов. Развитие резистентности к терапии связывают с микроокружением и стволовыми клетками опухоли.
Цель: изучить экспрессию маркеров стволовых клеток, факторов транскрипции и PD-L1 в злокачественных глиомах.
В ретроспективное исследование были включены 17 пациентов с глиомами высокой степени злокачественности, подвергшихся хирургическому лечению. Всем пациентам проводили рутинное гистологическое и иммуногистохимическое исследование с антителами к IDH1R132H, BRAF V600E, Ki-67, GFAP, NANOG, Nestin, CD133, SALL4, OCT4, SOX2, CD38, PD-L1, FOXM1; морфометрический анализ с подсчетом среднего соотношения числа клеток с экспрессией антигенов к числу всех опухолевых клеток.
Установлено, что экспрессия NANOG наблюдалась в 47% случаев, Nestin - в 88%, CD133 - в 71%, SOX2 - в 100%, CD38 и FOXM1 — в 65%. SALL4 не экспрессировала ни одна из опухолей, OCT4 — одна. Экспрессию PD-L1 выявили в 2 случаях. Корреляционный анализ установил наличие достоверно значимых связей между экспрессией Nestin и CD133; FOXM1 и NANOG; Nestin и CD38; Ki-67 и SOX2.
Таким образом, наличие экспрессии маркеров стволовых клеток и факторов транскрипции NANOG, Nestin, CD133, CD38, SOX2, FOXM1 в злокачественных глиомах, на наш взгляд, обусловливает необходимость дальнейшего целенаправленного изучения этих молекулярных прризнаков на большей выборке и открывает новые потенциальные мишени для таргетной терапии.
Ключевые слова: глиобластома, иммуногистохимическое исследование, стволовые клетки, факторы транскрипции, PD-L1.
The prognosis of glioblastoma (GLB) is poor: the 5-year survival rate is less than 10%. Almost all patients relapse after surgery according to the standard of treatment: resection, radiation therapy, and temozolomide. Treatment options today for relapse are limited, and no amount of therapy prolongs patients' lives. The development of resistance to therapy is associated with the microenvironment and tumor stem cells.
Objective: to study the expression of stem cell markers, transcription factors and PD-L1 in malignant gliomas.
A retrospective study included 17 patients with high-grade gliomas who underwent surgery. All patients underwent traditional histological examination, immunohistochemical analysis with antibodies to IDH1R132H, BRAF V600E, Ki-67, GFAP, NANOG, Nestin, CD133, SALL4, OCT4, SOX2, CD38, PD-L1, FOXM1, morphomet-ric analysis with calculation of the average ratio cells with antigen expression to the number of all tumor cells.
Expression of NANOG was observed in 47% of cases, Nestin — in 88%, CD133 — in 71%, SOX2 — in 100%, CD38 and FOXM1 — in 65%. None of the tumors expressed SALL4, only one OCT4. PD-L1 expression was detected only in 2 cases. Correlation analysis established the presence of significant associations between the expression of Nestin and CD133; FOXM1 and NANOG; Nestin and CD38; Ki-67 and SOX2.
The presence of expression of stem cell markers and transcription factors NANOG, Nestin, CD133, CD38, SOX2, FOXM1 in malignant gliomas, in our opinion, dictates further targeted study of these markers on a larger sample and opens up new potential targets for targeted therapy.
Keywords: glioblastoma, immunohistochemical study, stem cells, transcription factors, PD-L1.
Введение
Глиобластома (ГБМ) — наиболее часто встречающаяся первичная злокачественная опухоль центральной нервной системы, характеризующаяся крайне агрессивным биологическим поведением, высокой частотой рецидивов и, как правило, ассоциированная с неблагоприятным прогнозом. Уровень заболеваемости ГБМ составляет 0,59-3,69 на 100000 человек во всем мире, со средним возрастом возникновения 63 года [1, 2]. Несмотря на постоянно ведущиеся исследования по лечению ГБМ, за последние 10 лет значительных успехов достигнуто не было, и медиана продолжительности жизни этих пациентов по-прежнему составляет 12-15 месяцев с момента постановки диагноза [3, 4]. Стандартом лечения больных на сегодня остается максимально доступная
хирургическая резекция опухоли, лучевая терапия, химиотерапия алкилирующими препаратами [5, 6]. Поддержание онкологического процесса и развитие резистентности к терапии связывают с микроокружением и стволовыми клетками ГБМ [7]. Учитывая неблагополучные прогнозы данного заболевания, в последние годы все больше исследований посвящено изучению возможностей и поиску эффективных мишеней для иммунотерапии [8]. В 2021 году вышла новая классификация Всемирной организации здравоохранения, в соответствии с которой ГБМ с IDHI-мутацией называется астроцитомой Grade 4, а ГБМ — ГБМ^ (дикий тип) [9].
Охарактеризован ряд молекулярных маркеров этой опухоли. CD133 (проминин-1) впервые был обнаружен как маркер клеточной поверхности гемопоэтических
стволовых клеток [10]. В головном мозге плода человека CD133 является маркером нейральных стволовых клеток. Экспрессия CD133 также наблюдается в промежуточных радиальных глиальных клетках головного мозга в раннем постнатальном периоде и в клетках эпендимы у взрослых. Нейрогенные астроциты в области нервных стволовых клеток субвентрикулярной зоны не экспрес-сируют CD133.
Описан кластер стволовых клеток, характеризующийся экспрессией маркеров эмбриональных структур и незрелой нервной ткани, включая Nestin, SOX2, SALL4, OCT4, STAT3, NANOG и c-Myc. Считается, что эти клетки обладают значительно большей дифференциальной свободой по сравнению с клетками CD133+ или CD44+ [11].
NANOG — гомеодоменный белок, участвующий в поддержании потенциала эмбриональных стволовых клеток и самообновления. За некоторыми исключениями, NANOG не экспрессируется в тканях взрослого человека, хотя он был обнаружен в базальных клетках многослойного эпителия мышей. Однако, он функционирует в клетках многих опухолей, таких как глиомы высокой степени злокачественности, карциномы толстой кишки, предстательной железы и желудка.
Nestin — белок промежуточных филаментов, экспрес-сируемый в нейрональных клетках-предшественницах и реактивных астроцитах, а также в некоторых других клетках организма. Nestin был обнаружен во многих ГБМ, а дифференцировка клеток этой опухоли приводит к подавлению его синтеза.
Гены SOX представляют собой семейство транскрипционных кофакторов, участвующих в контроле разнообразных процессов развития. К настоящему времени у млекопитающих описано более 20 генов этого семейства. Они обеспечивают паттерны экспрессии во время развития различных клеток и тканей, особенно во время эмбриогенеза. На ранних стадиях эмбрионального развития у мышей и куриц гены SOX 1-3 экспрессируются в центральной нервной системе и подавляются, при выходе нервных клеток из клеточного цикла и начинают дифференцироваться [12].
CD38 имеется на различных типах клеток, включая клетки миелоидного генеза. Известно также, что этот белок выявлен на 25% макрофагов ГЛБ. Данные in vivo свидетельствуют о снижении роста глиомы и увеличении выживаемости мышей в эксперименте при потере CD38 из микроокружения опухоли. В эпоху таргетной терапии этот белок может стать потенциальной мишенью, особенно с учетом доступности даратумумаба (одобренное FDA моноклональное антитело против CD38) [13, 14]. Более того, его экспрессия была обнаружена и на самих опухолевых клетках некоторых ГБМ [15].
FOXM1 повсеместно экспрессируется в эмбрионе, но его колическтво снижается в клетках дифференцированных. FOXM1 участвует в самообновлении и пролиферации стволовых клеток, включая нервные стволовые клетки и эпителиальные клетки-предшественницы, и является ключевым регулятором клеточного цикла как при переходе от G1 к S-фазе, так и при переходе к митозу. FOXM1 важен для сегрегации хромосом, а потеря FOXM1 вызывает амплификацию центросом и митотическую катастрофу. FOXM1 значительно повышен в большинстве опухолей человека и сопровождает онкогенез во многих типах тканей. При злокачественной глиоме FOXM1 является компонентом сигнального Wnt/p-катенинового пути, играющего ключевую роль в туморогенезе [16].
SALL4 — фактор транскрипции, содержащий так называемые «цинковые пальцы», является членом
семейства генов SALL и расположен в 20 хромосоме. SALL4 у людей играет ключевую роль в поддержании плюрипотентности и характеристик самообновления эмбриональных и гемопоэтических стволовых клеток. Экспрессия этого фактора транскрипции была обнаружена в различных опухолях, включая острый миелоидный лейкоз человека, а также в раке легких, печени, желудка и эндометрия. Исследования показали, что активация различных семейств микроРНК подавляет рост клеток глиомы и других опухолей посредством воздействия на SALL4 [17].
OCT4 (POUF51, OCT3/4) является еще одним транскрипционным фактором, необходимым для поддержания плюрипотентности клеток. Сверхэкспрессия ОСТ4 отмечается во многих солидных опухолях, в том числе глиомах. OCT4 работает синергетически с SOX2, регулируя транскрипцию, а гетеродимеры OCT4/ SOX2 для индуцировании транскрипции связываются с проксимальной областью промотора NANOG. SOX2, OCT4 и NANOG совместно занимают промоторные области по крайней мере 353 генов, а NANOG — более 90% промоторных областей в эмбриональных стволовых клетках человека [18].
За последнее десятилетие иммунотерапия, направленная на PD-1/PD-L1, сделала ряд замечательных прорывов в улучшении прогноза трудно поддающихся лечению опухолей, включая плоскоклеточный рак, немелкоклеточный рак легких, карциному желудка, уротелиальный рак, меланому, и вошла в стандартную клиническую практику [19]. Недавно была документирована экспрессия PD-L1 на клетках глиомы [20]. Однако, вопрос о том, коррелирует ли экспрессия PD-L1 с прогнозом у пациентов с ГБМ, остается неразрешенным.
Таким образом, экспрессия различных маркеров опухолевых стволовых клеток и факторов транскрипции является актуальной проблемой, открывающей новые потенциальные горизонты для понимания онкогенеза ГБМ и новых стратегий терапии.
Цель исследования: изучить экспрессию маркеров стволовых клеток, факторов транскрипции и PD-L1 в злокачественных глиомах для подбора новых стратегий таргетной терапии
Материал и методы
В ретроспективное исследование были включены 17 пациентов (8 мужчин и 9 женщин в возрасте от 38 до 76 лет). Из них 2 с глиосаркомами, 2 — с астро-цитомами Grade 4 (IDH1+), 13 — с ГБМ (IDH1 «-»), проходивших хирургическое лечение в ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» (Санкт-Петербург). Всем пациентам проводились традиционное гистологическое исследование парафиновых срезов с окраской гематоксилином и эозином, иммуногистохимический анализ с антителами к IDH1R132H, BRAF V600E, Ki-67, GFAP, NANOG, Nestin, CD133, SALL4, OCT4, SOX2, CD38, PD-L1, FOXM1 (табл. 1), морфометрический анализ с подсчетом среднего соотношения числа клеток с экспрессией антигенов к числу всех опухолевых клеток в поле зрения при увеличении 200 (суммарно в 10 полях зрения в каждом препарате). Использовались микроскоп Leica DM 4000, видеокамера Leica DFC 490 (Германия), анализатор изображения LeicaScopeM. На проведение исследовательской работы получено разрешение Комитета по вопросам этики при ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» (протокол № 224 от 10 декабря 2018). Статистический анализ полученных данных осуществлялся с использованием программного обеспечения
Рис. 1. Глиобластома ЮН1 «-» представлена полиморфными атипичными глиальными клетками с обилием митозов; пациент 59 лет. Окраска гематоксилин и эозин. Ув. х100
SPSS Statistics 20 (США). При оценке нормальности распределения методом Шапиро-Уилка закону распределения подчинялись только возраст, Nestin, SOX2, Ki-67. Для описания статистик использовали медиану и квартили, а не среднее значение.
Результаты
Медиана возраста пациентов на момент операции составила 62 года. У 14 пациентов опухоль была выявлена впервые (13 ГБМ и 1 глиосаркома без экспрессии IDH1R132H), у 3 пациентов был выявлен продолженный рост опухоли и проведена предшествующая адъювант-ная химио- и (или) лучевая терапия (2 астроцитомы Grade 4 с экспрессией IDH1R132H и 1 ГБМ без экспрессии IDH1R132H с прогрессией в глиосаркому через 1 год; табл. 2).
Наиболее часто опухоль локализовалась в лобной доле (6 случаев), затем теменной (4 случая), височной (3 случая) и затылочной долях (1 случай). В остальных клинических наблюдениях опухоль занимала 2 и более доли или распространялась за пределы полушария (3 случая).
При гистологическом исследовании во всех 17 случаях было выявлено соответствие морфологическим критериям злокачественной глиомы Grade 4: резко выраженная атипия опухолевых глиальных клеток с обилием атипичных митозов (рис. 1), некрозами, в том числе палисадными, клубочками сосудистых пролифе-ратов. В 2 случаях на основании преобладания саркоматозного компонента во всех полях зрения и отсутствия в нем GFAP (рис. 2) была диагностирована глиосаркома, еще в одном — эпителиоидная ГБМ. Последняя опухоль состояла из однотипных атипичных, крупных клеток с выраженной эозинофильной цитоплазмой и ассиме-трично расположенным ядром. Опухоль экспрессиро-вала BRAF V600E.
Экспрессия NANOG наблюдалась в 8 из 17 случаев (в 47% случаев). При этом она встречалась в 1 — 100% клеток опухоли и присутствовала в 2 глиосаркомах и 1 астроцитоме Grade 4. В глиосаркомах NANOG экс-прессировался в глиальном и саркоматозном компонентах (рис. 3).
Экспрессия Nestin наблюдалась в 15 случаях (88%) на 5-100% опухолевых клеток (рис. 4А). В 2 оставшихся случаях этот маркер экспрессировался только на клетках сосудов. Еще в 2 случаях ГБМ (из 15) — на опухолевых клетках и сосудах, в 2 случаях — на сосудах и клетках опухоли, контактирующих с сосудами (эффект кооптации; см. рис. 4Б).
Экспрессия CD133 была выявлена в 12 случаях (71%) на мембранах 1-73% клеток (см. рис. 4В). Эффект кооптации наблюдался в 1 случае. Максимальное число клеток имело этот маркер в одной из глиосарком.
SALL4 не был характерен ни для одной из представленных опухолей.
OCT4 экспрессировался фокально в 1 % клеток опухоли только в одном случае глиосаркомы (6%; см. рис. 4Г).
SOX2 экспрессировался во всех случаях на подавляющем большинстве клеток (см. рис. 4Д). В 3 случаях он выявлялся и на сосудистых клетках.
CD38 экспрессировался в 11 случаях (65%) в 1-80% опухолевых клеток (рис. 4Е). В 6 случаях выявлялась очаговая экспрессия, в 1 — эффект кооптации.
FOXM1 экспрессировался также в 11 случаях (65%) в 1-95% опухолевых клетках (см. рис. 4Ж).
Экспрессию PD-L1 выявили только в 2 случаях (12%; см. рис. 4З): в 1% клеток ГБМ и 30% клеток астроцитомы Grade 4.
Эффект кооптации опухолевых клеток с сосудистой стенкой в одной опухоли сопровождался экспрессией какого-либо одного маркера в этих клетках.
Рис. 2. Глиосаркома: в саркоматозном компоненте отсутствует ЭРДР; пациент 57 лет. Иммуногистохимическая реакция с антителами к ЭРДР; продукт реакции коричневого цвета. Докраска: гематоксилин. Ув. х100
Таблица 1. Характеристики используемых антител
№ Антитело Клон Разведение Производитель Страна изготовления Визуализационная система Положительный контроль
1 IDH1R132H H09 1:15 Dianova GmbH Германия Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System ЮН-мутантные астроцитомы
2 BRAFV600E RM8 1:50 RevMab Biosciences США Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Цитоплазматическое окрашивание клеток меланомы
3 Ki-67 MIB-1 1:50 Dako Дания Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Ядерное окрашивание эпителия толстой кишки
4 GFAP G-A-5 1:200 Sigma-Aldrich Co. LLC США Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Цитоплазматическое окрашивание астроцитов
5 NANOG Ab70482 1:100 Abcam Великобритания Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Ядерное окрашивание в клетках бластоцисты мыши
6 Nestin SP103 1:100 Abnova Тайвань Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Цитоплазматическое окрашивание эндотелия
7 CD133 MBS462020 1:400 MyBioSource США Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Мембранное окрашивание эпителия канальцев почки
8 SALL4 EE-30 1:100 Santa Cruz Biotechnology США Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Ядерное окрашивание гепатоцитов человека
9 OTC4 MRQ-10 1:200 Cell Marque США Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Ядерная экспрессия в клетках семиномы
10 SOX2 N1C3 1:50 GeneTex США Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Ядерная экспрессия в клетках злокачественной рабдоидной опухоли
11 CD38 SP149 1:50 Sigma-Aldrich Co. LLC США Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Мембранное окрашивание плазмоцитов
12 PD-L1 Ab205921 1:25 Abcam Великобритания Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Цитоплазма клеток миндалин человека
13 FOXM1 G-5 1:800 Santa Cruz Biotechnology США Mouse/Rabbit UnoVue HRP/ DAB Detection System Ядерная экспрессия в плоскоклеточном раке головы и шеи
Рис. 3. Глиосаркома: 1\1Д1\ЮЗ в клетках опухоли; пациент 57 лет. Иммуногистохимическая реакция с антителами к 1\1Д1\1О3; продукт реакции коричневого цвета. Докраска: гематоксилин. Ув. х200
Таблица 2. Иммуногистохимические маркеры изученных опухолей
№ , диагноз, наличие IDH-мутации, пол,
Иммуногистохимические маркеры. Количество клеток опухоли, экспрессирующих маркеры (в процентах)
возраст (в годах) NANOG Nestin CD133 SALL4 OCT4 SOX2 CD38 FOXM1 PD-L1 Ki-67
№ 1, глиосаркома, IDH1 «-», М, 57 100 80 5 0 1 90 2 90 0 35
№ 2, ГБМ, IDH1 «-», Ж, 62 0 100 1 0 0 100 0 10 0 16
№ 3, ГБМ, IDH1 «-», М, 38 7 10 1 0 0 93 10 15 1 15
№ 4, эпителиоидная ГБМ, IDH1 «-», М, 67 1 80 1 0 0 90 24 0 0 20
№ 5, ГБМ, IDH «-», Ж, 71 30 0 0 0 0 75 90 10 0 33
№ 6, ГБМ, IDH1 «-», М, 59 0 80 10 0 0 80 0 0 0 39
№ 7, ГБМ, IDH1 «-», М, 51 0 20 0 0 0 85 0 10 0 31
№ 8, ГБМ, IDH1 «-», Ж, 51 0 20 0 0 0 70 15 1 0 20
№ 9, ГБМ, IDH1 «-», Ж, 71 50 30 0 0 0 75 0 10 0 31
№ 10, ГБМ, IDH1 «-», Ж, 75 0 50 2 0 0 75 35 7 0 33
№ 11, ГБМ, IDH1 «-», Ж, 76 0 10 1 0 0 90 20 0 0 25
№ 12, ГБМ, IDH1 «-», М, 64 20 0 0 0 0 90 5 50 0 25
№ 13, ГБМ, IDH1 «-», Ж, 68 0 80 1 0 0 90 0 0 0 15
№ 14, ГБМ, IDH1 «-», М, 70 0 5 1 0 0 90 80 70 0 19
№ 15, астроцитома Grade 4, IDH1 «+», Ж, 60 0 30 1 0 0 80 0 0 30 21
№ 16, астроцитома Grade 4, IDH1 «+», Ж, 65 10 30 1 0 0 100 35 95 0 30
№ 17, глиосаркома, IDH1 «-», М, 56 33 93 73 0 0 95 1 0 0 25
Статистический анализ показал, что наибольшее число клеток в злокачественных глиомах экспресси-ровало БОХ2 [см. табл. 2), но достоверной разницы по уровню экспрессии изучаемых маркеров не отмечалось [рис. 5).
Корреляционный анализ установил наличие достоверно значимых положительных и отрицательных связей
между экспрессией Nestin и CD133; FOXM1 и NANOG; Nestin и CD38; Ki-67 и SOX2 [рис. 6).
Таким образом, в злокачественных глиомах была найдена экспрессия SOX2, FOXM1, Nestin, NANOG, CD38, CD133 [в меньшей степени). Выработка OCT4 и PD-L1 наблюдалась в единичных случаях, а SALL4 не выявлялся.
a'VJi 'f't- т-* - - v. "-'Ж'""
' /
Лл'
: ' vX -
fs.. г-.- -v ■ ■
'>2 15
n ■ -i-
Рис. 4. Иммуногистологическая характеристика злокачественных глиом: А — Nestin в клетках глиосаркомы; Б — Nestin в клетках глиобластомы, контактирующих со стенками сосудов; В — CD133 на мембранах клеток глиобластомы; Г — OCT4 в клетках глиосаркомы; Д — SOX2 в глиосаркоме; Е — CD38 на клетках глиобластомы с эффектом кооптации; Ж — ядерное расположение FOXM1 в клетках глиосаркомы; З — PD-L1 на клетках глиобластомы; продукт реакции коричневого цвета. Докраска: гематоксилин. Ув.: А, В, Г, Е, З х200; Б, Д, Ж х100
120
100
40
20
0
NANOG Nestin CD133 SOX2 CD38 FOXM1 Ki-67 Рис. 5. Морфометрическая характеристика злокачественных глиом при иммуногистохимическом исследовании
Таблица 3. Статистические показатели морфометрической оценки иммуногистохимических маркеров изученных опухолей
Показатели NANOG Nestin CD133 SOX2 CD38 FOXM1 Ki-67
Медиана 0,05 30 0,1 90 7,5 8,5 25
Верхний квартиль 27,5 80 1,8 92,3 32,3 28,5 32,5
Нижний квартиль 0 6,3 0 80 0 0 20
Б
В
80
60
Рис. 6. Корреляционные связи между изученными иммуногистохимическими маркерами злокачественных глиом
Обсуждение
Экспрессию 1\1Д1\1ОО мы наблюдали в половине случаев. В глиомах этот белок необходим для роста и соотносится с ее инвазивностью [21]. Механизм функционирования 1\1Д1\ЮО до конца не изучен. В различных системах он может работать как активатор транскрипции или репрессор [22]. В исследовании, посвященном изучению экспрессии маркеров стволовых клеток при назофарингиальной карциноме, была отмечена положительная корреляция между экспрессией 1\1Д1\ЮО и РОХМ1, что подтверждается нашими данными у пациентов с глиальными опухолями [23].
В свою очередь известно, что уровень экспрессии РОХМ1 в ткани глиомы человека напрямую коррелирует со степенью злокачественности опухоли и обратно — с выживаемостью пациента. На моделях ГБМ у животных было показано, что повышенная экспрессия ГОХМ1 в клетках глиомы увеличивает их пролифера-тивную активность, онкогенность, инвазивность и стимулирует ангиогенез. Этот фактор транскрипции способствует неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток предположительно за счет снижения экспрессии белка гена мишени р27К1р1 и увеличения транскрипции Бкр2, циклина 01, ММР-2 и УБЭР [24]. Более того, Гальковский Б.Э. и соавт. показали, что повышенная экспрессия ГОХМ1 отмечается не только в самой опухоли, но и в перифокальной зоне (зоне роста) [25].
Экспрессия 00133 в анапластических астроцитомах и мультиформных ГБМ варьирует среди пациентов
и степени опухолевой дифферецировки по разным данным от 0 до 64% [26]. В нашем исследовании она наблюдалась у 71% пациентов. CD133+ клетки способны к многолинейной дифференцировке и обладают высоким потенциалом к формированию нейросфер. Они экспрес-сируют высокие уровни генов нейральны стволовых клеток, таких как Nestin, Msi-1, MELK и CXCR4 [27]. Поэтому логична значимая положительная корреляция между Nestin и CD133, выявленная в нашем исследовании и показанная другими авторами. Большое количество CD133+ стволовых клеток повышает гетерогенность опухоли и ассоциировано с худшим прогнозом выживаемости [28], равно как и коэкспрессия Nestin и CD133 [29].
В то же время известно, что Nestin+ нейрональные стволовые клетки вызывают глиомы у мышей, являющихся генетическими моделями, после трансдукции онкогенами [30]. Хотя эти клетки в некоторых случаях могут образовывать онкосферы in vitro, ни одно исследование на сегодняшний день не продемонстрировало их способность самостоятельно воспроизводить опухоль человека in vivo. Имеются данные, что сверхэкспрессия Nestin коррелирует с глиомами более высокой степени злокачественности и более низкими показателями выживаемости пациентов, в то время как другие исследователи показали, что экспрессия этого белка не влияет на прогноз пациента [31-33].
Обратная корреляция между Nestin и CD38, обнаруженная нами, может объясняться активацией одного из факторов и преобладании его роли на определенной стадии опухолевого процесса. Считается, что CD38 имеет важное значение в активации микроглии в микроокружении глиомы [34]. Более того, исследование, посвященное эффективности анти-CD38 моно-колональных антител в комбинации с темозоломидом, продемонстрировало значительное усиление прямого апоптотического эффекта препарата и индукцию комплемент-зависимой и антителозависимой кле-точно-опосредованной цитотоксичности независимо от присутствия микроглии. Наконец, комбинация темозоламида с даратумумабом была протестирована на модели ксенотрансплантации ГБМ человека in vivo со значительным увеличением выживаемости (комбинация против группы монотерапии — 98,13 ± 1,88 против 63,63 ± 3,77 дня, p <0,001) [35].
Интересно, что SOX2 экспрессировался во всех наших случаях подавляющим большинстом клеток. Обратная корреляция между Ki-67 и SOX2, обнаруженная нами, остается не до конца понятной и требует дальнейшего изучения на большей группе пациентов.
Несмотря на сообщения о вкладе SALL4 и OCT4 [36] в развитие и поддержание опухолевого процесса, в нашем исследовании была зарегистрирована экспрессия маркера OCT4 всего в 1% клеток только в одном случае (глиосаркомы), а SALL4 не экспрессировался.
Физиологически основная функция белков запрограммированной клеточной гибели PD-1 заключается в ограничении противоопухолевой активности Т-клеток и усилении активации Treg, которые уменьшают реакцию Т-клеток и защищают от гипериммунных реакций. Взаимодействие PD-1 со своим лигандом PD-L1 поддерживает иммунологический гомеостаз и защищает от аутоиммунитета. Блокирование одного из звеньев этого процесса вызывает апоптоз или истощение активированных иммунных клеток, что в свою очередь может усиливать противоопухолевую активность.
Уровень экспрессии белка PD-L1 варьирует в разных исследованиях глиом от 6 до 100%. В этих работах есть существенные различия в размерах выборки, возрасте
больных, соотношении различных степеней злокачественности, методах подготовки биоматериала, используемых антителах и стандартах диагностики, включая паттерны экспрессии и их пороговые значения [37]. В нашем исследовании, к сожалению, экспрессия PD-L1 была выявлена лишь в 2 случаях (12%): в 1% и 30% клеток глиом Grade 4.
Учитывая неоспоримый вклад активации маркеров стволовых клеток, факторов транскрипции и PD-L1 в жизненном цикле опухолевой стволовой клетки данные маркеры могли бы служить новыми терапевтическими мишенями в иммунотерапии ГБМ. Недавние исследования, посвященные разработке С0133-специфических химерных антигенных рецепторов Т-клетки (CAR-T) — CART133, продемонстрировали активность в отношении CD133+ клеток, полученных от пациентов с ГБМ, и на моделях ксенотрансплантатов опухоли, не вызывая побочных эффектов в отношении нормальных CD133+ гемопоэтических стволовых клеток человека [38].
Несмотря на активное развитие исследований в области иммуноонкологии, на сегодня единственными опциями, достоверно увеличивающими продолжительность, качество жизни пациента и период его автономности, остается адекватно спланированная, максимально допустимая, безопасная резекция опухоли с проведением адъювантной химио- и лучевой терапии. Открытие и изучение ключевых точек в развитии опухолевой стволовой клетки ГБМ является перспективным направлением для создания новых эффективных стратегий терапии.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Ostrom Q.T., Gittleman H., Fulop J. et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2008-2012. J. Neurooncol. 2015; 17(4): 1-62.
2. Darlix A., Zouaoui S., Rigau V. et al. Epidemiology for primary brain tumors: a nationwide population-based study. J. Neurooncol. 2017; 131(3): 525-46.
3. Stupp R., Hegi M.E., Mason W.P. et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol. 2009; 10(5): 459-66.
4. Stupp R., Mason W.P., van den Bent M.J. et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 2005; 352(10): 987-96.
5. Reardon D.A., Brandes A.A., Omuro A. et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in Patients With Recurrent Glioblastoma: The CheckMate 143 Phase 3 Randomized Clinical Trial. JAMA Oncol. 2020; 6(7): 1003-10.
6. Nabors L.B., Portnow J., Ammirati M. et al. NCCN Guidelines Insights: Central Nervous System Cancers, Version 1.2017. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 2017; 15(11): 1331-45.
7. Lathia J.D., Mack S.C., Mulkearns-Hubert E.E. et al. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 2015; 29(12): 1203-17.
8. Lim M., Xia Y., Bettegowda C. et al. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2018; 15(7): 422-42.
9. Louis D.N., Perry A., Wesseling P. et al. The 2021 WHO Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. J. Neurooncol. 2021; 23(8): 1231-51.
10. Miraglia S., Godfrey W., Yin A.H. et al. A novel five-transmembrane hematopoietic stem cell antigen: isolation, characterization, and molecular cloning. Blood 1997; 90(12): 5013-21.
11. Bryukhovetskiy I., Ponomarenko A., Lyakhova I. et al. Personalized regulation of glioblastoma cancer stem cells based on biomedical technologies: From theory to experiment (Review). Int. J. Mol. Med. 2018; 42(2): 691-702.
12. Schmitz M., Temme A., Senner V. et al. Identification of SOX2 as a novel glioma-associated antigen and potential target for T cell-based immunotherapy. Br.J. Cancer 2007; 96(8): 1293-301.
13. Levy A., Blacher E., Vaknine H. et al. CD38 deficiency in the tumor microenvironment attenuates glioma progression and modulates features of tumor-associated microglia/macrophages. J. Neurooncol. 2012; 14(8): 1037-49.
14. Aulakh S., Manna A., Schiapparelli P. et al. CD38-targeted therapy in glioblastoma: A step foreward. J. of Clinical Oncology 2018; 36: 15.
15. Гальковский Б.Э., Митрофанова Л.Б., Лахина Ю.С. и соавт. Иммуногистохимическое исследование белков Prox1, CD133 и CD38 в глиобластомах вентрикулярно-субвентрикулярной зоны
Заключение
Наличие экспрессии маркеров стволовых клеток и факторов транскрипции NANOG, Nestin, CD133, CD38, SOX2, FOXM1 в злокачественных глиомах, на наш взгляд, диктует дальнейшее целенаправленное изучение этих маркеров на большей выборке и открывает новые потенциальные мишени для таргетной терапии.
Ограничения исследования: исследованная выборка насчитывает всего 17 пациентов со злокачественными глиомами, среди которых есть IDH1-мутантные опухоли и глиосаркомы, а у 3 больных — продолженный рост опухоли.
Благодарности
Исследование выполнено за счёт и в рамках темы государственного задания ФГБУ «НМИЦ ВА. Алмазова» «Разработка радиофармпрепаратов для диагностики ней-роэндокринных опухолей», рег. номер 3 2021-2023 г.
Вклад авторов
Все авторы участвовали в разработке концепции и дизайна исследования, в проверке интеллектуального содержания, производили анализ и интерпретацию данных, окончательное утверждение рукописи к публикации. Авторы согласны нести ответственность за все аспекты работы, заверяют о добросовестном выполнении любой части предоставленного исследования. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
и их влияние на продолжительность жизни пациентов. Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова 2020; 27(1): 75-85. [Galkovsky B.E., Mitrofanova L.B., Lakhina Y.S. et al. Immunohistochemical study of Prox1, CD133 and CD38 proteins in glioblastomas of the ventricular-subventricular zone and their effect on the life expectancy of patients. Medical University named after academician I.P. Pavlova 2020; 27(1): 75-85].
16. Zhang N., Wei P., Gong A. et al. FoxM1 promotes p-catenin nuclear localization and controls Wnt target-gene expression and glioma tumorigen-esis. Cancer Cell 2011; 20(4): 427-42.
17. Chen L.P., Zhang N.N., Ren X.Q. et al. miR-103/miR-195/miR-15b Regulate SALL4 and Inhibit Proliferation and Migration in Glioma. Molecules 2018; 23(11): 2938.
18. Wu Y., Sun B., Shi W. et al. OCT4 is up-regulated by DNA hypometh-ylation of promoter in recurrent gliomas. Neoplasma 2016; 63(3): 378-84.
19. Hao C., Chen G., Zhao H. et al. PD-L1 Expression in Glioblastoma, the Clinical and Prognostic Significance: A Systematic Literature Review and Meta-Analysis. Front. Oncol. 2020; 10: 1015.
20. Berghoff A.S., Kiesel B., Widhalm G. et al. Programmed death ligand 1 expression and tumour-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. J. Neurooncol. 2015; 17(8): 1064-75.
21. Zbinden M., Duquet A., Lorente-Trigos A. et al. NANOG regulates glioma stem cells and is essential in vivo acting in a cross-functional network with GLI1 and p53. EMBO J. 2010; 29: 2659-74.
22. Kuciak M., Mas C., Borges I. et al. Chimeric NANOG repressors inhibit glioblastoma growth in vivo in a context-dependent manner. Sci. Rep. 2019; 9(1): 3891.
23. Luo W., Gao F., Li S. et al. FoxM1 Promotes Cell Proliferation, Invasion, and Stem Cell Properties in Nasopharyngeal Carcinoma. Front. Oncol. 2018; 8: 483.
24. Gong A., Huang S. FoxM1 and Wnt/-Catenin Signaling in Glioma Stem Cells. Cancer Research 2012; 72(22): 5658-62.
25. Гальковский Б.Э., Митрофанова Л.Б., Гуляев Д.А. и соавт. Иммуногистохимическое исследование транскрипционных факторов NeuroD1, Prox1, FoxM1, соматостатиновых, а также CXCR4^ CD38-рецепторов в глиобластомах в целях разработки новых подходов для таргетной терапии. Молекулярная медицина 2020; 18(2): 44-50. [Galkovsky B.E., Mitrofanova L.B., Gulyaev D.A. et al. Immunohistochemical study of transcription factors NeuroD1, Prox1, FoxM1, somatostatin, as well as CXCR4 and CD38 receptors in glioblastomas in order to develop new approaches to targeted therapy. Molecular Medicine 2020; 18(2): 44-50].
26. Singh S.K., Hawkins C., Clarke I.D. et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 2004; 432(7015): 396-401.
27. Liu G., Yuan X., Zeng Z. et al. Analysis of gene expression and chemore-sistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol. Cancer 2006; 5: 67.
28. Zhang Q., Xu B., Chen J. et al. Clinical significance of CD133 and Nestin in astrocytic tumor: The correlation with pathological grade and survival. J. Clin. Lab. Anal. 2020; 34(3): 23082.
29. Zhang M., Song T., Yang L. et al. Nestin and CD133: valuable stem cell-specific markers for determining clinical outcome of glioma patients. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2008; 27(1): 85.
30. Ludwig K., Kornblum H.I. Molecular markers in glioma. J. Neurooncol. 2017; 134(3): 505-12.
31. Dahlrot R.H., Hermansen S.K., Hansen S. et al. What is the clinical value of cancer stem cell markers in gliomas? Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2013; 6(3): 334-48.
32. Bradshaw A., Wickremsekera A., Tan S.T. et al. Cancer Stem Cell Hierarchy in Glioblastoma Multiforme. Front. Surg. 2016; 3: 21.
33. Xie L., Zeng X., Hu J. et al. Characterization of Nestin, a Selective Marker for Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells. Int. J. Stem Cells 2015; 2015: 762098.
34. Blacher E., Ben Baruch B., Levy A. et al. Inhibition of glioma progression by a newly discovered CD38 inhibitor. Int. J. Cancer 2015; 136(6): 1422-33.
35. Alak M., Sonikpreet A., Asher C. et al. Therapeutic targeting of CD38 enhances temozolomide activity in glioblastoma cells and modulates their tumor microenvironment by eliciting an enhanced CD8+ T cell response. J. of Immunology 2020; 204(1): 91.
36. Yang J., Gao C., Chai L. et al. A Novel SALL4/OCT4 Transcriptional Feedback Network for Pluripotency of Embryonic Stem Cells. PLoS ONE 2010; 5(5): 10766.
37. Xue S., Hu M., Iyer V. et al. Blocking the PD-1/PD-L1 pathway in glioma: a potential new treatment strategy. J. Hematol. Oncol. 2017; 10(1): 81.
38. Vora P., Venugopal C., Salim S.K. et al. The Rational Development of CD133-Targeting Immunotherapies for Glioblastoma. Int. J. Stem Cells 2020; 26(6): 832-44.
