CC BY
25
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616.419-003.219:546.221
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СЕРОВОДОРОДСОДЕРЖАЩЕГО ГАЗА © Овсянникова О.А.
Астраханский государственный медицинский университет, Россия, 414000, Астрахань, ул. Бакинская, 121
Резюме
Цель. Процессы, которые происходят в костном мозге имеют важное значение. Поскольку костный мозг является одним из главных органов кроветворной системы, который способствует созданию новых клеток крови взамен погибающих и отмирающих. Основная цель работы заключается в иммуногистохимической характеристике костного мозга на примере Вах, Ю-67 при хроническом воздействии субтоксических доз сероводородсодержащего газа.
Методы. Эксперимент проведен на 40 белых беспородных крысах-самцах. Были сформированы группы 2-х видов: I - контрольные, II - подвергающиеся воздействию серосодержащих поллютантов. Каждый вид состоял из четырех групп по 5 особей в каждой, животные в которых находились на тех же этапах индивидуального развития, что и люди на протяжении постнатального онтогенеза.
Результаты. Автором были выявлены иммуногистохимические особенности костного мозга крыс при хроническом воздействии природным сероводородсодержащим газом в субтоксической концентрации. С помощью различных антител к Вах, Ю-67 оценено состояние костного мозга крыс на различных этапах постнатального онтогенеза.
Заключение. Обнаружено, что наиболее значимым проявлением эксперимента явилась интенсификация апоптоза, проявляемое посредством увеличением проапоптогенного белка (Вах), снижением индекса пролиферации (Ю-67) на всех этапах онтогенеза экспериментальных животных.
Ключевые слова: костный мозг, Вах, Ю-67, сероводородсодержащий газ
IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISTIC OF THE BONE MARROW WITH THE IMPACT OF SULFUR-CONTAINING GAS Ovsyannikova O.A.
Astrakhan State Medical University, 121, Bakinskaja St., 414000, Astrakhan, Russia Abstract
Objecive. The processes that occur in the bone marrow are important since the bone marrow is one of the main organs of the hematopoetic system, which promotes the creation of new blood cells to substitute the dead or dying ones. The main aim of the study was to assess the immunohistochemical characteristics of the bone marrow on the example of Bax, Ki-67 with chronic exposure to sub-toxic doses of hydrogen sulphide-containing gas.
Methods. The experiment was carried out on 40 white mongrel male rats. Groups of two types were formed: I - control group, II - group exposed to sulfur-containing pollutants. Each species contained four groups of 5 individuals in each. The individual development of the animals corresponed to the people's postnatal ontogenesis stages.
Results. The author revealed immunohistochemical features of the bone marrow of rats during chronic exposure to natural hydrogen sulphide-containing gas at the sub-toxic concentration. With the help of various antibodies to Bax, Ki-67, the bone marrow of rats was assessed at various stages of postnatal ontogenesis.
Conclusion. It was found that the most significant manifestation of the experiment was the intensification of apoptosis, characterized by an increase in the proapoptogenic protein (Bax), a decrease in the proliferation index (Ki-67) at all stages of ontogenesis in the experimental animals.
Keywords: bone marrow, Bax, Ki-67, hydrogen sulphide-containing gas
Введение
Клеточное равновесие в нормальном кроветворении подчиняется закону клеточной кинетики: в единицу времени в периферическую кровь поступает и погибает в ней одно и тоже количество клеток [10, 4]. Клетки красного костного мозга интересны с точки зрения моделирования самообновляющейся клеточной популяции на основе общего предшественника - стволовой клетки. Сам по себе процесс клеточного деления очень сложен и таит в себе немало опасностей, связанных с возникновением и закреплением соматических мутаций. Чтобы избежать этого, в организме существует система генетического самоконтроля клеток. Если произошел сбой, пролиферация временно останавливается. Если повреждение не удается исправить, включается программа клеточной гибели, которая не позволяет мутантным клеткам размножаться [13, 3].
Процесс пролиферации и дифференцировки регулируется различными факторами роста и большим количеством цитокинов [5]. В отсутствии этих факторов, клетки, вступившие на определенный этап развития, погибают, в них запускаются механизмы гибели [1].
Литературные данные свидетельствуют, что феномен апоптоза является результатом действия различных факторов, приводящих к гибели клетки [12, 7]. Важным звеном патогенеза апоптоза у лиц занятых на производстве газодобычи является дисбаланс окислительного метаболизма [8, 11].
Методика
Эксперимент проведен на 40 белых беспородных крысах-самцах. Были сформированы группы двух видов: I - контрольные, II - подвергающиеся воздействию серосодержащих поллютантов. Каждый вид состоял из 4-х групп по 5 особей в каждой, животные в которых находились на тех же этапах индивидуального развития, что и люди на протяжении постнатального онтогенеза (табл. 1).
Таблица 1. Соответствие сроков развития экспериментальных животных в соответствии периодами постнатального онтогенеза человека_
Человек Лабораторные крысы
Период Период Возраст (сутки онтогенеза)
Детский возраст Неполовозрелый 6-36
Взрослый возраст, I период Зрелый I 368-398
Взрослый возраст, II период Зрелый II 472-502
Пожилой возраст Предстарческий 700-730
Примечание: * - таблица построена по данным, приведенным в работах Западнюк В.И., Западнюк Е.А., 1983 [11] и Гелашвили О. А., 2008 [12]
В экспериментах использовалась концентрация природного газа в газовоздушной смеси камеры, составляющая 90±3 мг/м3 при измерении по сероводороду, что в 30 раз больше предельно допустимой концентрации сероводорода для рабочих зон при одновременном присутствии углеводородов. Концентрация сероводорода в затравочной камере Курляндского измерялась индикаторными трубками фирмы «Auer» (Германия).
В процессе эксперимента были учтены требования к его условиям и необходимой концентрации газа, отраженные в издании ВОЗ «Принципы и методы оценки токсичности химических веществ» (1981), «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003). После фиксации извлеченных органов 10% нейтральным забуференным формалином приготовлены парафиновые блоки. В работе использовались антитела и система детекции фирмы SpringBioscience (США). При проведении иммуногистохимических исследований использовались стекла фирмы Menzel-Glaser (Германия) с поли-Ь-лизиновым покрытием Thermo Scientific (США), что гарантировало фиксацию срезов даже после долгого нахождения их во влажной камере (в течение 3 сут.). Нами изучено иммуногистохимическим методом содержание проапоптогенного белка - Вах в разных возрастных группах в норме и при субтоксическом воздействии серосодержащих поллютантов. Выявлен белок Ki-67 и вычислен индекс
пролиферации (%) путем подсчета количества иммунопозитивных ядер к общему количеству ядер (подсчет производился не менее чем в 10 полях зрения).
Анализ гистологических и иммуногистохимических микропрепаратов проводили с помощью светооптического исследовательского микроскопа «Биолам-И» с высокоразрешающей цветной камерой «ТСА-9.0 Color» и программным обеспечением «TSView» для цифровой микроскопии.
Результаты исследования и их обсуждение
При анализе проапоптогенного белка Вах выявлено, что в молодой подгруппе животных определяется слабоположительная реакция на данный белок, преимущественно в компактном веществе костной ткани. Губчатое вещество содержит единичные клетки с признаками изучаемого маркера.
По мере старения животных активность проапоптотических белков усиливается (рис.1-А). Определяется положительная реакция на Вах во всех структурных компонентах костной ткани: как в компактном, так и в губчатом веществе. После воздействия субтоксическими дозами серосодержащими поллютантами происходит активация проапоптогенных белков во всех изучаемых подгруппах (рис. 1-Б).
VW
Рис. 1. Реакция на Вах в губчатом веществе костного мозга. А - средне-положительная реакция в предстарческой подгруппе. Б - сильно-положительная реакция в молодой подгруппе на фоне субтоксического воздействия сероводородсодержащим газом. Ув. х 20
Цикл деления или пролиферации клеток можно разделить на две основные «сверочные точки» (checkpoints) S и M и две подготовительные точки - G1 и G2. Патология в одной или нескольких этих фазах, контролирующих клеточный цикл, лежит в основе формирования злокачественных опухолей и их прогрессирования в инвазивные формы. S точка определяется как момент репликации ДНК. Полностью дублированные хромосомы разделяются в ядра каждой из 2 дочерних клеток во время митоза в точку M. Во время G1 и G2 фаз происходит синтез клеточных белков, необходимых для осуществления соответствующей фазы клеточного деления [9].
Универсальным маркером для оценки клеточного цикла является белок Ki-67, по экспрессии которого можно исследовать пролиферативную активность клеток. Антитела к Ki-67 выявляют пролиферирующие клетки, находящиеся в разных фазах цикла. Это наиболее надежный и четкий маркер пролиферации. Антиген Ki-67, представляет собой короткоживущий протеин, он разрушается в течение 1,5-2 ч. Поэтому, антитела к Ki-67 выявляют только делящиеся клетки, так как Ki-67 не успевает накапливаться и не остается в покоящихся клетках [15].
При изучении гистологических препаратов во всех экспериментальных подгруппах отмечался высокий индекс пролиферации [6]. Наибольший регистрировался в молодой подгруппе. На всех изучаемых полях зрения определялись Ki-67-позитивные клетки (рис. 2). После воздействия природным газом индекс пролиферации снизился, выраженность иммуногистохимической реакции уменьшилась, особенно в предстарческой подгруппе животных. Это говорит о том, что на
фоне относительно невысокой интенсивности регенераторных процессов, действие экзогенных поллютантов угнетает пролиферативную активность структур костного мозга.
■ г i -I - ; ■. L/ ;
v * - >* Л ,
1 1 а I.V.- гr.-tl
Рис. 2. Положительная Ki-67 реакция в клетках красного костного мозга в молодой подгруппе животных. Ув. х 20
Заключение
Таким образом, выявленные изменения изучаемых иммуногистохимических маркеров полностью согласуются с полученной автором гистологической картиной костного мозга. При хроническом воздействии сероводородсодержащим газом в костном мозге происходит преобладание апоптоза над пролиферацией. Действие экзогенных поллютантов угнетает пролиферативную активность структур костного мозга и зависит от этапа онтогенетического развития. При изучении гистологических препаратов было выявлено, что во всех экспериментальных подгруппах отмечался высокий индекс пролиферации. Последнее является подтверждением того, что действие экзогенных поллютантов угнетает пролиферативную активность структур костного мозга.
Литература (references)
1. Абдрашитова А.Т., Панова Т.Н., Белолапенко И.А., Френкель М.В. Действие хронической сероводородной интоксикации и вредных привычек на активность процессов апоптоза у работников газодобывающего предприятия // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2013. - Т.45, №1. - С. 75-77. [Abdrashitova A.T., Panova T.N., Belolapenko I.A., Frenkel' M.V. Vestnik Volgogradskogo gosudarstvennogo medicinskogo universiteta. Bulletin of Volgograd State Medical University. - 2013. - V.45 N1. - P. 75-77. (in Russian)]
2. Арешидзе Д.А., Тимченко Л.Д., Снисаренко Т.А., Козлова М.А. Особенности пролиферативной, апоптической и некротической активности в печени крыс разного возраста при регенерации // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». - 2012. - №2. -С. 5-10. [Areshidze D.A., Timchenko L.D., Snisarenko T.A., Kozlova M.A. Vestnik Moskovskogo gosudarstvennogo oblastnogo universiteta. Serija «Estestvennye nauki». Bulletin of Moscow State Regional University. Series "Natural Sciences". - 2012. - N2. - С. 5-10. (in Russian)]
3. Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста. -М.: РУДН, 2008. - 109 с. [Babichenko I.I., Kovjazin V.A. Novye metody immunogistohimicheskoj diagnostiki opuholevogo rosta. New methods of immunohistochemical diagnosis of tumor growth. - Moscow: RUDN. -109 p. (in Russian)]
4. Блохин, Д.Ю. «Постгеномный взгляд» на проблемы онкогенеза. Клиническая онкогематология. - 2009. -Т.2, №3. - C. 277-282. [Blohin, D.Ju. Klinicheskaja onkogematologija. Clinical oncohematology. - 2009. - V.2, N3. - C. 277-282. (in Russian)]
5. Ведина Л.А., Шурлыгина A.B., Сенников C.B. и др. Колониеобразующая активность клеток кишечника // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике:
Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. - Новосибирск, 2006. - С. 17-20. [Vedina L.A., Shurlygina A.B., Sennikov C.B. i dr. Immunopatogenez i immunoterapija osnovnyh zabolevanij cheloveka: ot jeksperimenta k klinike: Materialy 7-j otchetnoj konferencii GU NIIKI SO RAMN. Immunopathogenesis and immunotherapy of the main human diseases: from experiment to the clinic: Proceedings of the 7th Reporting Conference of the NIIKI SB RAMS. - Novosibirsk, 2006. - Р. 17-20. (in Russian)]
6. Владимирская Е.Б. Апоптоз и его роль в регуляции клеточного равновесия // Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - №11. - С. 25-32. [Vladimirskaja E.B. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. Clinical laboratory diagnostics. - 2002. - N11. - P. 25-32. (in Russian)]
7. Гелашвили О.А. Вариант периодизации биологически сходных стадий онтогенеза человека и крысы // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2008. - T.4, №22. - C.125-126. [Gelashvili O.A. Saratovskij nauchno-medicinskij zhurnal. Saratov Journal of Medical Scientific Research. - 2008. - V.4, N22. - P. 125-126. (in Russian)]
8. Зайнуллин В.Г., Москалев А.А. Роль апоптоза в возрастныхпатологиях. Онтогенез. - 2001. - Т.4, №32. -С. 245-251. [Zajnullin V.G., Moskalev A.A. Ontogenez. Ontogenesis. - 2001. - V.4, N32. - P. 245-251. (in Russian)]
9. Залесский, В.Н., Великая, Н.В. Механизмы цитотоксических эффектов активных молекул кислорода и развитие апоптоза. Современные проблемы токсикологии. - 2003. - №1. - C. 11-17. [Zalesskij, V.N., Velikaja, N.V. Sovremennye problemy toksikologii. Modern problems of toxicology. - 2003. - N1. - P. 11-17. (in Russian)]
10. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. - Киев: Вища школа, 1983. - 381 с. [Zapadnjuk, I.P., Zapadnjuk, V.I., Zaharija, E.A. Laboratornye zhivotnye. Laboratory animals. - Kyiv: Vishha shkola, 1983. - 318 p. (in Russian)]
11. Иванова А. А., Дейгин В.И., Владимирская Е.Б. и др. Влияние тимических пептидов на апоптоз клеток крови человека // Гематология и трансфузиология. - 2000. - Т.45, №4. - С. 9-10. [Ivanova A.A., Dejgin V.I., Vladimirskaja E.B. i dr. Gematologija i transfuziologija. Hematology and Transfusiology. - 2000. - V.45, N4. - С. 9-10. (in Russian)]
12. Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н. Апоптоз - основные механизмы развития и роль в онкологической практике // Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. Н.Т. Райхлина. -Казань: Слово, 2000. - C. 250-265. [Reichlin N.T., Reichlin A.N. Rukovodstvo po immunogistohimicheskoj diagnostike opuholej cheloveka / Pod red. N.T. Reichlin. Guidelines for immunohistochemical diagnosis of human tumors / Ed. N.T. Reichlin. - Kazan: Slovo, 2000. - P. 250-265. (in Russian)]
13. Резаев A.A., Кудрявцева Е.В., Надеждина И.Н. Интенсивность свооднорадикального окисления у рабочих АГПЗ в зависимости от производственного стажа // Болезни рабочих: Материалы Всероссийской научно-практической конференции - Оренбург, 2001. - C. 105-107. [Rezaev A.A., Kudrjavceva E.V., Nadezhdina I.N. Bolezni rabochih: Materialy Vserossijskoj nauchno-prakticheskoj konferencii. Illnesses of workers: Materials of the All-Russian Scientific and Practical Conference. - Orenburg, 2001. - P. 105-107 (in Russian)]
14. Сибиряк С., Капулер О.М., Курчатова Н.Н. и др. Апоптоз и иммунная система // Медицинский Вестник Башкортостана. - 2006. -T.1, №1. - C. 127-133. [Sibiryak S., Kapuler O.M., Kurchatova N.N. i dr. Apoptoz i immunnaja Sistema. Apoptosis and the immune system. - 2006. -V.1, N1. - P. 127-133. (in Russian)]
15. Суханова Г.А., Акбашева О.Е. Апоптоз. - Томск: Изд-во ТПУ, 2009. - 172 с. [Suhanova G.A., Akbasheva O.E. Apoptoz. Apoptosis. - Tomsk: Izd-vo TPU, 2009. - 172 р. (in Russian)]
Информация об авторе
Овсянникова Ольга Александровна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической физиологии ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России. E-mail: olga.ovsyannikova@ubogazici.in
