Иммуногистохимическая характеристика костного мозга при воздействии сероводородсодержащего газа Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Морфология и патология

УДК 616.419

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СЕРОВОДОРОДСОДЕРЖАЩЕГО ГАЗА

© 2017 О.А. Овсянникова

ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Астрахань

Процессы, которые происходят в костном мозге имеют важное значение. Поскольку костный мозг является одним из главных органов кроветворной системы, который способствует созданию новых клеток крови взамен погибающих и отмирающих. Основная цель работы заключается в иммуногистохимической характеристике костного мозга на примере Вах, Ki-67 при хроническом воздействии субтоксических доз сероводородсодер-жащего газа. Автором были выявлены иммуногистохимические особенности костного мозга крыс при хроническом воздействии природным сероводородсодержащим газом в субтоксической концентрации. С помощью различных антител к Вах, Ki-67 оценено состояние костного мозга крыс на различных этапах постнатального онтогенеза. Обнаружено, что наиболее значимым проявлением эксперимента явилась интенсификация апоптоза, проявляемое посредством увеличением проапоптогенного белка (Вах), снижением индекса пролиферации (Ki-67) на всех этапах онтогенеза экспериментальных животных.

Ключевые слова: костный мозг, Вах, Ki-67, сероводородсодержащий газ.

Введение. Клеточное равновесие в нормальном кроветворении подчиняется закону клеточной кинетики: в единицу времени в периферическую кровь поступает и погибает в ней одно и то же количество клеток [1, 2]. Клетки красного костного мозга интересны с точки зрения моделирования самообновляющейся клеточной популяции на основе общего предшественника - стволовой клетки. Сам по себе процесс клеточного деления очень сложен и таит в себе немало опасностей, связанных с возникновением и закреплением соматических мутаций. Чтобы избежать этого, в организме существует система генетического самоконтроля клеток. Если произошел сбой, пролиферация временно останавливается. Если повреждение не удается исправить, включается программа клеточной гибели, которая не позволяет му-тантным клеткам размножаться [3, 4].

Процесс пролиферации и дифференцировки регулируется различными факторами роста и большим количеством цитокинов [5]. В отсутствии этих факторов, клетки, вступившие на определенный этап развития, погибают, в них запускаются механизмы гибели [6].

Литературные данные свидетельствуют, что феномен апоптоза является результатом действия различных факторов, приводящих к гибели клетки [7, 8]. Важным звеном патогенеза апоптоза у лиц, занятых на производстве газодобычи является дисбаланс окислительного метаболизма [9, 10].

Материалы и методы. Эксперимент проведен на 40 белых беспородных крысах-самцах. Были сформированы группы двух видов: I - контрольные; II - подвергающиеся воздействию серосодержащих поллютантов. Каждый вид состоял из четырех групп по 5 особей в каждой,

животные в которых находились на тех же этапах индивидуального развития, что и люди на протяжении постнатального онтогенеза (табл. 1). В экспериментах использовалась концентрация природного газа в газовоздушной смеси камеры, составляющая 90 ± 3 мг/м3 при измерении по сероводороду, что в 30 раз больше предельно допустимой концентрации сероводорода для рабочих зон при одновременном присутствии углеводородов. Концентрация сероводорода в затравочной камере Курляндского измерялась индикаторными трубками фирмы "Auer" (Германия). В процессе эксперимента были учтены требования к его условиям и необходимой концентрации газа, отраженные в издании ВОЗ «Принципы и методы оценки токсичности химических веществ» (1981), «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003). После фиксации извлеченных органов 10 % нейтральным забуференным формалином приготовлены парафиновые блоки. В работе использовались антитела и система детекции фирмы SpringBioscience (США). При проведении иммуногистохимических исследований использовались стекла фирмы Menzel-Glaser (Германия) с поли-Ь-лизиновым покрытием Thermo Scientific (США), что гарантировало фиксацию срезов даже после долгого нахождения их во влажной камере (в течение 3 суток). Нами изучено иммуногистохимическим методом содержание проапопто-генного белка - Вах в разных возрастных группах в норме и при субтоксическом воздействии серосодержащих поллютантов. Выявлен белок Ki-67 и вычислен индекс пролиферации (%) путем подсчета количества иммунопозитивных ядер к общему количеству ядер (подсчет производился не менее чем в 10 полях зрения). Анализ гистологических и иммуногистохи-мических микропрепаратов проводили с помощью светооптического исследовательского микроскопа «Биолам-И» с высокоразрешающей цветной камерой «ТСА-9.0 Color» и программным обеспечением «TSView» для цифровой микроскопии.

Таблица 1

Соответствие сроков развития экспериментальных животных в соответствии с периодами постнатального онтогенеза человека

Человек Лабораторные крысы

Период Период Возраст (сутки онтогенеза)

Детский возраст Неполовозрелый 6-36

Взрослый возраст, I период Зрелый I 368-398

Взрослый возраст, II период Зрелый II 472-502

Пожилой возраст Предстарческий 700-730

Таблица 1 построена по данным, приведенным в работах Западнюк В.И., Западнюк Е.А., 1983 [11]; Гелашвили О.А., 2008 [12].

Результаты исследования и их обсуждение. При анализе проапоптогенного белка Вах выявлено, что в молодой подгруппе животных определяется слабоположительная реакция на данный белок, преимущественно в компактном веществе костной ткани. Губчатое вещество содержит единичные клетки с признаками изучаемого маркера.

По мере старения животных активность проапоптотических белков усиливается (рис. 1). Определяется положительная реакция на Вах во всех структурных компонентах костной ткани как в компактном, так и в губчатом веществе.

*

Рис. 1. Среднеположительная реакция на Вах в губчатом веществе костного мозга в предстарческой подгруппе лабораторных животных. Ув.*20

После воздействия субтоксическими дозами серосодержащими поллютантами происходит активация проапоптогенных белков во всех изучаемых подгруппах (рис. 2).

> ш

! В * *

V С тЬяГг 1 г 4

Рис. 2. Сильноположительная реакция на Вах в структурах костного мозга в молодой подгруппе животных на фоне субтоксического воздействия сероводородсодержащим газом. Ув.*20

Цикл деления или пролиферации клеток можно разделить на две основные «сверочные точки» (checkpoints) S и M и две подготовительные точки - G1 и G2. Патология в одной или нескольких этих фазах, контролирующих клеточный цикл, лежит в основе формирования злокачественных опухолей и их прогрессирования в инвазивные формы. S точка определяется как момент репликации ДНК. Полностью дублированные хромосомы разделяются в ядра каждой из 2 дочерних клеток во время митоза в точку M. Во время G1 и G2 фаз происходит синтез клеточных белков, необходимых для осуществления соответствующей фазы клеточного деления [13].

Универсальным маркером для оценки клеточного цикла является белок К1-67, по экспрессии которого можно исследовать пролиферативную активность клеток. Антитела к К1-67 выявляют пролиферирующие клетки, находящиеся в разных фазах цикла. Это наиболее надежный и четкий маркер пролиферации. Антиген К1-67 представляет собой короткоживущий протеин, он разрушается в течение 1,5-2 часов. Поэтому антитела к К1-67 выявляют только делящиеся клетки, так как К1-67 не успевает накапливаться и не остается в покоящихся клетках [14].

При изучении гистологических препаратов во всех экспериментальных подгруппах отмечался высокий индекс пролиферации [15]. Наибольший регистрировался в молодой подгруппе. На всех изучаемых полях зрения определялись Кь67-позитивные клетки (рис. 3). После воздействия природным газом индекс пролиферации снизился, выраженность имму-ногистохимической реакции уменьшилась, особенно в предстарческой подгруппе животных. Это говорит о том, что на фоне относительно невысокой интенсивности регенераторных процессов, действие экзогенных поллютантов угнетает пролиферативную активность структур костного мозга.

Р ! -л г' *

V* *

ш

Г Р

л

ГФ

Рис. 3. Положительная К1-67 реакция в клетках красного костного мозга в молодой подгруппе животных. Ув.*20

Заключение. Выявленные изменения изучаемых иммуногистохимических маркеров полностью согласуются с полученной автором гистологической картиной костного мозга. При хроническом воздействии сероводородсодержащим газом в костном мозге происходит преобладание апоптоза над пролиферацией. Действие экзогенных поллютантов угнетает пролиферативную активность структур костного мозга и зависит от этапа онтогенетического развития. При изучении гистологических препаратов автором выявлено, что во всех экспериментальных подгруппах отмечался высокий индекс пролиферации. Это показывает то, что действие экзогенных поллютантов угнетает пролиферативную активность структур костного мозга.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Владимирская Е.Б. Апоптоз и его роль в регуляции клеточного равновесия // Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - № 11. - С. 25-32.

2 Иванова А. А., Дейгин В.И., Владимирская Е.Б. и др. Влияние тимических пептидов на апоптоз клеток крови человека // Гематология и трансфузиология. - 2000. - № 45 (4). - С. 9-10.

3 Блохин Д.Ю. «Постгеномный взгляд» на проблемы онкогенеза // Клиническая онкогематология. - 2009. -№ 2 (3). - С. 277-282.

4 Арешидзе Д. А., Тимченко Л. Д., Снисаренко Т.А. и др. Особенности пролиферативной, апоптической и некротической активности в печени крыс разного возраста при регенерации // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». - 2012. - № 2. - С. 5-10.

5 Ведина Л.А., Шурлыгина A.B., Сенников C.B. и др. Колониеобразующая активность клеток кишечника. Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике // Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. - Новосибирск, 2006. - С. 17-20.

6 Суханова Г. А., Акбашева О.Е. Апоптоз. - Томск: Изд-во ТПУ, 2009. - 172 с.

7 Зайнуллин В.Г., Москалев А.А. Роль апоптоза в возрастных патологиях // Онтогенез. - 2001. - № 32 (4). -С. 245-251.

8 Залесский В.Н., Великая Н.В. Механизмы цитотоксических эффектов активных молекул кислорода и развитие апоптоза // Современные проблемы токсикологии. - 2003. - № 1. - С. 11-17.

9 Резаев A.A., Кудрявцева Е.В., Надеждина И.Н. Интенсивность свободнорадикального окисления у рабочих АГПЗ в зависимости от производственного стажа // Материалы Всеросс.науч.-практ.конф. - Оренбург, 2001, Т. 2. - С. 105-107.

10 Абдрашитова А.Т., Панова Т.Н., Белолапенко И.А. и др. Действие хронической сероводородной интоксикации и вредных привычек на активность процессов апоптоза у работников газодобывающего предприятия // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2013. - № 1 (45). - С. 75-77.

11 Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. - Киев : Вища школа, 1983. - 381 с.

12 Гелашвили О. А. Вариант периодизации биологически сходных стадий онтогенеза человека и крысы // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2008. - № 22 (4). - С. 125-126.

13 Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста. -М. : РУДН, 2008. - 109 с.

14 Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н. Апоптоз - основные механизмы развития и роль в онкологической практике. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - Казань, 2000. - С. 250-265.

15 Сибиряк С., Капулер О.М., Курчатова Н.Н. и др. Апоптоз и иммунная система // Медицинский Вестник Башкортостана. - 2006. - № 1 (1). - С. 127-133.

Рукопись получена: 2 ноября 2017 г.

Принята к публикации: 10 ноября 2017 г.