CC BY
87
© Коллектив авторов, 2019
Сомов А.Н.1, Дубровский А.В.2, Дунайцев И.А.1, Иванов С.А.1, Комбарова Т.И.1, Кочеткова О.Ю.2, Кравченко Т.Б.1, Титарева Г.М.1, Тихоненко С.А.2, Пинчук А.С.1, Фирстова В.В.1, Дентовская С.В.1
Иммуногенные свойства полиэлектролитных микрокапсул, нагруженных антигенами Francisella tularensis или Yersinia pestis
1 ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», 142279, Московская область, п. Оболенск, Россия
2 ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики» РАН, 142290, Московская область, г. Пущино, Россия
Резюме. Для современных вакцинных препаратов нужны новые лекарственные формы, например, полиэлектролитные микрокапсулы, которые пока недостаточно изучены в отношении пригодности для вакцин. Авторы получили прототипы вакцинных препаратов против чумы и туляремии на основе, соответственно, рекомбинантного капсульного антигена Cafl Yersinia pestis и кислотонерастворимого антигенного комплекса (КНК) Francisella tularensis, инкапсулированных в биосовместимые и биодеградируемые полиэлектролитные микросферы. Оба антигена получены в Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии (п. Оболенск). Микрокапсулирование проводили методом соосаждения антигенов с карбонатом кальция и последующего послойного нанесения разнозаряженных декстрана сульфата и полиаргинина на кальций-карбонатную матрицу. В экспериментах с использованием белых нелинейных мышей и мышей линии BALB/c изучали реакцию иммунной системы, определяя титры антител в сыворотке крови и экспрессию маркеров активации иммунокомпетентных клеток. Для оценки протективного действия препаратов иммунизированных мышей заражали вирулентными штаммами возбудителя чумы Y. pestis 231 или туляремии F. tularensis 503. Препараты не оказывали токсического действия на мышей, индуцируя специфический иммунитет, обеспечивающий частичную протективность против заражения чумой или туляремией. Отмечено, что антигены, связанные с твердым носителем (гель гидроокиси алюминия либо полиэлектролитные микросферы), оказывали более выраженное стимулирующее действие на иммунную систему вакцинируемых животных. Авторы указывают на перспективность полиэлектролитных микрокапсул для создания вакцинных препаратов.
Ключевые слова: микрокапсулированные вакцинные препараты; полиэлектролиты; чума; туляремия; гуморальный и клеточный иммунитет; протективный эффект
Статья поступила 17.06.2019. Принята в печать 16.08.2019.
Для цитирования: Сомов А.Н., Дубровский А.В., Дунайцев И. А., Иванов С. А., Комбарова Т.И., Кочеткова О.Ю., Кравченко Т.Б., Титарева Г.М., Тихоненко С. А., Пинчук А.С., Фирстова В.В., Дентовская С.В. Иммуногенные свойства полиэлектролитных микрокапсул, нагруженных антигенами Francisella tularensis или Yersinia pestis. Иммунология. 2019; 40 (5): 52-61. doi: 10.24411/0206-4952-2019-15006.
Финансирование. Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Сомов Алексей Николаевич -кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник отдела особо опасных инфекций ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Московская область, п. Оболенск, Россия E-mail: somov@obolensk.org ttp://orcid.org/0000-0002-4490-0567
Somov A.N.1, Dubrovsky A.V.2, Dunaytsev I.A.1, Ivanov S.A.1, Kombarova T.I.1, Kochetkova O.Yu.2, Kravchenko T.B.1, Titareva G.M.1, Tikhonenko S.A.2, Pinchuk A.S.1, Firstova V.V.1, Dentovskaya S.V.1
Immunogenic properties of polyelectrolyte microcapsules loaded with Francisella tularensis or Yersinia pestis antigens
1 State Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology, 142279, Obolensk, Moscow region, Russia
2 Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, RAS, 142290, Pushchino, Moscow region, Russia
Abstract. The modern vaccine preparations need new safe and effective formulations, such as polyelectrolyte microcapsules, but this formulation is not studied enough to decide about its suitability in vaccines. The authors developed vaccine preparations on a base of purified antigens of the infection agents Y. pestis and F. tularensis, namely recombinant capsular Cafl antigen and so-called acid-non-soluble tularemia complex antigen (ANCA), separately microencapsulated into the bio-compatible and bio-degradable polyelectrolyte microspheres. The antigens were obtained in the SRC for Applied Microbiology and Technology (Obolensk). A technique of co-precipitation antigens together with calcium carbonate and following layer-after-layer adsorption of the oppositely charged dextran sulfate and polyarginine onto the calcium carbonate matrix was used in the micro-encapsulation process. BALB/c and outbread mice were used in the immunization experiments. The mice were challenged with the virulent strains of the plague Y. pestis 231 or the tularemia F. tularensis 503, and the reactions of the immune system were studied including antibodies titers in the sera and expression of the immune competent cells activation markers, as far as protective effect of the immunization. The preparations were not toxic, and were capable to induce specific immunity at the level providing protectivity in some cases of the plague or tularemia challenge. The antigens associated with solid carrier such as aluminum hydroxide gel or polyelectrolyte microspheres, were more effective in the mice immunization. Authors consider polyelectrolyte microcapsules as promising delivery vehicle for vaccines
Keywords: micro-encapsulated vaccine preparations; polyelectrolytes; plague; tularemia; humoral and cell immunity; protective effect
Received 17.06.2019. Accepted 16.08.2019.
For citation: Somov A.N., Dubrovsky A.V., Dunaytsev I.A., Ivanov S.A., Kombarova T.I., Kochetkova O.Yu., Kravchenko T.B., Titareva G.M., Tikhonenko S.A., Pinchuk A.S., Firstova V.V., Dentovskaya S.V. Immunogenic properties of polyelectrolyte microcapsules loaded with Francisella tularensis or Yersinia pestis antigens. Immunologiya. 2019; 40 (5): 52-61. doi: 10.24411/0206-4952-2019-15006.
Funding. The work was supported by the Sectorial Scientific Program of the Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing.
For correspondence
Somov Alexey N. - PhD (physical chemistry), Senior Research Scientist of the State Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russia E-mail: somov@obolensk.org ttp://orcid.org/0000-0002-4490-0567
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Введение
Последние десятилетия в вакцинологии отмечены активными поисками новых форм вакцинных препаратов направленного действия, обладающих минимальными побочными эффектами. Считается, что такие препараты можно получить только в случае «химических» (молекулярных, субъединичных) вакцин четко охарактеризованного состава, главной слабостью которых остается недостаточная иммуногенность и протективность, связанная с вынужденными ограничениями в спектре использованных антигенов. Одним из подходов к повышению эффективности субъединичных вакцин является микрокапсулирование (инкапсулирование), благодаря которому снижается деградация входящих в состав антигенов и повышается фагоцитарная активность анти-ген-презентирующих клеток. Кроме того, показано, что некоторые микрокапсулы могут обладать свойствами адъюванта [1]. Адъювантными свойствами обладают, в частности, полиэлектролиты, несущие в водных растворах электрический заряд, и эти свойства усиливаются в случае их организации в микрочастицы размером 5 мкм и менее [2-4]. Инкапсулирование антигенов в полиэлектролитные оболочки - многообещающий, но недостаточно исследованный на сегодняшний день метод микрокапсулирования [5]. Такие частицы можно
получить из безвредных биодеградируемых материалов и нагрузить антигенами в количестве, необходимом для индукции иммунного ответа [2, 6, 7]. Технология полиэлектролитных нано- и микрокапсул в настоящее время достаточно проста и включает синтез неорганической матрицы в виде сфероидных агрегатов кристаллов карбоната кальция либо другого подходящего соединения, послойное нанесение (адсорбцию) разнозаряженных полиэлектролитов из соответствующих водных растворов и растворение неорганического ядра микрокапсул. «Загрузку» микрокапсул белковым антигеном можно проводить одновременно с формированием неорганического ядра (копреципитация) либо адсорбцией из водных растворов [7]. Ограниченное количество созданных к настоящему времени вакцинных препаратов на основе полиэлектролитных микрокапсул (ПЭМК) не позволяет однозначно говорить о пригодности данного подхода для создания новых вакцинных препаратов направленного действия [5].
Цели настоящего исследования - получение полиэлектролитных микрокапсул, содержащих антигены Francisella tularensis или Yersinia pestis, и изучение их иммуномодулирующих и протективных свойств на модели экспериментальной туляремийной и чумной инфекции у мышей.
Кислотонерастворимый антигенный комплекс (КНК) F. tularensis представляет собой сложную смесь белков, липополисахаридов и нуклеиновых кислот с массовым соотношением компонентов 49 : 5 : 25 %, соответственно [8]. В воде КНК образует слегка опалесцирующий коллоидный раствор. Ранее мы показали, что иммунизация КНК способна полностью защитить мышей от гибели при подкожном введении вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, но не от вирулентного штамма F. tularensis 503 [8].
Капсульный антиген Cafl (F1) возбудителя чумы Y. pestis, белок с молекулярной массой около 17 кДа, в высоких концентрациях в водных растворах склонный к образованию тетрамеров и олигомеров более высокого порядка [9]. Cafl является одним из основных про-тективных антигенов Y. pestis [10, 11] и обязательным компонентом большинства чумных вакцин [12-14].
Материал и методы
Материалы. Для приготовления буферных и технологических растворов в процессе получения ПЭМК применяли отечественные реактивы степени чистоты «хч» и соответствующие им по чистоте импортные. Для получения полиэлектролитных микрокапсул использовали сульфат декстрана с молекулярной массой 15 кДа, полиаргинина гидрохлорид 70 кДа и полилизин 70-120 кДа (Sigma Aldrich, Германия). Для растворения кальций-карбонатного ядра ПЭМК применяли 0,2 М растворы двунатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Sigma, США).
Бактериальные штаммы. Штаммы F. tularensis 503 и Y. pestis 231 были получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».
Антигены. КНК получали путем закисления осветленного лизата штамма F. tularensis 15 НИИЭГ до рН 4,5 [8]. Секретируемый капсульный антиген Caf1 выделяли методом осаждения из надосадочной фракции бульонной культуры генно-инженерного штамма-продуцента Yersinia pseudotuberculosis EV11M/ pFSK3 с последующей хроматографической очисткой белка [15].
Электрофоретические методы исследования. Вертикальный электрофорез в 12,5% полиакриламидном геле проводили в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) по стандартной методике Лэммли с последующим окрашиванием Coomassie R 250 (Sigma Aldrich, Германия). Молекулярные массы белков определяли с помощью программы PhotoCaptMw.
Приготовление ПЭМК. ПЭМК готовили путем послойной адсорбции разнозаряженных полимерных веществ на ядрах из карбоната кальция с последующим растворением твердой матрицы в 0,2 М растворе этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), как описано ранее [6, 7]. Первым слоем и следующими нечетными слоями адсорбировали поликатион (ПК) (полиаргинин либо полилизин), вторым и следующими четными слоями (всего до 6 слоев) - полианион (ПА) (декстрана сульфат, ДС)
с молекулярными массами 70 и 15 кДа соответственно. В одном из препаратов на 6-й слой (декстрана сульфат) дополнительно адсорбировали слой полиаргинина. Таким образом, структура оболочки ПЭМК описывалась формулой (ПК/ПА)3 либо (ПК/ПА)3ПК.
Включение антигенов в ПЭМК проводили способом копреципитации из смеси растворов КНК или Cafl с карбонатом натрия [7]. Величину включения антигенов (U) в ПЭМК (в % от исходной массы) рассчитывали по материальному балансу взятого в опыт антигена по формуле:
U = 100 (Mo - Ms) / Mo,
где Mo - исходная (взятая в опыт) масса антигена в мг, Ms - суммарная масса антигена во всех технологических (промывочных) растворах в мг.
Определение содержания антигенов в растворах проводили тремя методами: по оптической плотности суспензии при длине волны 258 нм (антигенный комплекс КНК) или 280 нм (Cafl), модифицированным методом определения общего белка с использованием бицинхониновой кислоты и методом денситоме-трии окрашенной полосы соответствующего антигена в ДСН-ПААГ в сравнении со стандартными образцами с использованием программы анализа изображений Gel Analyser 2010.
Дозу препарата для иммунизации животных в 1 мл суспензии ПЭМК рассчитывали исходя из определенного, как описано выше, количества включенного в ПЭМК антигена по формуле:
D = di • V / (Mo - Ms),
где di - выбранная заранее иммунизирующая доза для одного животного в мг, V - общий объем суспензии препарата в мл.
Контроль включения меченых флюоресцеин изотио-цианатом антигенов [16] в ПЭМК проводили методом люминесцентной микроскопии.
Размеры частиц ПЭМК оценивали визуально при помощи микроскопа с окулярной сеткой и с использованием калибровочного материала - суспензии полистиролового латекса с частицами диаметром 0,8 мкм. Расчет концентрации частиц в суспензии ПЭМК проводили, используя измерения в камере Горяева.
Иммунизация животных. Мышей линии BALB/c иммунизировали двукратно подкожно (п/к) с интервалом 28 сут в верхнюю треть бедра водной суспензией препарата ПЭМК-КНК (30 мкг/мышь). Нелинейным мышам п/к одно- или двукратно вводили препараты: ПЭМК-Caf1 (20 или 50 мкг/мышь); Caf1, сорбированный на геле гидроокиси алюминия (ГГА, Sigma, США) в соотношении 1:10 (20 или 50 мкг/мышь); Caf1 в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР) (20 и 50 мкг/мышь).
Контрольные группы состояли из животных, иммунизированных ПЭМК или ГГА в дозе, равной количеству препарата, вводимого вместе с антигенами.
Через 28 сут после первой или второй иммунизации по 5 животных из каждой группы гуманно умерщвляли ингаляцией СО2, кровь забирали для определения титра специфических антител, а селезенку - для оценки клеточного иммунитета.
Оценка гуморального иммунитета. Титр специфических антител к антигенам КНК или Cafl в сыворотках крови мышей оценивали методом твердофазного имму-ноферментного анализа, как описано ранее [17].
Оценка клеточного иммунитета. Клеточный противочумный и противотуляремийный иммунитет оценивали в опытах in vitro по изменению уровня пролифе-ративной активности выделенных из селезенок мышей лимфоцитов под влиянием Cafl и КНК. Спленоциты получали через 28 сут после одно- или двукратной иммунизации препаратами, инкубировали 7 сут в среде с добавлением КНК (10 мкг/мл) или Cafl (10 мкг/мл). Оценку пролиферативной активности лимфоцитов под влиянием антигенов КНК проводили методом МТТ, а под влиянием Cafl - цитометрическим методом с использованием CFSE-красителя (e-Bioscience, США), при этом индивидуальные пробы объединяли внутри группы мышей. Фенотипирование клеток и оценку пролиферативной активности лимфоцитов проводили на проточном цитофлюориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США), как описано ранее [18].
Кроме того, изучали способность лимфоцитов иммунных мышей активироваться под влиянием препаратов, содержащих КНК F. tularensis. Долю активированных лимфоцитов определяли по маркерам активации клеток, т.е. по увеличению субпопуляции CD69, CD25-позитивных Т-лимфоцитов (CD3+CD4+, CD3+CD8+) и CD19+-В-лимфоцитов, используя меченые флюорох-ромами моноклональные антитела (e-Bioscience, США). Для выявления субпопуляции клеток, способных специфически активироваться под влиянием КНК, сплено-циты выделяли через 28 сут после иммунизации мышей, инкубировали 18 ч в среде с добавлением КНК (10 мкг/мл) или без антигена (контроль), а затем проводили их фенотипирование методом цитометрического анализа. Об активации Т- и В-лимфоцитов свидетельствовало усиление экспрессии на их поверхности маркеров активации CD69 и/или CD25 под влиянием КНК.
Животные. В работе использовали мышей линии BALB/c и беспородных белых мышей (ФИБХ Питомник «Пущино», МО, г. Пущино) обоего пола весом
18-20 г в возрасте 6-8 нед. Работы с животными проводили в соответствии с законодательством Российской Федерации [19] и Директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [20].
Заражение животных. Выживаемость иммунизированных мышей оценивали после подкожного введения вирулентных штаммов Е tularensis 503 (1 ЬБ50 - единичные КОЕ) или Г. pestis 231 (1 ЬБ50 = 2 КОЕ). Животные находились под наблюдением в случае экспериментальной туляремии в течение 14 сут, чумы - 21 сут.
Статистическая обработка. Для обработки результатов использовали стандартные методы математической статистики с вычислением средних арифметических значений величин и среднеквадратических отклонений; для анализа различий между группами применяли ^критерий Стьюдента, дисперсионный анализ, критерий х2 и угловой критерий Фишера, а также непараметрические критерии [21, 22].
Результаты
Физико-химические свойства препаратов ПЭМК
Получены и охарактеризованы по физико-химическим параметрам препараты ПЭМК с капсульным антигеном чумного микроба Са1Т либо антигенным комплексом КНК из вакцинного штамма Е. tularensis 15 НИИЭГ (табл. 1).
Препараты ПЭМК были однородны по размеру. Диаметры частиц варьировали в пределах 3-7 мкм, что должно обеспечивать наиболее эффективный захват макрофагами [1, 5]. В зависимости от состава поверхностного слоя у частиц может преобладать положительный [(ПА/ДС)3ПА] или отрицательный [(ПА/ДС)3] электрический заряд. Во всех препаратах концентрация микрокапсул была одинаковой.
Эффективность включения Са1Т чумного микроба и антигенного комплекса КНК подтверждали с помощью люминесцентной микроскопии препаратов с ФИТЦ-мечеными антигенами (фотографии не приведены). Методами спектрофотометрии и белкового электрофореза было определено, что включение антигена Са1Т в ПЭМК составляло около 80%, а КНК в ПЭМК - не менее 90%.
Токсичность препаратов
Общую токсичность препаратов, содержащих антигены и без них, оценивали по прижизненному наблю-
Таблица 1. Физико-химические свойства препаратов ПЭМК
Препарат Состав Число час- Средний диаметр Концентрация Включение Аг,
тиц в 1 мл частицы, мкм антигена, мг/мл % от исходного
ПЭМК-Cafl (ПЛ/ДС)з 5 • 105 5,0 ± 1,0 1,5 80
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)з 5 • 105 5,0 ± 1,0 1,35 90
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3ПА 5 • 105 5,0 ± 1,0 1,35 90
«Ненагруженные» ПЭМК (ПА/ДС)з 5 • 105 3,0 ± 1,0 0 -
«Ненагруженные» ПЭМК (ПЛ/ДС)з 5 • 105 7,0 ± 2,0 0 -
Примечание. ДС - декстрана сульфат; ПА - полиаргинин; ПЛ - полилизин; (ПА/ДС)3 - три последовательных двойных слоя полиаргинин - декстрана сульфат; (ПА/ДС)3ПА - препарат с дополнительным внешним слоем полиаргинина.
дению за иммунизированными животными. На протяжении 28 сут (срок наблюдения после иммунизации) у животных не выявлены видимые признаки заболевания (интоксикации); масса животных не снижалась, к концу срока наблюдений ее прирост соответствовал приросту массы в контрольной группе, при контрольном вскрытии у мышей отсутствовали видимые патологические изменения.
Иммуногенные и протективные свойства препаратов ПЭМК-КНК
Ни один из изучаемых препаратов КНК после введения мышам однократно в дозе 30 мкг не индуцировал выработки специфических антител на уровне, детектируемом методом ИФА.
Протективное действие препаратов ПЭМК-КНК различного состава оценивали после двукратного введения мышам линии BALB/c в дозе 30 мкг КНК на животное (табл. 2).
Иммунизация препаратом коллоидного раствора КНК не обеспечивала защиту от гибели при заражении вирулентным штаммом F. tularensis 503 в дозах 10 КОЕ и 100 КОЕ, тем не менее средняя продолжительность жизни животных в этой группе составляла 9 сут и в 1,5 раза превышала продолжительность жизни в контрольной группе (достоверное различие на уровне значимости а = 0,05).
Иммунизация препаратом КНК, включенным в микрокапсулы, привела к появлению выживших животных при заражении вирулентным штаммом F. tularensis 503 в дозах 10 КОЕ и 100 КОЕ, и способствовала увеличению средней продолжительности жизни мышей. После заражения вирулентным штаммом F. tularensis 503 в дозе 10 КОЕ выжила половина мышей. При увеличении заражающей дозы F. tularensis 503 до 100 КОЕ все животные данной группы пали, но средняя продолжительность жизни составила 10,5 сут по сравнению с 6 сут в контрольной группе (достоверное различие на уровне значимости а = 0,05). Достоверного различия в продолжительности жизни между экспериментальными группами животных не выявлено. Также статистически недостоверно различие в долях выживших животных между группами, получавшими разные препараты КНК.
Известно, что в защите от возбудителя туляремии наряду с гуморальным ответом важную роль играют кле-
точные реакции иммунитета, что было показано ранее в целом ряде исследований [23-26]. Цитометрическими методами мы проанализировали изменение функциональной активности лимфоцитов под влиянием КНК. Согласно полученным результатам, под влиянием КНК F. tularensis происходила активация Т- и В-лимфоцитов, о чем свидетельствовало усиление экспрессии на их поверхности маркеров активации CD69 и/или CD25 (рис. 1).
На диаграммах представлены результаты измерения объединенных образцов для каждой из исследованных групп животных после двукратной иммунизации.
Цитометрический анализ показал, что без антигена доля активированных В-лимфоцитов, несущих маркеры CD19+CD69+, составила 1,6 ± 0,5% от общего количества. Под влиянием КНК процентное содержание активированных В-лимфоцитов увеличилось во всех группах мышей: в группе мышей, иммунизированных коллоидным раствором КНК, процентное содержание активированных В-лимфоцитов CD19+CD69+ составило 6,9 ± 1,1%; в группе мышей, иммунизированных ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3, - 14,6 ± 0,8%, в группе мышей, иммунизированных ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3 ПА, - 23,8 ± 3,2%, а в группе неиммунизированных мышей - 8,6 ± 0,7%. Таким образом, наблюдались статистически достоверное увеличение (уровень значимости а = 0,01 по t-критерию Стьюдента и дисперсионному анализу) доли популяции активированных CD19+CD69+-В-лимфоцитов у мышей, иммунизированных ПЭМК-КНК, как по сравнению с интактными мышами, так и с мышами, иммунизированными коллоидным раствором КНК.
Исследование популяции активированных Т-лимфо-цитов (CD3+CD69+-клеток) показало, что их доля в среде без антигена составила 1,75 ± 0,74% от всех Т-лимфоцитов. В группах мышей, иммунизированных препаратами ПЭМК-КНК типа (ПА/ДС)3 или типа (ПА/ ДС)3ПА под влиянием КНК наблюдалось увеличение субпопуляции CD69+-Т-хелперов до 8,9 ± 0,3 и 9,3 ± 1,1 % соответственно. В группах интактных мышей или мышей, иммунизированных раствором КНК, содержание активированных CD69+-Т-хелперов после их стимуляции КНК было достоверно меньше: 4,1 ± 0,9 и 4,1 ± 0,2% соответственно. Таким образом, доля популяции Т-хелперов у иммунизированных ПЭМК-КНК мышей
Таблица 2. Результаты иммунизации мышей линии БЛЬБ/е препаратами ПЭМК-КНК с последующим заражением разными дозами вирулентного штамма Е Ш1аггт1з 503
Препарат Заражающая Число погибших/ Средняя продолжи- Выживаемость, %
доза, КОЕ общее число мышей тельность жизни, сут
КНК, коллоидный раствор 10 5/5 9,2 ± 2,2 (5) 0
100 5/5 9,8 ± 2,2 (5) 0
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3 10 2/4 11 ± 0 (2) 50
100 4/4 10,5 ± 0,6 (4) 0
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3ПА 10 4/5 10,5 ± 2,4 (4) 20
100 4/5 9 ± 2,4 (4) 20
Интактные мыши 10 3/3 6 ± 0 (3) 0
Примечание. Указана средняя продолжительность жизни со стандартным отклонением. Иммунология ■ Том 40 ■ № 5 ■ 2019
4,3%
;
3,9% 'о -
Ш-' О -
' ../-ДДЩИВ "о -
...........1 .......1-1— ......1—........ о -
8,6%
9,6% ¿«äfc4
Интактные мыши
КНК
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3ПА
CD3 PerCP-Cy5.5
9,34%
шш —......ni—........ ■
6,7%
■ '1 1 ; > m ЯШ?-
' î '.:•'• 14,98%
:
104 100
101
102
103
104 10°
Интактные мыши
КНК
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3ПА
CD19 APC
' шйи ■ ' ■■■ 10,12%
г
■-■■.щш 10,81%
• • - ДЙИ
10,56%
: vT^HB 16,65% ti'HAi^' '
104 10°
101
102
103
Интактные мыши
КНК
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3
ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3ПА
CD25 PerCP-Cy5.5
Рис. 1. Изменение процентного содержания (указано в верхнем правом квадранте цитограммы) Т- (СБ3+) и В-лимфоцитов (СБ19+), экспрессирующих маркер активации СБ69 или СБ25 под влиянием КНК, в культуре клеток, полученных от мышей, иммунизированных разными препаратами.
104 10°
104 10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
4
10
10
10
10
10
104 10
2
2
4
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
104 10
2
10
2
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
также оказалась достоверно выше, чем у неиммуни-зированных или иммунизированных КНК в растворе (согласно /-критерию Стьюдента и дисперсионному анализу). Исследование популяции активированных Т-лимфоцитов (СБ3+СБ25+-клеток) показало, что количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих в присутствии КНК маркер активации СБ25, увеличивалось только в группе иммунизированных ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3ПА до 14,7 ± 2,3%, в остальных группах количество СБ3+СБ25+-клеток не превышало 11%: отличие группы ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3ПА от интактных мышей и получавших КНК в растворе статистически достоверно на уровне значимости 0,05 по критерию Стьюдента и дисперсионному анализу.
С помощью МТТ-анализа было выявлено статистически достоверное усиление пролиферативной активности лимфоцитов под влиянием КНК также в группе мышей, иммунизированных ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3ПА
(рис. 2). 3
Иммуногенные и протективные свойства ПЭМК- СаП
Иммуногенную активность ПЭМК-Caf1 изучали для препаратов типа (ПА/ДС)3 с внешним слоем из дек-страна сульфата.
Для характеристики гуморального иммунного ответа, индуцированного введением препаратов СаП, определили титры анти-Caf1 антител в сыворотках им-
мунизированных беспородных мышей методом ИФА на 28-й день после первой или второй иммунизации. Введение всех типов препаратов (одно- и двукратно) вызывало образование антител к СаН со средними ре-ципрокными значениями титров от 640 ± 320 до 2560 ± 640 (табл. 3).
OD 450 нм
□ Среда □ Среда + КНК
КНК, коллоидный ПЭМК-КНК ПЭМК-КНК Интактные раствор (ПА/ДС)3 (ПА/ДС)3ПА мыши
Группы мышей
Рис. 2. Изменение пролиферативной активности лимфоцитов мышей, иммунизированных препаратами КНК, ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3 и ПЭМК-КНК (ПА/ДС)3ПА, выявленное методом МТТ
* - группа мышей, лимфоциты которых реагируют на добавление КНК в среду культивирования статистически достоверным (а = 0,05) увеличением пролиферативной активности
А
Таблица 3. Результаты иммунизации беспородных белых мышей препаратами ПЭМК-СаП с последующим заражением вирулентным штаммом У. резйз 231 (40 КОЕ)
Препарат, доза, Реципрокный Число погибших/ Средняя про- Выживаемость,
кратность титр антител общее число должительность %
к Cafl мышей жизни, сут
ПЭМК-СаП, 20 мкг, однократно 640 ± 320 5/5 7,4 ± 3,7 0
ПЭМК-СаП, 20 мкг, двукратно l280±640 5/5 8,6 ± 3,0 0
ПЭМК-СаП, 50 мкг, однократно 2560 ± 640 3/5 9,3 ± 2,1 40
ПЭМК без СаП, двукратно 40 ± 40 5/5 4,6 ± 0,9 0
Интактные мыши 40 ± 40 3/3 3,7 ± 0,6 0
Интактные мыши 40 ± 40 3/3 4,0 ± 0 0
Примечание. Здесь и в табл. 4: приведены средние арифметические значения величин и их стандартные отклонения.
Выживаемость беспородных мышей после иммунизации препаратами, содержащими Cafl антиген Y. pestis, оценивали путем заражения вирулентным штаммом Y. pestis 231 в дозах 40 КОЕ (см. табл. 3) и 800 КОЕ (табл. 4). Все интактные животные и животные после введения ненагруженных ПЭМК пали к 7-м суткам наблюдения. Частичную защиту от гибели после заражения наблюдали только в группах животных, иммунизированных препаратами ПЭМК-Cafl либо Cafl-ГГА. Выживаемость положительно коррелировала с увеличенным титром антител к антигену Cafl в сыворотке животных.
Продолжительность жизни мышей, иммунизированных препаратами ПЭМК-Cafl заметно возрастала по сравнению с интактными мышами в среднем до 7-9 сут (статистически достоверно для иммунизированных 20 мкг антигена двукратно и 50 мкг однократно).
Статистически достоверны на уровне значимости а = 0,05 различия в титрах специфических антител у иммунизированных и неиммунизированных животных.
Из табл. 4 видно, что среднее время жизни иммунизированных мышей несколько выше, чем интактных (достоверно с вероятностью выше 95% для иммунизированных растворенным Cafl двукратно 20 мкг, Cafl-ГГА 20 и 50 мкг и Cafl-ПЭМК 50 мкг). Достоверной разницы в продолжительности жизни между экспериментальными группами, иммунизированными анти-
геном Cafl в разных препаратах, не наблюдалось. Как и в предыдущем опыте, часть иммунизированных животных выжила при гибели всех контрольных, что позволяет с достаточно высокой вероятностью (а = 0,05) утверждать, что иммунизация способствует выживанию при заражении вирулентным штаммом Y pestis 23l. При этом есть статистически достоверное преимущество иммунизации антигеном на твердом носителе по сравнению с растворенным антигеном (согласно угловому критерию Фишера). Также наблюдалось многократное увеличение титра антител к антигену Cafl у иммунизированных мышей по сравнению с интактными и иммунизированными «ненагруженными» микрокапсулами мышами (уровень значимости а = 0,0l).
Иммунизация мышей препаратами ПЭМК-Cafl в дозе 20 мкг двукратно или 50 мкг однократно приводила к формированию пула специфических лимфоцитов, которые в ответ на рестимуляцию Cafl in vitro усиливали пролиферативную активность (табл. 5, статистически значимы на уровне а = 0,05 отличия указанных групп от контрольных).
При сравнительном анализе выживаемости мышей, титров антител к Cafl и уровня пролиферативной активности лимфоцитов было установлено, что в группе мышей, однократно иммунизированных Cafl-ГГА в дозе 50 мкг уровень антител был выше l : 3200, а уровень пролиферативной активности лимфоцитов составил l7,37%, что обеспечило наибольшую среди изучаемых
Таблица 4. Выживаемость беспородных мышей после подкожной иммунизации препаратами Сай и последующего заражения вирулентным штаммом У. резйз 231 (800 КОЕ)
Препарат, кратность иммунизации Доза Cafl, мкг Реципрокный титр анти-Cafl антител Число погибших/ общее число мышей Среднее время жизни, сут Протективность иммунизации, %
СаП в ФСБР, двукратно 20 3200 ±l600 6/7 ll,5 ± 3,3 l4
СаП в ФСБР, однократно 50 l600±800 7/7 8,l ± 2,9 0
СаП-ГГА, двукратно 20 3200 ± 800 4/7 9 ± l,2 43
СаП-ГГА, однократно 50 3200 ±l600 l/7 l0 86
ПЭМК-СаП, двукратно 20 l600±800 5/7 9 ± 5 29
ПЭМК-СаП, однократно 50 l600±800 5/7 8,4 ± l,5 29
ПЭМК двукратно - l00 ± 50 7/7 7,l ± 4,8 0
ПЭМК однократно - 50 ± 50 7/7 6,7 ± l,3 0
Интактные мыши 50 ± 50 7/7 7 ± 0 0
Таблица 5. Изменение пролиферативной активности лимфоцитов, полученных от мышей после иммунизации препаратами, содержащими Cafl антиген Y. pestis, под влиянием антигена Cafl in vitro
Группа, Доля пролиферирующих клеток, % Коэффициент
доза иммунизации RPMI RPMI + ConA RPMI + пролиферации
(отрицательный (положительный Cafl (RPMI + Cafl /
контроль) контроль) RPMI)
СаП в ФСБР, 20 мкг, двукратно 8,49 ± 3,85 87,31 ± 3,87 8,47 ± 5,71 0,99
СаП в ФСБР, 50 мкг, однократно 9,85 ± 4,15 85,41 ± 4,06 9,84 ± 5,26 0,99
СаП-ГГА 20 мкг, двукратно 7,59 ± 4,15 90,25 ± 15, 5 9,15 ± 4,15 1,20
СаП-ГГА 50 мкг, однократно 8,26 ± 3,85 81,45 ± 7,56 17,34 ± 7,2 2,09
ПЭМК-СаП, 20 мкг, двукратно 10,35 ± 5,4 87,2 ± 12,11 18,19 ± 7,3 1,75
ПЭМК-СаП, 50 мкг, однократно 9,41 ± 4,15 89,16 ± 6,58 24,65 ± 3,58 2,61
ПЭМК, контроль к КНК 7,82 ± 3,21 82,47 ± 10,54 11,32 ± 3,98 1,43
ПЭМК, контроль к СаП 8,21 ± 4,74 75,48 ± 14,21 9,14 ± 5,12 1,11
Интактные 8,15 ± 4,04 91,0 ± 6,25 10,0 ± 4,68 1,23
Примечания. ConA - митоген конканавалин А; RPMI - среда для выращивания культуры спленоцитов.
групп защиту от заражения (86% выживших). В группе мышей, двукратно иммунизированных 20 мкг СаЛ-ГГА, только 43% животных пережили подкожное заражение вирулентным штаммом, уровень антител также был высокий (1 : 3200), однако достоверного изменения уровня пролиферативной активности лимфоцитов не зафиксировано. У мышей, однократно иммунизированных 50 мкг ПЭМК-СаП, уровень антител к СаП составил 1 : 1600 и выявлялось максимальное усиление проли-феративной активности лимфоцитов под влиянием кап-сульного антигена (24,65%), однако количество выживших животных составило только 29%, таким образом, прямой корреляции между титрами антител, выживаемостью животных и повышением пролиферативной активности лимфоцитов в случае иммунизации препаратами, содержащими капсульный антиген чумного микроба, не выявлено.
Обсуждение
Полученные нами результаты иммунизации мышей препаратами ПЭМК, несущими антигенный комплекс КНК туляремийного микроба или капсульный антиген СаЛ чумного микроба, свидетельствуют в пользу того, что включение антигенов в состав микрокапсул позволяет усилить специфические иммунные реакции. Особенно наглядно это проявляется в случае с туляре-мийным антигеном КНК, который сам по себе (в виде коллоидного раствора) является очень слабым имму-ногеном: в сыворотках крови животных после двукратной иммунизации КНК не выявлены антитела, а среди лимфоцитов не выявлялись клетки памяти, способные пролиферировать в ответ на антигены Е Ш1агет1&\ Тем не менее иммунизация мышей коллоидным раствором КНК приводила к увеличению продолжительности их жизни после заражения Е. Ш1агет1&' 503 в среднем более, чем на 3 сут, по сравнению с длительностью жизни интактных мышей. Использование для иммунизации КНК, включенного в ПЭМК, также способствовало удлинению средних сроков жизни мышей после заражения 100 КОЕ вирулентного штамма Е. Ш1агет1&' 503,
а в случае заражения дозой l0 КОЕ часть животных оказывалась способной выжить. Однако при этом антитела против КНК возбудителя туляремии в сыворотке крови мышей выявлены не были. Следовательно, в усилении протективности основную роль сыграли клеточные реакции иммунитета. Поэтому мы проанализировали изменение функциональной активности лимфоцитов под влиянием КНК.
Проявление специфических клеточных реакций у мышей оценивали по увеличению лимфоцитами экспрессии маркеров CD69 и CD25, а также по усилению их пролиферативной активности под влиянием КНК in vitro. Молекула CD69 является ранним маркером активации клеток. Это гликопротеин, выступающий в роли молекулы, передающей сигнал к пролиферации, экспрессия которого на поверхности клетки начинается уже через 4 ч после активации. Более поздним маркером активации является молекула CD25, выполняющая функцию рецептора ИЛ-2, стимулирующего пролифе-ративную активность клетки. Максимальная экспрессия молекулы CD25 отмечается к 48 ч после активации [27]. В группе мышей, иммунизированных ПЭМК-КНК типа (ПА/ДС)3ПА, наблюдали наибольшую активацию клеточных реакций под влиянием КНК, выражавшуюся в усилении экспрессии маркеров активации CD69 и CD25 и увеличении пролиферативной активности. Именно в этой группе мышей отмечали удлинение сроков жизни после заражения как низкой, так и высокой дозой вирулентного штамма F. tularensis. Раннюю активацию В-лимфоцитов и Т-хелперов зафиксировали у мышей, иммунизированных микрокапсулирован-ными препаратами как типа (ПА/ДС)3ПА, так и типа (ПА/ДС)3.
Ранее нами было показано, что иммунизация мышей КНК, инкапсулированным в поли(лактид-когликолидные) (ПЛГ) микрокапсулы, индуцирует высокий уровень специфических антител в сыворотке мышей только при многократном подкожном введении. При иммунизации ПЛГ-КНК клеточные реакции практически не выявлялись, а частичный протективный эф-
фект достигался только после многократного подкожного введения микрокапсулированного КНК на фоне высокого титра специфических антител в сыворотке крови [8]. Это подтверждает важность одновременного участия в формировании протективного противотуляре-мийного иммунитета как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета [26].
В отличие от КНК, капсульный антиген возбудителя чумы Cafl, инкапсулированный в ПЭМК или адсорбированный на геле гидроокиси алюминия, был способен индуцировать образование специфических антител в сыворотке крови иммунизированных мышей, причем они выявлялись только в группах с выжившими животными, как и указывалось ранее [28]. Некоторое увеличение пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток, коррелирующее с ростом иммунизирующей дозы антигена, наблюдавшееся в наших опытах для групп мышей, иммунизированных ПЭМК-Cafl (см. табл. 4 и 5), можно связать с развитием гуморальной реакции на чумной антиген [9, l5]. Показательно, что выраженный иммунный ответ, сопровождающийся повышенной выживаемостью зараженных животных, наблюдали в группах животных после иммунизации антигеном, связанным с твердым носителем: гидроокисью алюминия или полиэлектролитными микрокапсулами (см. табл. 4 и 5). При этом адъювант ГГА, известный своим влиянием именно на гуморальное звено иммунного ответа, эф-
■ Литература
1. Bachmann M.F., Jennings G.T. Vaccine delivery: a matter of size, geometry, kinetics and molecular patterns. Nat. Rev. Immunol. 20l0; l0: 787-96.
2. De Koker S., Naessens T., DeGeest B.G., Bogaert P. et al. Biodegradable polyelectrolyte microcapsules: antigen delivery tools with Thl7 skewing activity after pulmonary delivery. J. Immunol. 20l0; l84: 203-ll. doi: l0.4049/ jimmonol.org/content/l84/l/203.
3. El Bissati K., Zhou Y., Dasgupta D., Cobb D. et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 20l4; 32 (26): 3243-8.
4. Gregory A.E., Titball R., Williamson D. Vaccine delivery using nanoparticles. Front. Cell. Infect. Microbiol. 20l3; 3 (l3): l-l3. doi: l0.3389/ fcimb.20l3.000l3
5. De Koker S., Lambrecht B.N., Willart M.A., Van Kooyk Y. et al. Designing polymeric particles for antigen delivery. Chem. Soc. Rev. 20ll; 40: 320-39.
6. Сухоруков Б.И., Тихоненко С.А., Сабурова Е.А., Дубровский А.В. и др. Инкапсулирование белков в полиэлектролитные нано- и микрокапсулы и проблемы разработки ферментного микро-диагностикума. Биофизика. 2007; 52 (6): l04l-8.
7. Кочеткова О.Ю., Казакова Л.И., Мошков Д.А., Винокуров М.Г., Шабарчина Л.И. Включение белков в полиэлктролитные микрокапсулы методами копреципитации и адсорбции. Биоорган. химия. 20l3; 39 (5): 565-7l.
8. Сомов А.Н., Кравченко Т.Б., Павлов В.М., Вахрамеева Г.М. и др. Антигенные и иммуногенные свойства кислотонераствори-мого комплекса F. tularensis штамма l5 НИИЭГ в растворимой, адсорбированной и микрокаспулированой формах. Биотехнология, 20l7, 33 (5): 23-34.
9. Кадникова Л.А., Копылов П.Х., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Капсульный антиген чумного микроба. Инфекция и иммунитет. 20l5; 5 (3): 20l-l8.
10. Cornelius C., Quenee L., Anderson D., Schneewind O. Protective immunity against plague. Adv. Exp. Med. Biol. 2007; 603: 4l5-24.
11. Chichester J.A., Musiychuk K., Farrance C.E., Mett V. et al. A single component two-valent LcrV-CAFl vaccine protects non-hu-
фективнее способствовал защите мышей от гибели при подкожном заражении чумным микробом. Полученные данные согласуются с устоявшимся мнением о ведущей роли гуморального звена иммунного ответа в формировании протективного иммунитета против чумы у мышей [29, 30].
Заключение
Показано, что полиэлектролитные микрокапсулы, нагруженные антигенами, могут способствовать формированию иммунных реакций, индуцируя синтез специфических антител и/или генерацию клеток памяти, способных пролиферировать под влиянием специфических антигенов, формируя пул клеток, обеспечивающих защиту организма от инфекции. Благодаря своим уникальным свойствам изучаемые нами полиэлектролитные микрокапсулы представляют практический интерес для исследователей и могут найти применение при создании как вакцинных препаратов, так и систем контролируемого высвобождения лекарственных средств. Очевидно также, что для детализированной оценки иммуногенного потенциала таких препаратов необходимы дальнейшие развернутые исследования.
Благодарности. Выражаем признательность кандидату биологических наук П.Х. Копылову, доктору биологических наук В.М. Павлову и Г.М. Вахрамеевой за предоставленные образцы антигенов СаП и КНК.
man primates against pneumonic plague.Vaccine. 2009; 27 (25-26): 3471-4. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.01.050. Epub 2009 Feb 5.
12. Дентовская С.В., Копылов П.Х., Иванов С.А., Агеев С.А., Анисимов А.П. Молекулярные основы вакцинопрофилактики чумы. Молекул. генетика. 2013; 3: 3-12.
13. Huang S.S., Li I.H., Hong P.D., Yeh M.K. Development of Yersinia pestis CAF1 antigen-loaded microspheres vaccine against plague. Int. J. Nanomedicine. 2014; 9: 813-22. doi: 10.2147/IJN.S56260.
14. Zhang Q., Wang Q., Tian G., Qi Z. et al. Yersinia pestis biovar Microtus strain 201, an avirulent strain to humans, provides protection against bubonic plague in rhesus macaques. Hum. Vaccines Immuno-ther. 2014; 10 (2): 368-77. doi: 10.4161/hv.27060. Epub 2013 Nov 13.
15. Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Anisimov A.P. A recombinant prototrophic Yersinia pestis strain over-produces F1 antigen with enhanced serological activity. Adv. Exp. Med. Biol. 2003; 529: 419-22.
16. Hermanson G.T. (ed.). Bioconjugate Techniques. San Diego, CA : Academic Press; 1996: 297-416.
17. Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Титарева Г.М. и др. Получение и иммунобиологические свойства вакцинного штамма ту-ляремийного микроба без одной копии гена iglC и без гена recA. Молекул. генетика. 2015; 3: 33-9.
18. Фирстова В.В., Павлов В.М., Горбатов А.А., Комбарова Т.И. и др. Формирование антитуляремийного клеточного и гуморального иммунного ответа, индуцированного у мышей F. tularensis 15 НИИЭГ. Иммунология. 2014; 35 (3): 147-50.
19. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации рации от 19.06.2003 года № 267 «Об утверждении Правил лабораторной практики в Российской Федерации».
20. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Off. J. Eur. Union. 20.10.2010: L276/33-276/79.
21. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. : Медгиз; 1962.
22. URL: https://www.researchgate.net/publication/274390526_Statis-ticeskie_metody_v_mediko-biologiceskom_eksperimente.
23. Корнева А.В., Николаев В.Б.,. Ястремская К.Ю. и др. Результаты изучения иммуногенной активности клеточных оболочек Francisella tularensis разных подвидов (сообщение 1). Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. 2014; 4 (77): 73-7.
24. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелёв И.А., Никифоров А.К. Компонентный состав протективного антигенного комплекса туляремийного микроба. Молекул. генетика. 2012; 3: 22-5.
25. Хлебников В.С., Головлев И.Р., Чугунов А.М. и др. Защитные свойства внешней мембраны Francisella tularensis при экспериментальной инфекции морских свинок. Журн. микробиол. 1994; 1: 84-8.
26. Sebastian S., Pinkham J.T., Lynch J.G., Ross R.A. et al. Cellular and humoral immunity are synergistic in protection against types A and
B Francisella tularensis. Vaccine. 2009; 27 (4): 597-605. doi: 10.1016/ j.vaccine.2008.10.079.
27. Benczik M., Gaffen S.L. The interleukin (IL)-2 family cytokines: survival and proliferation signaling pathways in T lymphocytes. Immunol. Invest. 2004; 33: 109-42.
28. Huang S., Li I-H., Hong P., Yeh M. Development of Yersinia pestis CAF1 antigen-loaded microspheres vaccine against plague. Int. J. Nanomedicine. 2014; 9: 813-22.
29. Wake A., Morita H., Wake M. Mechanisms of long and short term immunity to plague. Immunology. 1978; 34 (6): 1045-52.
30. Anderson D.M., Ciletti N.A., Lee-Lewis H., Elli D. et al. Pneumonic plague pathogenesis and immunity in Brown Norway rats. Am. J. Pathol. 2009; 174 (3): 910-21.
■ References
1. Bachmann M.F., Jennings G.T. Vaccine delivery: a matter of size, geometry, kinetics and molecular patterns. Nat. Rev. Immunol. 2010; 10: 787-96.
2. De Koker S., Naessens T., DeGeest B.G., Bogaert P., et al. Biodegradable polyelectrolyte microcapsules: antigen delivery tools with Th17 skewing activity after pulmonary delivery. J. Immunol. 2010; 184: 203-11. doi: 10.4049/ jimmonol.org/content/184/1/203.
3. El Bissati K., Zhou Y., Dasgupta D., Cobb D., et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 2014; 32 (26): 3243-8.
4. Gregory A.E., Titball R., Williamson D. Vaccine delivery using nanoparticles. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2013; 3 (13): 1-13. doi: 10.3389/ fcimb.2013.00013
5. De Koker S., Lambrecht B.N., Willart M.A., Van Kooyk Y., et al. Designing polymeric particles for antigen delivery. Chem. Soc. Rev. 2011; 40: 320-39.
6. Sukhorukov B.I., Tikhonenko S.A., Saburova E.A., Dubrovskiy A.V., et al. Encapsulation of proteins into a polyelectrolytic nano- and microcapsules and problems of an enzymatic micro-diagnostikum development. Biofizika. 2007; 52 (6): 1041-8. (in Russian)
7. Kochetkova O.Yu., Kazakova L.I., Moshkov D.A., Vinokurov M.G., et al. Inclusion of proteins into polyelectrolytic microcapsules by using co-precipitation and adsorption techniques. Bioorganicheskaya khimiya. 2013; 39 (5): 565-71. (un Russian)
8. SomovA.N., Kravchenko T.B., Pavlov V.M., Vakhrameeva G.M., et al. Antigenic and immunogenic characteristics of dissolved, adsorbed and microencapsulated formulations of acid-soluble complex from F. tularensis 15 NIIEG strain. Biotekhnologiya. 2017; 33 (5): 23-34. (in Russian)
9. Kadnikova L.A., Kopylov P.Kh., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P. The plague microbe capsular antigen. Infektsiya i immunitet. 2015; 5 (3): 201-8. (in Russian)
10. Cornelius C., Quenee L., Anderson D., Schneewind O. Protective immunity against plague. Adv. Exp. Med. Biol. 2007; 603: 415-24.
11. Chichester J.A., Musiychuk K., Farrance C.E., Mett V., et al. A single component two-valent LcrV-CAF1 vaccine protects non-human primates against pneumonic plague.Vaccine. 2009; 27 (25-26): 3471-4. doi: 10.1016/j.vaccine.2009.01.050. Epub 2009 Feb 5.
12. Dentovskaya S.V., Kopylov P.Kh., Ivanov S.A., Ageev S.A., et al. Molecular basis of the plague prophylaxis. Molekulyarnaya gene-tika, mikrobiologiya i virusologiya. 2013; 3: 3-12. (in Russian)
13. Huang S.S., Li I.H., Hong P.D., Yeh M.K. Development of Yersinia pestis CAF1 antigen-loaded microspheres vaccine against plague. Int. J. Nanomedicine. 2014; 9: 813-22. doi: 10.2147/IJN.S56260.
14. Zhang Q., Wang Q., Tian G., Qi Z., et al. Yersinia pestis biovar Microtus strain 201, an avirulent strain to humans, provides protection against bubonic plague in rhesus macaques. Hum. Vaccines Immuno-ther. 2014; 10 (2): 368-77. doi: 10.4161/hv.27060. Epub 2013 Nov 13.
15. Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Anisimov A.P. A recombinant prototrophic Yersinia pestis strain over-produces F1 antigen
with enhanced serological activity. Adv. Exp. Med. Biol. 2003; 529: 419-22.
16. Hermanson G.T. (ed.). Bioconjugate techniques. San Diego, CA: Academic Press; 1996: 297-416.
17. Mokrievich A.N., Vakhrameeva G.M., Titareva G.M., et al. Development and immune-biological properties of the Francisella tularensis vaccine strain without one copy of the gene iglC and without gene recA. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2015; 3: 33-9. (in Russian)
18. Firstova V.V., Pavlov V.M., Gorbatov A.A., Kombarova T.I., et al. Development of anti-tularemia cell-mediated and humoral immune response in mice induced by the F. tularensis 15 NIIEG strain. Immu-nologiya. 2014; 35 (3): 147-50. (in Russian)
19. The Russian Federation Ministry of Health Order from 19.06.2003 No. 267 «Rules of good laboratory practice in the Russian Federation». (in Russian)
20. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Off. J. Eur. Union. 20.10.2010: L276/33-276/79.
21. Ashmarin I.P., Vorob'ev A.A. Mathematical statistics techniques in microbiological studies. Leningrad: Medgiz, 1962. (in Russian)
22. URL: https://www.researchgate.net/publication/274390526_ Statisticeskie_metody_v_mediko-biologiceskom_eksperimente.
23. Korneva A.V., Nikolayev V.B., Yastremskaya K.Yu., et al. Results of the study of the immunogenic activity of cellular membranes of Francisella tularensis different subspicies (report 1). Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika. 2014; 4 (77): 73-7. (in Russian)
24. Kuznetsova E.M., Volokh O.A., Shepelev I.A., Nikiforov A.K. The components of Francisella tularensis protective antigene complex. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2012; 3: 22-5. (in Russian)
25. Khlebnikov V.S., Golovliov I.R., Chugunov A.M., et al. Protective properties of the Francisella tularensis outer membrane in the guinea pigs experimental infection. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i im-munobiologii. 1994; 1: 84-8. (in Russian)
26. Sebastian S., Pinkham J.T., Lynch J.G., Ross R.A., et al. Cellular and humoral immunity are synergistic in protection against types A and B Francisella tularensis. Vaccine. 2009; 27 (4): 597-605. doi: 10.1016/ j.vaccine.2008.10.079.
27. Benczik M., Gaffen S.L. The interleukin (IL)-2 family cytokines: survival and proliferation signaling pathways in T lymphocytes. Immunol. Invest. 2004; 33: 109-42.
28. Huang S., Li I-H., Hong P., Yeh M. Development of Yersinia pestis CAF1 antigen-loaded microspheres vaccine against plague. Int. J. Nanomedicine. 2014; 9: 813-22.
29. Wake A., Morita H., Wake M. Mechanisms of long and short term immunity to plague. Immunology. 1978; 34 (6): 1045-52.
30. Anderson D.M., Ciletti N.A., Lee-Lewis H., Elli D., et al. Pneumonic plague pathogenesis and immunity in Brown Norway rats. Am. J. Pathol. 2009; 174 (3): 910-21.
