CC BY
19
УДК 619:616.98:578.842.1
Ключевые слова: африканская чума свиней, гликопротеины, иммуногенность, протективность
Key words: African swine fever, glycoproteins, immunogenicity, protective potency
Середа А. Д.
ИММУНОГЕННЫЕ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ГЛИКОПРОТЕИНОВ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
immunogenic and protective characteristics of african swine fever virus glycoproteins
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии Адрес: 601120, Россия, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров, а/я 44
state Research Institution «National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology of Russia» (sRI NRIVVaMR) of the Russian Academy of science Address: 601120, Russia, Vladimir region, Petushinsky district, Pokrov, P. O. Box 44
Середа Алексей Дмитриевич, д. б. н., проф., зав. лабораторией «Биохимии»
Sereda Alexey D., Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Laboratory «Biochemistry»
Аннотация. Иммунизация подсвинков пулом гликопротеинов вируса африканской чумы свиней (АЧС) в составе липосом индуцирует образование высоких титров антител, но приводит к ускорению гибели животных после контрольного заражения. В результате иммунизации свиней очищенным серотипоспецифическим мажорным гликопротеином вируса АЧС с м.м. 110-140 кДа (ГП 110-140) в составе липосом после контрольного заражения от гибели, но не от переболевания, защищены 67 % животных.
Summary. Immunization of gilts with a pool of African swine fever (AsF) virus glycoproteins induces a high-titer antibody formation, though promotes animal death after challenge. Immunization of pigs with a purified serotype-specific ASF virus major glycoprotein with the M. W. of110 to 140 kDa (GP 110-140) within liposomes protected 67 % of animals from after-challenge death, but not from the disease.
Введение
Изучение иммунобиологических свойств белков вируса АЧС привело к пониманию, что в формировании защиты против болезни важную роль играют вирусспецифические оболочечные белки р30/32, р38, р54, ГП 110140 (CD2v). В частности, показано, что после введения свиньям больших доз аттенуирован-ного штамма ФК-135 вируса АЧС на третьи сутки одновременно с началом проявления антителозависимой клеточной цитотоксич-ности (АЗКЦ) методом радиоиммунопреци-питации выявляются антитела к вирусспеци-фическим белкам р30 и р38 [3]. Установлено, что антитела к мембранным белкам вирио-нов вируса АЧС р30 и р54 ингибируют проникновение вирионов в клетку и блокируют связывание вирионов с макрофагами, соответственно. Иммунизация свиней р30 и р54 отсрочивает их гибель после контрольного заражения вирулентным штаммом вируса АЧС [5]. В зараженных гемадсорбирующими штаммами вируса АЧС свиных макрофагах
был обнаружен мажорный гликопротеин ГП 110-140, который уникален тем, что обладает свойством серотиповой специфичности и имеет самую низкую, из белков вируса АЧС, изоэлектрическую точку (pI 4,2-4,8) [1, 2]. Позже в геноме вируса АЧС был идентифицирован ген гомологичного адгезивному рецептору Т-лимфоцитов свиней белка CD2v, обладающего гемадсорбирующей активностью [6]. Судя по физико-химическим и биологическим свойствам, различные группы исследователей обнаружили один и тот же белок ГП 110-140 (CD2v), который на сегодня рассматривается как наиболее перспективный для создания рекомбинантной конструкции для защиты свиней от АЧС [4].
Цель исследования - определить имму-ногенные и протективные свойства пула гликопротеинов вируса АЧС и мажорного серотипоспецифического гликопротеина ГП 110-140, выделенных из лизатов зараженных вирусом АЧС клеток костного мозга свиней (КМС).
Материалы и методы
Выделение пула гликопротеинов. 10 л культуры клеток КМС заражали вирусом АЧС шт. Конго-73 (К-73) с множественностью 1,0 ГАЕ50 на клетку и через 18-20 часов, в период максимума проявления гемадсорб-ции, неприкрепившиеся клетки сливали, адгезивные клетки (А-клетки) ополаскивали фосфатно-буферным раствором с рН 7,2, снимали со стекла, осаждали при 2000 g 20 минут и замораживали при минус 70 °С. После размораживания клетки ресуспендировали в 60 см3 лизисного буфера (0,02 М трис-НС1 рН 7,2, 1 % тритон Х-100, 1 мМ фенилме-тилсульфонилфторид (PMSF), инкубировали при перемешивании 1 час при 37 °С и центрифугировали при 3000 g 30 минут и 50000 g 1 час. Из полученного надосадка выделяли пул гликопротеинов биоаффинной хроматографией на 15 см3 геля Con А-сефароза CL 4B, уравновешенного 0,02 М трис-HCl рН 7,2 с 0,5 % октил-Р-О-глюкопиранозида. Гель с сорбированными гликопротеинами промывали 150 см3 уравновешивающего буфера для удаления недиализуемого детергента тритон Х-100 и после этого глико-протеины элюировали смесью 6 % метил-a-D-маннопиранозида, 4 % D-глюкозы, 2 % ацетилглюкозамина на уравновешивающем буфере.
Выделение ГП 110-140. Через 16-18 часов после заражения вирусом АЧС шт. Фран-ция-32 (Ф-32) с множественностью 1,0 ГАЕ50 А-клетки КМС лизировали в течение 1 часа при 37 °С в буфере 0,02 М трис-HCl рН 7,27,4, 1 % тритон Х-100, 1 мМ PMSF. После дифференциального центрифугирования ли-зата при 3000 g 30 минут и 35000 g в течение 1 часа супернатант наслаивали на колонку с ДЭАЭ-сефацелем, уравновешенным буфером для лизиса. После сорбции супернатанта на ионообменник и отмывки последнего буфером для лизиса проводили элюцию 0,2 М NaCl на буфере для лизиса. Элюат концентрировали и диализовали в течение 2 часов при 20 °С против 2 % раствора амфолинов рН 3-10. Полученную смесь белков подвергали препаративному изоэлектрофокуси-рованию в гранулированном геле «Ультра-декс» с 2 % амфолинами рН 3-10 при 6 W
в течение 6 часов. Фракции геля с р1 4,0-4,8, содержащие ГП 110-140, отбирали и из них элюировали белки раствором 0,02 М трис-HCl рН 7,2-7,4 с 0,15 М NaCl. После диализа против 0,02 М трис-HCl с 0,15 М NaCl белки подвергали аффинной хроматографии на анти-АЧС-IgG-сефарозе CL4B. Элюцию ГП 110-140 производили 3 М тиоцианатом аммония. Далее диализовали в течение 18 часов при комнатной температуре против 0,02 трис-HCl рН 7,2-7,4 с 0,15 М NaCl и 0,5 % октил-Р-О-глюкопиранозидом. В итоге из 10 литров зараженной культуры клеток КМС получали 1,5-2,5 мг белка ГП 110-140 в объеме 4,0 см3.
Для инкорпорирования ГП 110-140 в ли-посомы фосфотидилхолин, дицетилфосфат, холестерин растворяли в молярном соотношении 7:2:1 в 14,0 см3 хлороформа, высушивали под вакуумом и ресуспендировали в 2,0 см3 раствора белка ГП 110-140. После инкубирования в течение 2 часов при комнатной температуре смесь диализовали в течение 2-3 суток против 0,02 М трис-HCl рН 7,2-7,4 с 0,15 М NaCl.
Определение активности цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов (ЦТЛ), постановку реакции АЗКЦ, иммуноблоттинг проводили, как описано ранее [2, 3].
Результаты исследований
Первоначально была исследована имму-ногенность и протективность пула гликопротеинов вируса АЧС, выделенных из ли-затов зараженных шт. К-73 А-клеток КМС. Двум подсвинкам четырехкратно с интервалом 14 суток вводили внутримышечно по 2 см3 пула гликопротеинов в буферном растворе, а трем - по 2 см3 липосом с инкорпорированным в них пулом гликопротеинов. Через 7 суток после четвертого введения иммунизированных и контрольных подсвинков заражали вирусом АЧС шт. К-73 в дозе 102 ГАЕ50. Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют, что подсвинки, иммунизированные пулом гликопроте-инов в составе липосом, пали на 2-3 суток раньше, чем контрольные или иммунизированные гликопротеинами в растворе. Сравнение сывороток иммунизированных жи-
вотных по полипептидной специфичности индуцированных антител и их активности в иммуноблоттинге показало, что у первой группы выявлены антитела к 13 полипептидам, а во второй - 22. Титры антител в им-муноблоттинге в сыворотках свиней первой группы составляли 1 : 20 - 1 : 30, второй -1 : 150 - 1 : 300.
Из полученных данных следует, что, во-первых, иммунизация гликопротеинами в составе липосом в 7-10 раз повышает титры индуцируемых антител по сравнению с иммунизацией гликопротеинами в растворе, во-вторых, формирование гуморального иммунитета с широким по полипептидной специфичности спектром антител и с высокой их активностью в иммуноблоттинге, сопоставимой с таковой у переболевших АЧС свиней, ускоряет гибель свиней после контрольного заражения.
В следующем эксперименте была изучена иммуногенность и протективность ГП 110-140 в растворе и в составе липосом. Около 50 % массы ГП 110-140 обусловлено углеводными цепями, которые могут положительно или отрицательно влиять на иммуногенность критических эпитопов. Поэтому была изучена иммуногенность препаратов нативного ГП 110-140 и де-гликозилированного обработкой в течение
24 часов при 37 °С эндогликозидазой F (8 ед/см3) ГП 110-140.
Двух подсвинков иммунизировали внутримышечно препаратами ГП 110-140 в растворе 0,02 М трис-НС1 рН 7,2-7,4 с 0,15 М №С1. Трех подсвинков - препаратом ГП 110140 в составе липосом. Еще двух подсвинков иммунизировали препаратом дегликозили-рованного ГП 110-140 в составе липосом. Все препараты вводили внутримышечно четыре раза с интервалом 14 суток. Через неделю после окончания иммунизации семерых опытных и двух контрольных особей заражали внутримышечно 103 ГАЕ50 вируса АЧС шт. Ф-32. Оба контрольных подсвинка пали на 9 сутки, иммунизированные ГП 110-140 в растворе - на 9-10 сутки, из иммунизированных нативным ГП 110-140 в липосомах один подсвинок пал на 14 сутки, два - выжили после переболевания с лихорадкой до 41,2 °С в течение 4 суток, иммунизированные дегли-козилированным ГП 110-140 в липосомах пали на 10-11 сутки.
Сыворотки, полученные от всех животных накануне контрольного заражения, не проявляли активности в реакции задержки гемадсорбции. Только сыворотки от подсвинков, иммунизированных ГП 110-140 в составе липосом, обладали активностью в реакции АЗКЦ. При разведениях этих сы-
Таблица.
Протективность препаратов гликопротеинов вируса АЧС
№ № Характеристика препарата Кол-во введе- Доза кон- Пали / Сроки гибели
опыта группы ний / интервал (сутки) трольного заражения, ГАЕ50 выжили (сутки)
1 1 Пул гликопротеинов, 15 мг 4 / 14 100 2 / 0 9
2 Пул гликопротеинов в липосомах, 12 мг 4 / 14 100 3 / 0 6-7
3 Контроль - 100 2 / 0 9-10
2 1 ГП 110-140 в ФБР, 0,2-0,3 мг 4 / 14 1000 2 / 0 10-11
2 ГП 110-140 в липосомах 0,2-0,3 мг 4 / 14 1000 1 / 2 14 / -
3 ГП 110-140 дегликозили-рованный в липосомах, 0,2-0,3 мг 4 / 14 1000 2 / 0 10-11
4 Контроль - 1000 2 / 0 9
вороток 1 : 4 процент цитолиза зараженных клеток составлял 5,85±0,74, тогда как неза-раженных - 0,41±0,32. Вирусспецифическая активность ЦТЛ в крови иммунизированных подсвинков не выявлена.
Обсуждение результатов
Отсутствие ощутимого прогресса в области создания защитных препаратов против АЧС на основе инактивированных субвирусных частиц или вирусспецифических белков заставляет вести поиск широким фронтом, отрабатывать все возможные новые идеи и иногда на новом методическом уровне возвращаться к старым.
Как правило, иммунизация гликопротеи-нами, выделенными из очищенных вирио-нов или мембран зараженных оболочечными вирусами клеток, создает у экспериментальных животных защиту от последующего заражения соответствующим вирулентным вирусом. В отличие от большинства известных вирусов животных и человека, протективно значимые белки вируса АЧС окончательно не определены. В представленных в данной работе результатах экспериментов иммунизация подсвинков пулом гликопротеинов вируса АЧС в составе липосом привела не к защите, а к ускорению сроков гибели после контрольного заражения вирулентным штаммом. Можно предположить, что формирование в результате иммунизации высоких титров антител к гликопротеинам вируса АЧС приводит после заражения к эффективной опсонизации вирионов и, как следствие, ускорению их проникновения в клетки-мишени - макрофаги. Антитела в данном случае играют роль «троянского коня».
Введение свиньям некоторых аттенуи-рованных штаммов вируса АЧС защищает животных от переболевания или гибели после заражения теми вирулентными изоля-тами или штаммами, которые входят в ту же самую сероиммунологическую группу. Из известных вирусиндуцированных белков свойством серотипоспецифичности обладает только ГП 110-140. Поэтому были проведены эксперименты по иммунизации свиней препаратами на основе очищенного в неденатурирующих условиях ГП 110-140.
Методика очистки ГП 110-140 из лизата зараженных вирусом АЧС клеток КМС основана на возможности отделить его от остальных вирусспецифических белков изоэлектрофо-кусированием в гранулированном геле, а от клеточных - аффинной хроматографией с использованием иммуноглобулинов сывороток свиней с высокой активностью в реакции задержки гемадсорбции. Для повышения иммуногенности очищенный ГП 110-140 встраивали в липосомы. В результате установлено, что четырехкратная иммунизация подсвинков ГП 110-140 в составе липосом защищала от гибели, но не от переболевания, 2 из 3 животных. Это дает основания рассматривать ГП 110-140 как один из основных компонентов для создания нового поколения защитных препаратов против АЧС с использованием более эффективных подходов для представления его протективных эпи-топов иммунной системе свиней. Недавно опубликованные результаты исследований по изучению протективных свойств ДНК-конструкции, содержащей в своем составе гены белков р30, р54 и CD2v, также свидетельствуют о возможной роли CD2v в формировании защиты от АЧС [4].
Заключение
Таким образом, иммунизация свиней выделенным из зараженных вирусом АЧС А-клеток КМС серотипоспецифическим мажорным гликопротеином ГП 110-140 в составе липосом после контрольного заражения гомологичным вирулентным штаммом защищает от гибели 67 % животных.
Список литературы
1. Середа, А. Д. Серологические и физико-химические свойства ГП 110-140 вируса африканской чумы свиней / А. Д. Середа, Е. Г. Анохина, Л. Г. Фугина,
B. В. Макаров // Ветеринария. - М. - 1993. - № 1. -
C. 26-28.
2. Середа, А. Д. Идентификация изолятоспецифи-ческого гликополипептида вируса африканской чумы свиней / А. Д. Середа, В. В. Макаров // Ветеринария. -1992. - № 1. - С. 22-24.
3. Середа, А. Д. Иммунные реакции на вирус африканской чумы свиней / А. Д. Середа, С. Л. Соловкин, Л. Г. Фугина, В. В. Макаров // Вопросы вирусологии. -М. - 1992. - № 3. - С. 168-170.
4. Argilaguet, J. M. DNA Vaccination Partially Protects against African Swine Fever Virus Lethal Challenge in
the Absence of Antibodies / J. M. Argilaguet, E. Pérez-Martín, M. Nofrarías, C. Gallardo, F. Accensi, A. Lacasta, M. Mora, M. Ballester, I. Galindo-Cardiel, S. López-Soria, J. M. Escribano, P. A. Reche, F. Rodríguez // PLoS ONE. - 2012. - 7 (9). - P. 1-11.
5. Gómez-Puertas, P. The African Swine Fever Virus Proteins p54 and p30 Are Involved in Two Distinct Steps of Virus Attachment and Both Contribute to the Antibody-
Mediated Protective Immune Response / P. Gomez-Puertas, F. Rodriguez, J. M. Oviedo, A. Brun , C. Alonso, J.M Escribano // Virology. - 1998. - № 243. - P. 461-471.
6. Rodriguez, J. M. African swine fever virus encodes a CD2 homolog responsible for the adhesion of erythrocytes to infected cells / J. M. Rodriguez, R. J. Yanez, F. Almazan, E. Vinuela, J. F. Rodriguez // J. Virol. - 1993. - № 67. - P. 5312-5320.
НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии» приглашает принять участие в семинарах в I полугодии 2014 учебного года:
I
«Рентгенодиагностика
мелких домашних животных»
Семинар проводится с 2009 года. Состоит из теоретической и практической частей. В курсе теории слушатели знакомятся с терминологией, физическими и техническими аспектами рентгеновского излучения, общими принципами работы рентгеновского аппарата, рентгенологической фотохимией, характеристикой рентгенодиагностики исследуемых органов, укладками для рентгенографического исследования отдельных анатомических областей, картиной в норме и при патологии.
За время практических занятий в рентгеновском кабинете каждый участник семинара обучается самостоятельно изготавливать рентгеновский снимок. Большая часть семинара посвящена развитию практических навыков - чтению рентгеновских снимков. На примере более чем 2000 снимков из архива Института Ветеринарной Биологии подробно описывается норма и патология скелетных структур, органов грудной клетки и органов брюшной полости.
По окончании курсов слушатели проходят тестовое занятие по комплексному чтению рентгеновских снимков и получают соответствующие сертификаты.
Курс рассчитан на слушателей с базовым ветеринарным образованием. Курсы шестидневные, с 11.00 до 17.00. Форма оплаты: безналичный расчет.
График проведения
17-22 февраля, 14-19 апреля, 9-14 июня 2014 г.
«УЗИ-диагностика мелких домашних животных»
Семинар проводится совместно с НПП «Ра-текс» с 2006 года. Включает в себя теоретическую и практическую программы. В курсе теории слушатели знакомятся с общими принципами работы УЗ-аппаратов, датчиков, возможностями визуализации изображения внутренних органов брюшной полости, правилами укладки животных.
Отдельное занятие посвящено системам управления приборами УЗИ, правильному выбору настроек, созданию архивов и выдаче заключения.
За время проведения практических занятий каждый участник семинара обучается самостоятельно находить все органы брюшной полости, подлежащие визуализации, правильно их описывать, различать норму и патологию. Особое внимание уделяется развитию визуальных практических навыков - чтению эхограмм.
По окончании курсов слушатели проходят тестовое занятие и получают соответствующие сертификаты.
Базовый курс рассчитан на слушателей, начинающих обучение с нуля. Курсы шестидневные, с 11.00 до 17.00.
Для иногородних бронируется гостиница или общежитие. Форма оплаты: безналичный расчет.
График проведения
3-8 февраля, 3-8 марта, 7-12 апреля, 28 апреля - 3 мая, 26-31 мая 2014 г.
Видеоотзывы о семинарах на нашем канале на YouTube: www.youtube.com/user/invetbio
Для записи на семинары обращайтесь по тел. +7 921 095-89-27, (812) 927-55-92 Интересующие вас вопросы можно уточнить по электронной почте: invetbio@yandex.ru Вся информация о семинарах (график и место проведения, стоимость, программа занятий, отзывы слушателей) доступна на сайте: www.invetbio.spb.ru/seminars.html
V J
