CC BY
140
УДК 615.371
Иммуногенность различных форм гликопротеина S коронавируса ближневосточного респираторного синдрома
Т. А. Ожаровская1, О. В. Зубкова1, И. В. Должикова1, А. С. Громова1, Д. М. Гроусова1, А. И. Тухватулин1, О. Попова1, Д. В. Щебляков1, Д. Н. Щербинин1, А. Ш. Джаруллаева1, А. С. Ерохова1, М. М. Шмаров1, С. Я. Логинова2, С. В. Борисевич2, Б. С. Народицкий1, Д. Ю. Логунов1, А. Л. Гинцбург1
1Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18
2«48 центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской
Федерации, 141306, Сергиев Посад, ул. Октябрьская, 11
*E-mail: logunov@gamaleya.org
Поступила в редакцию 30.11.2018
Принята к печати 30.01.2019
РЕФЕРАТ Коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ) был идентифицирован в 2012 году во время первых вспышек ближневосточного респираторного синдрома (БВРС). БВРС-КоВ вызывает острую инфекцию нижних дыхательных путей у человека, летальность при которой составляет ~35%. Зарегистрированные средства профилактической и терапевтической защиты против БВРС в настоящее время отсутствуют. Гликопротеин S БВРС-КоВ играет важнейшую роль в интернализации вируса. Белок S является иммунодоминантным антигеном и основной мишенью для нейтрализующих антител. Нами проведено сравнение иммуногенности пяти различных форм гликопротеина S БВРС-КоВ: полноразмерного гликопротеина S, полноразмерного гликопротеина S с трансмембранным доменом гликопротеина G вируса VSV (S-G), рецепторсвязывающего домена RBD гликопротеина S, мембраносвязанного RBD (слитого с трансмембранным доменом гликопротеина G вируса VSV, RBD-G) и RBD, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека (RBD-Fc). Для доставки использовали рекомбинантные векторы на основе аденовируса человека серотипа 5 (rAd5). Вакцинация мышей всеми разработанными векторами rAd5 позволила сформировать сбалансированный ТМ/^2-ответ. Наиболее мощный антительный ответ развивался при иммунизации животных мембраносвязанным RBD (rAd5-RBD-G). Формирование нейтрализующих антител у всех вакцинированных животных наблюдалось только при иммунизации мембранными формами гликопротеина (rAd5-S, rAd5-S-G и rAd5-RBD-G). Наиболее выраженный клеточный ответ развивался при иммунизации животных полноразмерным S (rAd5-S). Проведенные исследования позволяют предположить, что среди всех изученных форм гликопротеина S наиболее перспективными для включения в вакцину против БВРС являются полноразмерный S и мембранная форма RBD (RBD-G).
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ближневосточный респираторный синдром, БВРС, БВРС-КоВ, гликопротеин, аденовирусный вектор, иммунитет.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 95% ДИ - 95% доверительный интервал; APC - аллофикоцианин; DPP4 - дипептидил-пептидаза 4; Fc - кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина; rAd5 - рекомбинантный вектор на основе аденовируса человека серотипа 5; RBD - рецепторсвязывающий домен гликопротеина S БВРС-КоВ; RBD-Fc - рецепторсвязывающий домен гликопротеина S БВРС-КоВ, слитый с Fc IgG1 человека; RBD-G - рецеп-торсвязывающий домен гликопротеина S БВРС-КоВ, слитый с трансмембранным доменом гликопротеина G вируса везикулярного стоматита; S - гликопротеин БВРС-КоВ; S1, S2 - субъединицы гликопротеина S БВРС-КоВ; S-G - гликопротеин БВРС-КоВ с трансмембранным доменом гликопротеина G вируса везикулярного стоматита; Th - Т-хелперные клетки; VSV - вирус везикулярного стоматита; БВРС - ближневосточный респираторный синдром; БВРС-КоВ (MERS-CoV) - коронавирус ближневосточного респираторного синдрома;
БОЕ - бляшкообразующие единицы; в.ч. - вирусные частицы; ГСТ - геометрическое среднее титра антител; ИФН-гамма - интерферон-гамма; ТМ - трансмембранный домен/форма; ТОРС - тяжелый острый респираторный синдром; ТОРС-КоВ - коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома; ФСБ - фосфатно-со-левой буфер; ФСБ-Т - фосфатно-солевой буфер с 0.1% Твин 20; ЭПР - эндоплазматический ретикулум.
ВВЕДЕНИЕ
Ближневосточный респираторный синдром (БВРС) - острое воспалительное заболевание органов дыхания, впервые был диагностирован в июне 2012 года в Саудовской Аравии. В 2013 году вирус, вызывающий БВРС, официально назвали корона-вирусом ближневосточного респираторного синдрома - БВРС-КоВ [1, 2]. БВРС-КоВ представляет собой одноцепочечный РНК-вирус, принадлежащий к семейству Coronaviridae, род Betacoronavirus. БВРС-КоВ, природным резервуаром которого являются одногорбые верблюды, попадают в организм человека при употреблении непастеризованного молока верблюдов, возможна также передача вируса аэрозольным путем [3-5].
На сегодняшний день зарегистрировано 2260 ла-бораторно подтвержденных случаев инфекции БВРС-КоВ, из них 803 с летальным исходом [6, 7]. В связи с высокой смертностью (около 35%) [6], широким распространением резервуара инфекции, а также с отсутствием эффективных профилактических и терапевтических препаратов против БВРС, специалисты ВОЗ относят БВРС-КоВ к вирусам, потенциально способным вызывать пандемии [8], для предотвращения которых необходима разработка вакцинного препарата.
Гликопротеин S - основной протективный антиген БВРС-КоВ, формирует тримеры на поверхности оболочки вируса и играет важную роль в ин-тернализации вируса в клетку [9]. Гликопротеин 8 состоит из двух субъединиц: 81, содержащей ре-цепторсвязывающий домен (RBD), и 82, опосредующей слияние мембран вируса и клетки [10-13]. Эти особенности делают белок 8 перспективной мишенью при разработке вакцин против БВРС [14-17]. Рецепторсвязывающий домен (RBD) гликопротеи-на 8 является ключевой мишенью при разработке профилактических и терапевтических препаратов против БВРС [18-20], так как он опосредует взаимодействие между вирусной частицей БВРС-КоВ и рецептором DPP4 на поверхности клетки.
Для разработки эффективной вакцины против БВРС важно понимать, какую форму гликопротеина необходимо использовать в составе вакцины, чтобы обеспечить защиту от БВРС. Опубликованы данные об иммуногенности различных форм гликопротеина БВРС-КоВ [21-25], но вопрос о том, что предпочтительнее выбрать для вакцины, остается открытым, поскольку панель антигенов не исследовали в одина-
ковых условиях. Чтобы устранить этот пробел, нами сконструированы пять рекомбинантных векторов на основе аденовируса человека серотипа 5 (rAd5), экспрессирующих различные варианты гликопроте-ина S БВРС-КоВ:
- полноразмерный гликопротеин S, который локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР);
- два секретируемых варианта рецепторсвязы-вающего домена гликопротеина S, содержащих ли-дерный пептид щелочной фосфатазы (RBD и RBD, слитый с Fc IgG1 человека, для повышения стабильности и иммуногенности [18, 19]),
- две трансмембранные (TM) формы, локализованные в плазматической мембране клетки - полноразмерный S и RBD с TM-доменом гликопротеина G вируса везикулярного стоматита (VSV). Поскольку полноразмерный гликопротеин S локализуется в ЭПР [26], мы сконструировали вариант S-G с деле-тированным сигналом локализации в ЭПР.
Для доставки гликопротеина S выбрана платформа на основе рекомбинантных вирусных векторов rAd5, поскольку такие векторы способны осуществлять эффективную доставку трансгена во многие типы клеток [27, 28]; их геном полностью охарактеризован, они способны к росту до высоких титров [29], а также способны индуцировать мощный гуморальный и клеточный иммунный ответ [30, 31].
В настоящей работе представлены результаты сравнения гуморального и клеточного иммунного ответа, индуцированного вакцинацией мышей rAd5, несущих различные формы гликопротеина S БВРС-КоВ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные линии
Клетки HEK293 и A549 получены из Российской коллекции клеточных линий позвоночных (Россия), клетки HEK293T и Vero E6 получены из АТСС (США). Все клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, при 37°С в 5% СО2.
Получение рекомбинантных аденовирусных частиц, экспрессирующих различные варианты гликопротеина S вируса БВРС-КоВ
Аминокислотные последовательности гликопротеи-на S БВРС-КоВ изолятов 2015-2017 годов получены из базы данных NCBI [32]. С использованием про-
граммы Geneious® 10.2.3 на основе аминокислотных последовательностей построена консенсусная последовательность гликопротеина S. Нуклеотидные последовательности, кодирующие различные формы гликопротеинов, были оптимизированы для экспрессии в клеточных линиях млекопитающих и синтезированы компанией «Евроген» (Россия). Получены пять рекомбинантных плазмид pAd5-S, pAd5-S-G, pAd5-RBD, pAd5-RBD-G и pAd5-RBD-Fc. rAd5 получали по методике, описанной ранее [33].
Получение лентивирусных частиц, псевдотипированных гликопротеином S БВРС-КоВ (псевдовирусов)
Для получения псевдовирусов клетки НЕК293Т высевали в 15-см культуральные чашки и котранс-фицировали тремя плазмидами (pCMVA R8,2; pLV-CMV-EGFP; pCMV-MERS-CoV-S). Спустя 72 ч супернатанты собирали, фильтровали, разливали в пробирки и замораживали при -80°С. Для титрования псевдовируса использовали клетки Vero E6. Титр псевдовируса выражали в единицах формирования фокусов флуоресценции (FFU, fluorescent forming units).
Определение экспрессии различных форм гликопротеина S вируса БВРС-КоВ методом вестерн-блотинга
Клетки HEK293 высевали в 35-мм чашки Петри и инкубировали в течение ночи до 70% монослоя, после чего клетки обрабатывали rAd5 в количестве 100 БОЕ/клетку. rAd5-null использовали как контрольный вирус. Экспрессию различных форм гликопротеина вируса БВРС-КоВ определяли через 24 ч методом вестерн-блотинга с использованием антител, специфичных к гликопротеину S (40069-RP02, Sino Biological, Китай), и антител, специфичных к IgG кролика (NA934V, GE, Великобритания). Экспрессию мембраносвязанных вариантов гликопротеина (S, S-G, RBD-G) детектировали в лизатах клеток, приготовленных с помощью буфера Cell Culture Lysis Reagent (Promega, США). Экспрессию секретируемых вариантов гликопротеина (RBD, RBD-Fc) детектировали в среде от клеток. На лунку наносили по 10 мкл образцов лизатов (10 мкг общего белка), образцы среды наносили в количестве 10 мкл на лунку.
Лабораторные животные
Все эксперименты на животных проводили в строгом соответствии с рекомендациями Национального стандарта Российской Федерации (ГОСТ 33044-2014, «Принципы надлежащей лабораторной практики»). Шестинедельные самки мышей C57/BL6 (18-20 г) были получены из питомника Пущино (Россия).
Мыши имели свободный доступ к воде и пище, размещались в системе содержания животных ISOcage (Tecniplast, Италия).
Иммунизация и сбор образцов сывороток
Мышей случайным образом распределяли по группам (n = 5 при анализе гуморального ответа, n = 9 при анализе клеточного ответа) и вакцинировали ре-комбинантными аденовирусными частицами внутримышечно в дозе 108 в.ч./мышь в общем объеме 0.1 мл. Сыворотки собирали через 21 день после вакцинации для исследования титров S-специфических IgG.
Определение титра антител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА)
Титр гликопротеин-специфических антител в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа. Использовали рекомбинантные белки: гликопротеин S (40069-V08B; Sino Biological) и RBD (40071-V08B1; Sino Biological). Блокирование мест неспецифического связывания проводили раствором ФСБ в 0.1% Твин 20 (ФСБ-Т), содержащем 5% обезжиренного молока (A0830; AppliChem, Испания). Сыворотки титровали двукратным шагом в растворе ФСБ-Т с 3% обезжиренным молоком. Для детекции использовали вторичные антитела, специфичные к IgG мыши и конъюгированные с пероксидазой хрена (для определения общего титра IgG - NXA931 (GE Healthcare, США); для IgG1 - ab97240 (Abcam, Великобритания); для IgG2a - ab97245 (Abcam); для IgG2b - ab97250 (Abcam); для IgG3 - ab97260 (Abcam)). Проявляли с использованием раствора тетраметилбензидина (НИИОПиК, Россия). Реакцию останавливали добавлением 1 M H2SO4, оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм (OD450) на планшетном спектрофотометре Multiscan FC (Thermo Fisher Scientific). Титр IgG определяли как максимальное разведение сыворотки, в котором значение OD450 сыворотки иммунизированного животного превосходит значение контрольной сыворотки более чем в 2 раза.
Реакция нейтрализации псевдовирионов (PsVNA)
Реакцию нейтрализации псевдовирионов (PsVNA) проводили по методике, описанной ранее [34]. Готовили разведения сывороток, инактивированных нагреванием: 1 : 10, 1 : 40, 1 : 160 и 1 : 640. Затем эти образцы смешивали с равным объемом среды DMEM, содержащим 105 FFU/мл псевдовирионов. Эту смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С, инокулировали на монослой клеток Vero E6 и инкубировали при 37°С в течение 42 ч. Затем подсчитывали количество фокусов флуоресцентных клеток EGFP. Титр нейтрализации псевдовирионов в сыворотке иммунизированного животного определяли как максимальное
разведение, при котором наблюдали 50% снижение количества фокусов флуоресцентных клеток EGFP по сравнению с сыворотками интактных (не вакцинированных) животных.
Анализ Т-клеточного ответа (лимфопролиферативный анализ)
Животных забивали на 8 день после иммунизации и отбирали селезенки, которые гомогенизировали через сито с диаметром пор 100 мкм в стерильном ФСБ. Спленоциты выделяли с помощью центрифугирования (800 g, 30 мин) на подушке раствора фиколла (1.09 г/мл, «ПанЭко», Россия). Для анализа пролиферации Т-клеток спленоциты окрашивали карбоксифлуорес-цеином с использованием набора Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) tracer kit (Invitrogen, США) по описанной ранее методике [35]. Клетки рассевали в 96-луночные планшеты в количестве 200000 клеток на лунку в среде RPMI1640, рестимулировали реком-бинантным S БВРС-КоВ (40071-V08B1; Sino Biological) в количестве 1 мкг/лунку. Через 3 дня клетки собирали, промывали ФСБ и окрашивали антителами, специфичными к CD3, CD4 и CD8: аллофикоцианин (АРС)-меченные антитела к CD3, АРС-Су7-меченные антитела к CD8 и фикоэритрин-меченные антитела к CD4 (BD Biosciences, США), и фиксировали в растворе 1% параформальдегида. Пролиферирующие CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты определяли в клеточной смеси с использованием проточного цитофлуориметра BD FACS Aria III (BD Biosciences). Результирующий процент пролиферирующих клеток (Х) рассчитывали по формуле Х = %st - %, где %st - процент пролифе-рирующих клеток после рестимуляции спленоцитов рекомбинантным гликопротеином S вируса БВРС-КоВ, а % - процент пролиферирующих клеток без ре-стимуляции (интактных клеток).
Статистический анализ
Статистический анализ выполнен с использованием программного обеспечения GraphPad 7.0 (GraphPad Software, США). При анализе данных несвязанных выборок использовали критерий Стьюдента для независимых образцов или критерий Манна-Уитни в зависимости от нормальности распределения данных. Нормальность распределения определяли с помощью обобщенного теста Д'Агостино-Пирсона.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Получение rAd5
Для определения и сравнения иммуногенности различных форм гликопротеина S вируса БВРС-КоВ нами получено пять rAd5: rAd5-S, rAd5-S-G, rAd5-RBD, rAd5-RBD-G и rAd5-RBD-Fc. Схемы целевых трансгенов в геномах rAd5 показаны на рис. 1А.
А
rAd5-S rAd5-S-G rAd5-RBD rAd5-RBD-G rAd5-RBD-Fc
кДа 250 150
100 75
50
12 3 4
15 6 7
Б
Анализ продукции интерферона гамма (ИФН-гамма)
Спленоциты выделяли на 15 день после вакцинации по методике, описанной выше. Клетки рассевали в 96-луночные планшеты в количестве 200000 клеток на лунку в среде RPMI1640, далее их рестимулировали рекомбинантным S БВРС-КоВ (40071-V08B1; Sino Biological) в количестве 1 мкг/лунку. Через 48 ч собирали надосадочную среду. Концентрацию ИФН-гамма в среде измеряли методом ИФА с помощью коммерческого набора (mouse IFN-y ELISA kit; Invitrogen) по протоколу фирмы-производителя. Прирост концентрации ИФН-гамма определяли по формуле Х = Cst /Cint, где Х - прирост концентрации ИФН-гамма (разы), Cst - концентрация ИФН-гамма в среде от стимулированных клеток (пг/ мл), Cint - концентрация ИФН-гамма в среде от не-стимулированных (интактных) клеток (пг/мл).
Рис. 1. A - схемы целевых трансгенов в геномах rAd5-S, rAd5-S-G, rAd5-RBD, rAd5-RBD-G и rAd5-RBD-Fc. cmv - промотор Е1-области цитомегаловируса человека; G - ген гликопротеина G вируса везикулярного стоматита; LP - лидерная последовательность, опосредующая секрецию белка; pA - сигнал полиаденилирования; RBD - рецепторсвязывающий домен гликопротеина S БВРС-КоВ; Spike - гликопро-теин S БВРС-КоВ. Б - Вестерн-блот-анализ вариантов гликопротеина S БВРС-КоВ, экспрессируемых каждым rAd5. Линия 1 - лизат клеток, обработанных контрольным rAd5-null; линия 2 - интактные клетки; линия 3 -лизат клеток, обработанных rAd5-S; линия 4 - лизат клеток, обработанных rAd5-S-G; линия 5 - среда от клеток, обработанных rAd5-RBD; линия 6 - лизат клеток, обработанных rAd5-RBD-G; линия 7 - среда от клеток, обработанных rAd5-RBD-Fc
о
J? х и к с е ч и -fr
и ц
е п
с -
on
р
107i
106^
105
104
103
А
4-
0 0 6
V
о
х и к
с е ч и
-fr
и ц
е п
с -
о
CO X
р
107106 105 104 103
•kie "kie
т^т * Î *
-S G G D c е е Т -S G G
5- d A r - S - 5 d - D B -R B R - 5 d - D B R ы н т к а ы н т о в 5- d A r - S - 5 d - D B -R
A 5- A -5 т н и A 5-
r d A r d A И ж r d A
О
CO X
-
un
Ti <
О
CO X
-
un
Ti <
0
0
8
<
е е
ы ы
н н
т т
к о
а в
т и
н И ж
Рис. 2. Титры гликопротеин-специфических IgG в сыворотках крови иммунизированных животных. Представлены титры IgG, специфичных к гликопротеину S БВРС-КоВ (А) и к RBD (Б). Отмечено геометрическое среднее титра (ГСТ) и 95% доверительный интервал ГСТ для каждой группы (n = 5). Звездочки указывают на статистически значимые различия в титрах IgG между группами. * p < 0.05, сравнение rAd5-RBD-Fc с другими группами; ** p < 0.05, сравнение rAd5-RBD и rAd5-RBD-G с другими группами, за исключением rAd5-RBD и rAd5-RBD-G (тест Манна-Уитни)
Б
Экспрессию различных форм гликопротеина S БВРС-КоВ анализировали методом вестерн-блотин-га (рис. 1Б). В образцах полноразмерного гликопротеина (rAd5-S и rAd5-S-G) белок S выявляли в виде двух полипептидов (рис. 1Б), причем верхняя полоса представляла собой гликозилированную форму белка S (~230-250 кДа), а нижняя (~100 кДа) - субъединицу S1, которая образуется в результате расщепления полноразмерного S протеазами клетки. Молекулярные массы полос превышали рассчитанные по нуклеотидной последовательности, что свидетельствует о предполагаемом гликозилировании белка [14, 16, 36-38]. В образцах RBD (RBD, RBD-G и RBD-Fc) выявлен единственный полипептид (рис. 1Б) с массой ~25, ~30 и ~55 кДа соответственно. Масса полипептидов на основе RBD соответствовала расчетным.
rAd5, экспрессирующие различные формы гликопротеина S вируса БВРС-КоВ, индуцируют формирование гуморального иммунного ответа
Мышей иммунизировали препаратами rAd5-S, rAd5-S-G, rAd5-RBD, rAd5-RBD-G и rAd5-RBD-Fc внутримышечно однократно в дозе 108 в.ч. Через 3 недели после иммунизации собирали сыворотки крови мышей и анализировали титры антител, специфичных к гликопротеину S и к RBD (рис. 2). В сыворотке крови мышей контрольных групп (не-иммунизированные и иммунизированные rAd5-null) гликопротеин-специфические IgG не обнаружены. Наибольший титр IgG, специфичных к гликопро-
теину S, наблюдали в группе животных, иммунизированных rAd5-RBD-G [геометрическое среднее титра (ГСТ): 356055; 95% доверительный интервал (ДИ): 139042-911772], наименьший - у животных, иммунизированных rAd5-RBD-Fc (ГСТ: 29407, 95% ДИ: 11455-75492) (рис. 2А). Анализ IgG, специфичных к RBD, показал, что наиболее иммуногенными были конструкции rAd5-RBD-G (ГСТ: 89144, 95% ДИ: 60665-130994) и rAd5-RBD (ГСТ: 58831, 95% ДИ: 40024-86424), а наименее иммуногенной - rAd5-RBD-Fc (ГСТ: 6400, 95% ДИ: 2230-18364). Статистически значимых различий в титрах IgG, специфичных к RBD, между группами rAd5-RBD и rAd5-RBD-G не обнаружено (рис. 2Б).
У мышей известно четыре изотипа IgG, которые отвечают за идентификацию и клиренс многих антигенов: IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 [39]. Определение титров изотипов IgG через 3 недели после иммунизации показало, что у всех иммунизированных животных представлены все четыре изотипа IgG (рис. 3). Значения титров IgG1, IgG2a и IgG2b для каждой группы иммунизированных животных составляли: rAd5-S (ГСТ: 409600, 409600 и 89144 соответственно), rAd5-S-G (ГСТ: 540470, 470506 и 155209 соответственно), rAd5-RBD (ГСТ: 540470, 713155 и 135118 соответственно) и rAd5-RBD-G (ГСТ: 356578, 713155 и 204800 соответственно). При этом не обнаружено статистически значимых различий в титрах изоти-пов IgG. После вакцинации rAd5-RBD-Fc значения титров IgG1, IgG2a и IgG2b были существенно ниже, чем в других группах (ГСТ: 102400, 89144 и 12800 со-
Л
О J?
X
s х и <и т s
-fr ZS
<и □
и
I
on Q.
107
106
105 -i
104
103
igGl *
I-
t
0 0
<■0 V
IgG2b
-Q
rs 107 g
X
s x
и <u
T
s -fr ZS
<u □
и
on Q.
106
105
104
103
0 0
CO
V
—r~ Ш .0 I H X
ra
H I
X
—Г~
on
I
un
Ti <
—Г"
G
I
on
I
un
Ti <
ra
2
G Ig
X
s x
и <U T
s -fr s ZS
<u □
и
I
on Q.
107106 105 104
103
IgG2a *
I-
0 0
«•o V
<u on G G Q U <u on G G
.0 I H X га un Ti < S— 1 on 1 un Ti 1 Q cû OÉ cû X 1 un T 1 Q cû X .0 I H X ra un Ti < S— 1 on 1 un Ti 1 Q cû IX
H I X < S— un Ti < < S— 1 un Ti < H I X < S— un T <
—I—
Q cû X
I
un
Ti <
igG3
m
G Ig
x s x
и <u
T
s
-fr s ZS
<u □
и
I
on Q.
107
106
105
104
103
102
A
0 0 2
v
G 1 Q U Ф on G 1 G 1 Q
cû LL .0 un Ti < S— cû
Q cû X X 1 un Ti ci cû X I H X ra on 1 un Ti Q cû X X 1 un T
un < un H I < un <
T < S— S— Ti < X T < S— S—
л. -è- i
—Г"
и
LL
I
Q cû X
I
un
Ti <
A ^
î
—
u LL
I
Q cû X
I
un
Ti <
Рис. 3. Анализ изотипов IgG-антител у мышей после иммунизации rAd5, экспрессирующими различные формы гликопротеина S БВРС-КоВ. Представлены титры IgG1 (А), IgG2a (Б), IgG2b (б) и IgG3 (Г), специфичных к гли-копротеину S БВРС-КоВ, в сыворотке иммунизированных животных. Отмечено геометрическое среднее титра (ГСТ) и 95% доверительный интервал ГСТ для каждой группы (п = 5). Звездочки указывают на статистически значимые различия в титрах IgG между группами. * р < 0.05, тест Манна-Уитни
Б
В
ответственно). Титр IgG3 не различался существенно в группах (rAd5-S, rAd5-S-G, rAd5-RBD, rAd5-RBD-G и rAd5-RBD-Fc; ГСТ: 33779, 14703, 51200, 33779 и 5572 соответственно). Таким образом, согласно полученным данным, наибольший вклад в общий титр гликопротеин-специфических IgG вносят изо-типы IgG1 и IgG2a.
rAd5, экспрессирующие мембранные формы гликопротеина БВРС-КоВ, вызывают выработку нейтрализующих антител у мышей
Определение титра нейтрализующих антител (в реакции нейтрализации псевдовирионов) показало,
что сыворотки крови всех мышей, иммунизированных rAd5-S, rAd5-S-G и rAd5-RBD-G, содержат нейтрализующие антитела (рис. 4) с ГСТ 1 : 121, 1 : 160 и 1 : 70 соответственно, без статистически значимой разницы в титрах (р > 0.05). В группе rAd5-RBD только у трех мышей из пяти обнаружены нейтрализующие антитела, тогда как в группах rAd5-RBD-Fc и у интактных животных нейтрализующие антитела не обнаружены. Таким образом, результаты проведенного эксперимента показали, что только иммунизация rAd5, экспрессирующими мембранные формы гликопротеина (S, S-G, RBD-G), позволяет индуцировать выработку нейтрализующих антител.
rAd5, экспрессирующие варианты S-белка БВРС-КоВ, индуцируют формирование клеточного иммунного ответа
Поствакцинальный клеточный иммунный ответ оценивали двумя методами - по количеству пролифе-
<и
1
га х х
и
2
м
X
с
га а
н
<и
I
а
н
1000-
100
10,
00 - О О
5 ■а - 00 - о
< 5- ■а ей
< 5-
■а
<
а
са X
I
■а <
о
ой X
I
■а <
ш ш .0 .0 I I н н
£ 0 Ш со
И
Рис. 4. Титры нейтрализующих антител в сыворотках крови иммунизированных животных. Реакцию нейтрализации проводили с использованием лентивирусных частиц, псевдотипированных гликопротеином S БВРС-КоВ. Отмечено геометрическое среднее титра (ГСТ) и 95% доверительный интервал ГСТ для каждой группы (п = 5). Звездочки указывают на отсутствие значимых различий в титрах нейтрализующих антител между группами. * р > 0.05, тест Манна-Уитни
рирующих Т-клеток и по продукции ИФН-гамма Т-клетками в ответ на рестимуляцию гликопротеином. Повторную стимуляцию проводили с использованием полноразмерного S, так как он содержит наибольшее количество эпитопов и присутствует в вирусных частицах БВРС-КоВ.
Анализ пролиферации CD4+ клеток на 8-й день после вакцинации (рис. 5, слева) выявил наибольшую лимфопролиферативную активность в группе rAd5-S (2.10%) и наименьшую - в группе rAd5-RBD-Fc (0.25%). Статистически значимые различия в лим-фопролиферативном ответе CD4+ клеток между группами иммунизированных и интактных животных наблюдали в группах rAd5-S (2.10%) и rAd5-S-G (1.63%). Анализ пролиферации CD8+ клеток (рис. 5, справа) выявил наибольшую лимфопролифератив-ную активность в группе rAd5-S (1.90%), наименьшую - в группе rAd5-RBD-Fc (0.35%). Статистически значимые различия в лимфопролиферативном ответе CD8+ клеток между группами иммунизированных и интактных животных наблюдали в группах rAd5-S (1.90%), (1.15%) и rAd5-RBD-G (0.55%).
Исследование продукции ИФН-гамма спленоцитами после рестимуляции гликопротеином S БВРС-КоВ также показало, что наиболее выраженный клеточный иммунный ответ развивался у животных, иммунизированных rAd5-S и rAd5-S-G (рис. 6): прирост концентрации ИФН-гамма составил 15.12 ± 0.43 и 10.14 ± 0.97 раза относительно интактных клеток соответственно.
е
и щи
а £
ик рт
ее
лТ
о р
с
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
CD4+
т
е ы н т к а т н
х
—Г"
00
-5
■а <
е
и щи
а £
ик рт
ее
лТ
о р
с
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
CD8+
О О о и е 00 О О
- 00 -5 ■а - о ой ой X -5 ■а - о ой X ы н т к а 5- ■а < - 00 -5 ■а - о ой
< 5- ■а < < -5 ■а < т н И < 5- ■а <
о
ей X
-5
■а <
о
ой X
-5
■а <
Рис. 5. Исследование лимфопролиферативной активности спленоцитов у иммунизированных мышей. По осям ординат отмечены уровни (%) пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-клеток, рестимулированных белком S БВРС-КоВ на 8-й день после вакцинации. Отмечены медианы пролиферирующих клеток (%) после рестимуляции и 95% ДИ медианы для каждой группы (п = 6). Звездочки указывают на статистически значимые различия в % пролиферирующих клеток между вакцинированными и интактными животными. * р < 0.05, тест Манна-Уитни
х
£ 2
та п га
£ о.
и "Г
с
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
I
'ИВ*
е 00 О
ы н т 5Т! - 00 -
к < 5
а "а
т н <
И
* -*-1-
О
I
о
ой X
I
ип
Т! <
О ой X
I
ип
Т! <
О ой X
I
ип
Т! <
Рис. 6. Прирост концентрации ИФН-гамма в среде спленоцитов иммунизированных мышей после рести-муляции рекомбинантным полноразмерным белком S вируса БВРС-КоВ. Отмечены медианы прироста концентрации ИФН-гамма после рестимуляции и 95% ДИ медианы для каждой группы (п = 3). Звездочки указывают на статистически значимые различия в приросте концентрации ИФН-гамма между клетками от вакцинированных и интактных животных. * р < 0.05, тест Стьюдента для независимых выборок
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В настоящее время не существует специфических профилактических и терапевтических средств против ближневосточного респираторного синдрома. Интенсивные исследования, направленные на разработку вакцин против этого заболевания, ведутся в США, Германии, Корее и других странах [40, 41]. Известно несколько кандидатных вакцин на основе гликопротеина БВРС-КоВ: вирусные векторы на основе рекомбинантных вирусов осповакцины, аденовируса, вируса кори и др., ДНК-вакцины, комбинированные кандидатные вакцины на основе ДНК и рекомбинантного белка, кандидатные вакцины на основе вирусоподобных частиц и рекомбинантных белков [22, 38, 41-46].
Ключевым моментом в разработке вакцины является выбор антигена. Большинство вакцин против БВРС основаны на использовании различных форм гликопротеина БВРС-КоВ (полноразмерный S, субъединица S1, RBD) [14-16, 18, 22, 24, 47-55] - основной мишени нейтрализующих антител. Однако вопрос о том, какую форму выбрать для получения эффективной вакцины, остается открытым. Известно, что использование полноразмерного S обеспечивает защиту 100% животных от летальной инфекции, вызванной БВРС-КоВ [44]. Однако некоторые авторы высказывают опасения по пово-
ду использования полноразмерного S БВРС-КоВ в составе вакцины. Так сообщалось, что вакцина на основе полноразмерного гликопротеина корона-вируса тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС), который, как и БВРС-КоВ, относится к роду Betacoronavirus, приводит к развитию иммунопатологии в легких, обусловленной мощным антительным ответом на гликопротеин ТОРС-КоВ и слабым клеточным (№2-поляризованный иммунный ответ) [56, 57].
Модификации гликопротеина в основном были направлены на то, чтобы в антиген входил рецеп-торсвязывающий домен гликопротеина. Показана иммуногенность S1-субъединицы, RBD или RBD, слитого с Fc-фрагментом IgG человека [15, 18, 19, 49, 58]. Исследования протективности препаратов на основе RBD (субъединичные вакцины) показали, что вакцинация RBD защищала ~80% животных от БВРС-КоВ, несмотря на высокие титры нейтрализующих антител, способных блокировать взаимодействия между вирусом и рецептором DPP4 на поверхности клетки [42, 59]. Отсутствие 100% защиты связано, по всей видимости, с необходимостью развития клеточного иммунного ответа, а также блокирования слияния мембран вируса и клетки, опосредованного S2-субъединицей. Кроме того, использование субъединичных, а также инактивированных вакцин не позволяет сформировать сбалансированный ТЫ/№2-ответ и часто приводит к формированию №2-поляризованного иммунного ответа [22, 42], развитие которого в случае БВРС может привести к иммунопатологии легких [48]. Поэтому при разработке вакцины против БВРС важно учитывать, что иммунитет, индуцированный вакциной, должен быть ТЫ/^2-сбалансированным.
Исследовано множество антигенов на основе гли-копротеина S БВРС-КоВ; однако не проводилось прямого сравнения этих антигенов в одинаковых условиях (с использованием одинаковых платформ для доставки антигенов). В настоящей работе проведено прямое сравнение иммуногенности пяти различных форм гликопротеина S БВРС-КоВ в одинаковых условиях, для доставки использовали rAd5. У животных, вакцинированных rAd5, экспрессирующи-ми различные формы гликопротеина S БВРС-КоВ, развивался мощный антительный (преимущественно IgG1 и IgG2a) и Т-клеточный ответ, причем каждый из вариантов rAd5 позволял сформировать сбалансированный Th1/Th2-ответ, что является одним из ключевых моментов в разработке вакцины против БВРС. Исследование напряженности гуморального иммунного ответа показало, что мембранная форма RBD (rAd5-RBD-G) вызывает более мощный IgG-ответ, чем другие исследуемые формы. Показано
также, что только мембранные формы гликопротеина БВРС-КоВ (rAd5-S, rAd5-S-G и rAd5-RBD-G) стимулировали выработку нейтрализующих антител. Исследование напряженности клеточного иммунного ответа показало, что наибольшей иммуногенностью обладают формы полноразмерного гликопротеина БВРС-КоВ (rAd5-S и rAd5-S-G).
Таким образом, результаты нашей работы позволяют предположить, что из всех изученных форм гликопротеина S БВРС-КоВ наибольший интерес для включения в вакцину представляют полноразмерный гликопротеин S и мембранная форма RBD (RBD-G).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе изучена иммуногенность пяти вариантов гликопротеина S вируса БВРС-КоВ у мышей. Для доставки антигенов использовали платформу на основе рекомбинантных аденовирусных векторов rAd5. Нами показано, что:
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. de Groot R.J., Baker S.C., Baric R.S., Brown C.S., Drosten C., Enjuanes L., Fouchier R.A.M., Galiano M., Gorbalenya A.E., Memish Z.A., et al. // J. Virol. 2013. V. 87. № 14. P. 7790-7792.
2. Zaki A.M., van Boheemen S., Bestebroer T.M., Osterhaus A.D., Fouchier R.A. // N. Engl. J. Med. 2012. V. 367. № 19. P. 1814-1820.
3. Memish Z.A., Cotten M., Meyer B., Watson S.J., Alsahafi A.J., Al Rabeeah A.A., Corman V.M., Sieberg A., Makhdoom H.Q., Assiri A., et al. // Emerg. Infect. Dis. 2014. V. 20. № 6.
P. 1012-1015.
4. Reusken C.B., Farag E.A., Jonges M., Godeke G.J., El-Sayed A.M., Pas S.D., Raj V.S., Mohran K.A., Moussa H.A., Ghobashy H., et al. // Euro. Surveill. 2014. V. 19. № 23. P. 1-5.
5. Azhar E.I., Hashem A.M., El-Kafrawy S.A., Sohra S.S., Aburizaiza A.S., Farraja S.A., Hassan A.M., Al-Saeeda M.S., Jamjoom G.A., Madani T.A. // MBio. 2014. V. 5. № 4. P. 1-4.
6. World Health Organisation | Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV). http://www.who.int/ emergencies/mers-cov/en/.
7. Aly M., Elrobh M., Alzayer M., Aljuhani S., Balkhy H. // PLoS One. 2017. V. 12. № 10. P. 1-11.
8. World Health Organisation | WHO Research and Development Blueprint: 2017 Annual review of diseases prioritized under the Research and Development Blueprint. http:// www.who.int/blueprint/what/research-development/2017-Prioritization-Long-Report.pdf.
9. Qian Z., Dominguez S.R., Holmes K.V. // PLoS. One. 2013. V. 8. № 10. P. e76469.
10. Millet J.K., Whittaker G.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111. № 42. P. 15214-15219.
11. Lu G., Wang Q., Gao G.F. // Trends Microbiol. 2015. V. 23. № 8. P. 468-478.
12. Lu L., Liu Q., Zhu Y., Chan K.-H., Qin L., Li Y., Wang Q., Chan J.F.-W., Du L., Yu F., et al. // Nat. Commun. 2014. V. 5. № 3067. P. 1-12.
13. Raj V.S., Mou H., Smits S.L., Dekkers D.H., Müller M.A., Dijk-man R., Muth D., Demmers J.A., Zaki A., Fouchier R.A., et al. // Nature. 2013. V. 495. № 7440. P. 251-254.
- наиболее мощный антительный ответ развивался при иммунизации животных мембраносвязанным RBD (rAd5-RBD-G);
-только мембранные формы гликопротеина БВРС-КоВ (rAd5-S, rAd5-S-G и rAd5-RBD-G) индуцировали выработку нейтрализующих антител у всех вакцинированных мышей;
- наиболее выраженный клеточный иммунный ответ развивался при иммунизации животных полноразмерным гликопротеином (rAd5-S);
- вакцинация мышей всеми разработанными векторами rAd5 позволила сформировать сбалансированный Th1/Th2-ответ. •
Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации (номер государственного задания 056-00108-18-00).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с публикацией этой статьи.
14. Song F., Fux R., Provacia L.B., Volz A., Eickmann M., Becker S., Osterhaus A.D., Haagmans B.L., Sutter G. // J. Virol. 2013. V. 87. № 21. P. 11950-11954.
15. Kim E., Okada K., Kenniston T., Raj V.S., AlHajri M.M., Farag E.A.B.A., AlHajri F., Osterhaus A.D.M.E., Haagmans B.L., Gambotto A. // Vaccine. 2014. V. 32. № 45. P. 5975-5982.
16. Guo X., Deng Y., Chen H., Lan J., Wang W., Zou X., Hung T., Lu Z., Tan W. // Immunology. 2015. V. 145. № 4. P. 476-484.
17. Liu R., Wang J., Shao Y., Wang X., Zhang H., Shuai L., Ge J., Wen Z., Bu Z. // Antiviral Res. 2018. V. 150. P. 30-38.
18. Du L., Kou Z., Ma C., Tao X., Wang L., Zhao G., Chen Y., Yu F., Tseng C.T.K., Zhou Y., Jiang S. // PLoS One. 2013. V. 8. № 12. P. 2-10.
19. Du L., Zhao G., Kou Z., Ma C., Sun S., Poon V.K.M., Lu L., Wang L., Debnath A.K., Zheng B.-J., et al. // J. Virol. 2013. V. 87. № 17. P. 9939-9942.
20. Ma C., Li Y., Wang L., Zhao G., Tao X., Tseng C.T.K., Zhou Y., Du L., Jiang S. // Vaccine. 2014. V. 32. № 18. P. 2100-2108.
21. Al-Amri S.S., Abbas A.T., Siddiq L.A., Alghamdi A., Sanki M.A., Al-Muhanna M.K., Alhabbab R.Y., Azhar E.I., Li X., Hashem A.M. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 44875. P. 1-8.
22. Ma C., Wang L., Tao X., Zhang N., Yang Y., Tseng C.T.K., Li F., Zhou Y., Jiang S., Du L. // Vaccine. 2014. V. 32. № 46. P. 6170-6176.
23. Pallesen J., Wang N., Corbett K.S., Wrapp D., Kirchdoerfer R.N., Turner H.L., Cottrell C.A., Becker M.M., Wang L., Shi W., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017. V. 114. № 35. P. E7348-E7353.
24. Wang L., Shi W., Joyce M.G., Modjarrad K., Zhang Y., Leung K., Lees C.R., Zhou T., Yassine H.M., Kanekiyo M., et al. // Nat. Commun. 2015. V. 6. P. 7712.
25. Zhang N., Channappanavar R., Ma C., Wang L., Tang J., Garron T., Tao X., Tasneem S., Lu L., Tseng C.T., Zhou Y., Perl-man S., Jiang S., Du L. // Cell. Mol. Immunol. 2016. V. 13. № 2. P. 180-190.
26. Du L., Yang Y., Zhou Y., Lu L., Li F., Jiang S. // Expert Opin. Ther. Targets. 2017. V. 21. № 2. P. 131-143.
27. Appaiahgari M.B., Vrati S. // Expert Opin. Biol. Ther. 2015. V. 15. № 3. P. 337-351.
28. Benihoud K., Yeh P., Perricaudet M. // Curr. Opin. Biotech-nol. 1999. V. 10. № 5. P. 440-447.
29. Kamen A., Henry O. // J. Gene Med. V. 6. P. 184-192.
30. Muruve D.A. // Hum. Gene Ther. 2004. V. 15. № 12. P. 11571166.
31. Dolzhikova I.V., Tokarskaya E.A., Dzharullaeva A.S., Tukh-vatulin A.I., Shcheblyakov D.V., Voronina O.L., Syromyatniko-va S.I., Borisevich S.V., Pantyukhov V.B., Babira V.F., et al. // Acta Naturae. 2017. V. 9. № 3. P. 4-11.
32. Hatcher E.L., Zhdanov S.A., Bao Y., Blinkova O., Nawrocki E.P., Ostapchuck Y., Schäffer A.A., Brister J.R. // Nucl. Acids. Res. 2017. V. 45. № D1. P. D482-D490.
33. Gribova I.Y., Tillib S.V., Tutykhina I.L., Shmarov C.E., Logunov D.Y., Verkhovskaya L.V., Naroditskii B.S., Gintsburg A.L. // Acta Naturae. 2011. V. 3. № 3. P. 64-70.
34. Grehan K., Ferrara F., Temperton N. // Methods X. 2015. V. 2. P. 379-384.
35. Qu ah B.J., Warren H.S., Parish C.R. // Nat. Protoc. 2007. V. 2. № 9. P. 2049-2056.
36. Chi H., Zheng X., Wang X., Wang C., Wang H., Gai W., Perl-man S., Yang S., Zhao J., Xia X. // Vaccine. 2017. V. 35. № 16. P. 2069-2075.
37. Deng Y., Lan J., Bao L., Huang B., Ye F., Chen Y., Yao Y., Wang W., Qin C., Tan W. // Emerg. Microbes Infect. 2018. V. 7. № 60. P. 1-10.
38. Nyon M.P., Du L., Tseng C.K., Seid C.A., Pollet J., Nacean-ceno K.S., Agrawal A., Algaissi A., Peng B.H., Tai W., et al. // Vaccine. 2018. V. 36. № 14. P. 1853-1862.
39. Snapper C.M., Mond J.J. // Immunol. Today. 1993. V. 14. № 1. P. 15-17.
40. Perlman S., Vijay R. // Int. J. Infect. Dis. 2016. V. 47. P. 23-28.
41. Okba N.M., Raj V.S., Haagmans B.L. // Curr. Opin. Virol. 2017. V. 23. P. 49-58.
42. Tai W., Zhao G., Sun S., Guo Y., Wang Y., Tao X., Tseng C.K., Li F., Jiang S., Du L., Zhou Y. // Virology. 2016. V. 499. P. 375-382.
43. Alharbi N.K., Padron-Regalado E., Thompson C.P., Kupke A., Wells D., Sloan M.A., Grehan K., Temperton N., Lambe T., Warimwe G., et al. // Vaccine. 2017. V. 35. № 30. P. 3780-3788.
44. Munster V.J., Wells D., Lambe T., Wright D., Fischer R.J., Bushmaker T., Saturday G., van Doremalen N., Gilbert S.C.,
De Wit E., et al. // NPJ. Vaccines. 2017. V. 2. P. 28.
45. Malczyk A.H., Kupke A., Prüfer S., Scheuplein V.A., Hutzler S., Kreuz D., Beissert T., Bauer S., Hubich-Rau S., Tondera C., et al. // J. Virol. 2015. V. 89. № 22. P. 11654-11667.
46. Lan J., Deng Y., Song J., Huang B., Wang W., Tan W. // Virol. Sin. 2018. V. 33. № 5. P. 453-455.
47. Modjarrad K. // Vaccine. 2016. V. 34. № 26. P. 2982-2987.
48. Agrawal A.S., Tao X., Algaissi A., Garron T., Narayanan K., Peng B.H., Couch R.B., Tseng C.T.K. // Hum. Vaccin. Immunother. 2016. V. 12. № 9. P. 2351-2356.
49. Coleman C.M., Liu Y.V., Mu H., Taylor J.K., Massare M., Flyer D.C., Glenn G.M., Smith G.E., Frieman M.B. // Vaccine. 2014*.
V. 32. № 26. P. 3169-3174.
50. Haagmans B.L., van den Brand J.M.A., Raj V.S., Volz A., Wohlsein P., Smits S.L., Schipper D., Bestebroer T.M., Okba N., Fux R., et al. // Science. 2016. V. 351. № 6268. P. 77-81.
51. Lan J., Deng Y., Chen H., Lu G., Wang W., Guo X., Lu Z., Gao G.F., Tan W. // PLoS. One. 2014. V. 9. № 11. P. 1-9.
52. Mou H., Raj V.S., van Kuppeveld F.J.M., Rottier P.J.M., Haagmans B.L., Bosch B.J. // J. Virol. V. 87. № 16. P. 9379-9383.
53. Muthumani K., Falzarano D., Reuschel E.L., Tingey C., Flin-gai S., Villarreal D.O., Wise M., Patel A., Izmirly A., Aljuaid A., et al. // Sci. Transl. Med. 2015. V. 7. № 301. P. 1-29.
54. Yang Y., Deng Y., Wen B., Wang H., Meng X., Lan J., Gao G.F., Tan W. // Viral Immunol. 2014. V. 27. № 10. P. 543-550.
55. Zhao J., Li K., Wohlford-Lenane C., Agnihothram S.S., Fett C., Zhao J., Gale Jr. M.J., Baric R.S., Enjuanes L., Gallagher T., McCray Jr. P.B., Perlmana S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111. № 13. P. 4970-4975.
56. Iwata-Yoshikawa N., Uda A., Suzuki T., Tsunetsugu-Yokota Y., Sato Y., Morikawa S., Tashiro M., Sata T., Hasegawa H., Nagata N. // J. Virol. 2014. V. 88. № 15. P. 8597-8614.
57. Tseng C.T., Sbrana E., Iwata-Yoshikawa N., Newman P.C., Garron T., Atmar R.L., Peters C.J., Couch R.B. // PLoS. One. 2012. V. 7. № 4. P. e35421.
58. Tang J., Zhang N., Tao X., Zhao G., Guo Y., Tseng C.T., Jiang S., Du L., Zhou Y. // Hum. Vaccin. Immunother. 2015. V. 11.
№ 5. P. 1244-1250.
59. Lan J., Yao Y., Deng Y., Chen H., Lu G., Wang W., Bao L., Deng W., Wei Q., Gao G.F., et al. // EBioMedicine. 2015. V. 2. № 10. P. 1438-1446.
