CC BY
19лирующих штаммов с высоким уровнем токсинопродукции. Способность к росту в культуре также является важной характеристикой штаммов.
В результате проведенных исследований был отобран циркулирующий штамм серо-вара 1.0.3., имеющий типичные для циркулирующих штаммов генотипические характеристики, но отличающийся высоким уровнем токсинообразования. Штамм № 162-01 депонирован в коллекции штаммов ГИСК им. Л.А.Тарасевича, получен патент на изобретение № 2407788, 2009 г. «Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis — продуцент коклюшного токсина». Штамм перспективен для включения в состав корпускулярных и бесклеточных коклюшных вакцин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Захарова Н.С., Брицина М.В., Мерцалова Н.У. и др. Отечественная бесклеточная коклюшная вакцина. Журн. микробиол. 2008, 1:35-41.
2. Инструкция по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий. М., 1987.
3. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. Сороковой доклад ВОЗ. Женева, 1992.
4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). М., 2012.
5. Шинкарев А.С., Мерцалова Н.У., Мазурова И.К. и др. Современные штаммы B. рertussis: иммунобиологические свойства и совершенствование вакцин. Журн. микробиол. 2007, 4: 20-25.
6. Mooi F.R. Bordetella pertussis and vaccination: the persistence of a genetically monomorphic pathogen. Infect. Genet. Evol. 2010, 10 (1): 36-49.
7. Mooi F.R., van Loo I.H., van Gent M. et al. Bordetella pertussis strains with increased toxin production assotiated with pertussis resurgence. Emerg. Infect. Dis. 2009, 15 (8): 1206 — 1213.
Поступила 17.10.13
Контактная информация: Зайцев Евгений Михайлович, д.м.н., 105064, Москва, М. Казенный пер, 5а, р.т. (495)916-22-63
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Н.И.Микшис, П.Ю.Попова, О.М.Кудрявцева, А.П.Семакова, Л.В.Новикова, А.Л.Кравцов, С.А.Бугоркова, Т.Н.Щуковская, Ю.А.Попов, В.В.Кутырев
ИММУНОГЕННОСТЬ И БЕЗОПАСНОСТЬ ПРОТОТИПА ХИМИЧЕСКОЙ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ВАКЦИНЫ НА МОДЕЛИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Цель. Оценить иммуностимулирующее и токсическое действие белковых компонентов прототипа вакцины. Материалы и методы. Линейных мышей, морских свинок и кроликов иммунизировали подкожно однократно или двукратно рекомбинантным протективным антигеном (рПА), белком S-слоя (ЕА1) или их комплексом. Активацию структур врожденного иммунитета регистрировали по изменению экспрессии Toll-подобных рецепторов (TLR). Показатели адаптивного иммунитета определяли установленными способами. Токсичность препаратов выявляли с использованием проточной цитофлуориметрии и денситоморфометрии. Результаты. Установлена способность рПА и ЕА1 активировать структуры врожденного иммунитета линейных мышей — TLR 2 и 6 типа. Определены особенности динамики титров анти-ПА антител для каждого вида животных, осуществлено сравнение с антителообразованием при иммунизации Bacillus anthracis СТИ-1. Показано, что двукратная иммунизация биомоделей комплексным препаратом в сочетании с адъювантом обеспечивает защиту от заражения тест-штаммом, сопоставимую с протективностью живой вакцины. В ходе исследования не было выявлено свидетельств повреждающего действия рПА и ЕА1 на клетки и ткани макроорганизма. Заключение. На основании результатов комплексного тестирования прототип разрабатываемой химической сибиреязвенной вакцины обладает высокой иммуногенно-стью, а его белковые компоненты не токсичны для лабораторных животных.
Журн. микробиол., 2014, № 4, С. 22—30
Ключевые слова: Bacillus anthracis, сибирская язва, рекомбинантный протективный антиген, белок S-слоя ЕА1, вакцины
N.I.Mikshis, P.Yu.Popova, O.M.Kudryavtseva, A.P.Semakova, L.V.Novikova, A.L.Kravtsov, S.A.Bugorkova, T.N.Schukovskaya, Yu.A.Popov, V.V.Kutyrev
IMMUNOGENICITY AND SAFETY OF A PROTOTYPE CHEMICAL ANTHRAX VACCINE IN LABORATORY ANIMAL MODELS
Russian Research Institute of Plague Control «Microb», Saratov, Russia
Aim. Evaluation of immune stimulating and toxic effects of a vaccine prototype protein components. Materials and methods. Linear mice, guinea pigs and rabbits were immunized subcutaneously once or twice by recombinant protective antigen (rPA), S-layer protein (EA1) or their complex. Innate immunity structure activation was registered by changes in Toll-like receptor (TLR) expression. Adaptive immune response parameters were determined by established methods. Toxicity of the preparations was determined using flow cytofluorometry and densitomorphometry. Results. The ability of rPA and EA1 to activate structures of innate immunity — TLR 2 and 6 — was established. Features of anti-PA antibody titer dynamics for each of the animal species was determined, a comparison with antibody formation during immunization with Bacillus anthracis STI-1 was carried out. 2 immunizations of biomodels with a complex preparation combined with an adjuvant provides protection from infection by a test-strain that is comparable with protectivity of a live vaccine. Evidences regarding damaging effect of rPA and EA1 on cells and tissues of macro organism were not detected throughout the study. Conclusion. A prototype of a chemical anthrax vaccine under development has high immunogenicity and its protein components are not toxic for laboratory animals based on the results of complex testing.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 4, P. 22—30
Key words: Bacillus anthracis, anthrax, recombinant protective antigen, S-layer protein EA1, vaccines ВВЕДЕНИЕ
Bacillus anthracis — грамположительный спорообразующий микроорганизм, являющийся этиологическим агентом сибирской язвы. Высокая патогенность сибиреязвенного микроба сочетается с уникальной устойчивостью споровых форм к воздействию внешних факторов. В почве споры возбудителя сибирской язвы десятилетиями сохраняют жизнеспособность, являясь потенциальным источником инфекции для восприимчивых животных. Заражение человека происходит обычно при контакте с заболевшими животными или инфицированными продуктами и сырьем животного происхождения [7]. Не исключена вероятность использования патогенного микроорганизма в террористических целях [9].
В системе мероприятий по профилактике сибирской язвы важное место отводится вакцинации контингентов населения, относящихся к группам риска заражения. В Российской Федерации для этой цели используют живую вакцину на основе штамма B. anthracis СТИ-1. Выраженное защитное действие живой вакцины сопряжено с относительно высокой частотой развития побочных эффектов [3]. В значительной мере решить проблему остаточной вирулентности и реактогенности позволяют химические вакцины на основе протективного антигена (ПА). На сегодняшний день в мире лицензированы две химические сибиреязвенные вакцины — AVA (anthrax vaccine adsorbed), синоним BioThrax (производится в США) и AVP (anthrax vaccine precipitated), производится в Великобритании [11]. Отечественными учеными разрабатывалась химическая вакцина [1], а затем комбинированная, состоящая из ПА и спор вакцинного штамма [6, 8]. Все перечисленные препараты относятся ко второму поколению сибиреязвенных вакцин, технология их производства включает сорбцию на гидроокиси или фосфате алюминия культурального фильтрата аттенуированного штамма B. anthracis. Сибиреязвенные вакцинные штаммы продуцируют в среду выращивания экзотоксин, в состав которого, помимо ПА, входят факторы патогенности возбудителя сибирской язвы — отечный и летальный факторы. Кроме того, содержание ПА в подобных антигенных препаратах не подлежит стандартизации [10]. За исключением комбинированной вакцины, препараты вводятся многократно. Максимальна кратность у AVA — первичный комплекс из 3 инъекций, 3 бустерные иммунизации и ежегодная ревакцинация. После событий 2001 г. существенно активизировались усилия, направленные на повышение эффективности и уменьшения кратности
введения AVA. В интенсивном режиме проводились масштабные испытания препаратов. В настоящее время на стадии клинических испытаний находится препарат AV-7909, представляющий собой AVA с адъювантом CpG-7909, активирующим структуры врожденного иммунитета [17].
Альтернативный путь — использование продуктов геномных технологий. Это качественный переход к новому поколению сибиреязвенных вакцин, отвечающих современным требованиям. За рубежом разработка рекомбинантных вакцин активно ведется с 80-х годов прошлого века. В 2012 г. в США на разных фазах клинических испытаний находились 3 вакцинных препарата на основе рекомбинатного ПА (рПА) [15]. Ранее нами был сконструирован генно-инженерный аспорогенный штамм B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-). На условиях его использования разработан биологически безопасный и эффективный способ масштабируемого получения рПА. В оптимизированных условиях культивирования созданный продуцент синтезирует в 20 раз больше ПА, чем вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1. Эксперименты на различных биомоделях показали высокую протектив-ную активность очищенного рПА. Отмечено увеличение индекса иммунитета при добавлении в иммунизирующий препарат белка S-слоя — ЕА1 [5,16]. На этом основании для дальнейшей разработки нами предложен прототип сибиреязвенной химической вакцины, включающий в качестве иммуногенных компонентов рПА и ЕА1.
Цель настоящего исследования — оценить способность прототипа химической сибиреязвенной вакцины стимулировать развитие врожденного и адаптивного иммунитета, получить экспериментальные подтверждения отсутствия выраженного повреждающего действия его белковых компонентов на макроорганизм. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали штаммы: вакцинный B. anthracis СТИ-1 и тест-заражающий B. anthracis 71/12 (2 вакцина Ценковского) (Государственная коллекция патогенных бактерий, Саратов).
Эксперименты проводили на мышах линии BALB/с массой от 18 до 20 г, кроликах массой от 2,5 до 3 кг (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов), морских свинках массой от 250 до 300 г (Столбовая, Московская обл.). Биомоделей содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды.
ПА выделяли из рекомбинантного штамма B. anthracis 55ДTПА-1Spo- (патент РФ № 2321629), очистку проводили на хроматографической системе BioLogic Duo Flou™ (BioRad, США) с использованием MacroPrep 50Q и Sephacryl-HR300 (Bio-Rad, США) [16]. Белок ЕА1 экстрагировали из клеточных стенок штамма B. anthracis СТИ-1, очищали двухэтап-ной ионно-обменной хроматографией на колонке с гидроксиапатитом (Bio-Rad, США)
[4].
Иммунизацию лабораторных животных антигенными препаратами осуществляли подкожно, однократно или двукратно с интервалом в 2 недели. Разовая доза рПА для мышей составляла 10 мкг, морских свинок — 25 мкг, кроликов — 50 мкг. В комплексном препарате белок ЕА1 использовали в количестве 1/2 дозы ПА. В ряде случаев непосредственно перед иммунизацией добавляли полный адъювант Фрейнда в соотношении 1:2. Антигенные препараты вводили мышам в объеме 0,2 мл, морским свинкам и кроликам — 0,5 мл. Животных групп сравнения иммунизировали подкожно однократно или двукратно споровой взвесью вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 в дозах 2х106 спор в 0,2 мл для мышей и 5х107 спор в 0,5 мл для морских свинок.
Выделение РНК из лимфоцитов селезенки и тимуса иммунизированных и интактных мышей (по 6 особей в группе) и реакцию обратной транскрипции проводили с помощью комплектов реагентов «РИБО-сорб» и «Реверта» (ИнтерЛабСервис, Россия) согласно инструкциям фирмы-производителя. Постановку ПЦР осуществляли с использованием праймеров к фрагментам генов, кодирующих ß-актин (положительный контроль) и TLR 2 и 6 типов [14]. Олигонуклеотидные праймеры синтезировали в РосНИПЧИ «Микроб» на автоматическом синтезаторе ДНК «АСМ-800» (Биосет, Россия). Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов осуществляли в горизонтальной камере (Bio-Rad, США) в 2% агарозном геле, используя маркеры молекулярных масс (Fermentas, Литва).
Титры анти-ПА и анти-ЕА1 антител в сыворотках иммунизированных животных определяли с помощью ТИФА. Забор крови проводили с интервалом от 7 до 15 дней из
ушной вены иммунизированных кроликов или морских свинок (по 3 особи в группе) и хвостовой вены мышей (по 5 особей в группе). При постановке ТИФА в качестве антигенов использовали очищенные белки рПА и ЕА1. Меченные пероксидазой видоспеци-фичные антитела (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, Москва) добавляли в рабочем разведении 1:1000. Результаты регистрировали с помощью Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США) при 405 нм.
Протективные свойства изучали по стандартной схеме. Мышей и морских свинок (по 20 особей в группе) иммунизировали подкожно двукратно комплексным антигенным препаратом или однократно штаммом B. anthracis СТИ-1. Животным равнозначных контрольных групп делали инъекции физиологического раствора. Через 21 день от последней инъекции всех иммунизированных и контрольных биомоделей заражали тест-штаммом B. anthracis 71/12. Мышам вводили по 0,2 мл споровой взвеси тест-штамма в дозах от 1х103 до 1х106 спор — для иммунизированных особей и от 1х102 до 1х105 спор — для интактных (по 5 животных каждой группы на дозу). Морским свинкам вводили по 0,5 мл тест-штамма в дозах от 1х104 до 1х107 спор — для иммунизированных особей и от 1х101 до 1х104 спор — для интактных. Наблюдение за зараженными животными осуществляли в течение 10 дней, затем подсчитывали значения ЛД50 тест-штамма и индексы иммунитета, как отношение значений ЛД50 тест-штамма для иммунизированных и интактных животных. Животных выводили из опыта под эфирным наркозом.
Распределение иммунокомпетентных клеток по фазам клеточного цикла устанавливали цитофлуориметрическим методом. Фиксированные в этиловом спирте лимфоциты тимуса и селезенки иммунизированных и интактных мышей (по 6 особей в группе) окрашивали раствором, содержащим бромид этидия и митрамицин. Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия). Активацию иммунокомпе-тентных клеток отражало их количество (%) в стадии пролиферации [13].
Токсичность препаратов определяли после однократного введения рПА (ЕА1) в дозах: линейным мышам — 10 или 50 мкг, морским свинкам — 25, 50 или 100 мкг. Осмотр, взвешивание и термометрирование животных проводили спустя 24 часа, на 3 и 7 сутки. Для определения острой токсичности по морфологическим показателям иммунизированных морских свинок умерщвляли хлороформом через 24 часа, на 3, 7, 21 и 27 сутки (по 3 особи на срок). После вскрытия определи массу и размеры органов животных. Для гистологического исследования забирали ткани печени, сердца, легких, почек, надпочечников, кожи, тимуса, селезенки, регионарных и отдаленных лимфатических узлов. Обработанный по стандартной методике [2] материал просматривали в биологическом микроскопе Olympus CX31 при увеличении в 40 — 200 раз. Морфометрические характеристики оценивали с помощью денситоморфометрической программы аппаратно-программного комплекса МЕКОС-Ц (версия 2.1.0.0).
Для статистической обработки экспериментальных данных вычисляли среднюю арифметическую абсолютных и относительных величин (М), среднюю ошибку средней арифметической (m) и коэффициент достоверности различия средних (t). РЕЗУЛЬТАТЫ
Для выяснения способности рПА и ЕА1 активировать структуры врожденного иммунитета регистрировали их действие на TLR клеток лабораторных животных. Мышей иммунизировали однократно одним из антигенов без адъюванта. Через 4 часа, на 1, 3, 7 и 14 сутки после иммунизации из тимуса и селезенки биомоделей выделяли лимфоциты. Полученный после обратной транскрипции материал использовали для постановки ПЦР с праймерами к последовательностям генов TLR 2 и 6 типов. Практически во всех пробах от иммунизированных животных регистрировали амплифицированные фрагменты установленного размера (рис. 1). В пробах от интактных мышей в ряде случаев также отмечали положительную реакцию взаимодействия со специфичными праймерами, но менее выраженную.
Особенности развития адаптивного иммунитета в ответ на введение в организм белковых компонентов прототипа химической сибиреязвенной вакцины оценивали, в первую очередь, по динамике титров антител в сыворотках иммунизированных биомоделей. Мышей, морских свинок и кроликов иммунизировали двукратно рПА с адъювантом. Животным групп сравнения вводили споровую взвесь вакцинного штамма B. anthracis
СТИ-1: мышам и морским свинкам — однократно, кроликам — двукратно. В целом более интенсивное образование антител отмечали у особей, иммунизированных рПА. В эксперименте на мышах титры анти-ПА антител различались следующим образом: через 28 суток — в 1,9 раза; через 1,5 месяца
— 15,6 раза; 2 месяца — 31,3 раза; 2,5 месяца
— 15,6 раза; 3 месяца — 4 раза; 3,5 месяца
— 8 раз. В эксперименте на морских свинках: через 28 суток — в 4 раза; через 1,5 месяца — 2 раза; 2 месяца — 4 раза; 2,5 месяца
— 31,3 раза; 3 месяца — 5,6 раза. Максимальное количество антител (титр 1/40000) у мышей, иммунизированных рПА, регистрировали через 2 месяца, у морских свинок — 2,5 месяца от первой инъекции (рис. 2). Пик антителообразования у линейных мышей, иммунизированных B. anthracis СТИ-1, отмечали на 28 сутки (титр 1/5120), у морских свинок — через 1,5 месяца (титр 1/2560). В эксперименте на кроликах на 21 и 28 сутки иммуногенеза более выраженное образование анти-ПА антител отмечали у биомоделей, двукратно иммунизированных вакцинным штаммом — титры были выше в 31,3 и 5 раз, соответственно. В дальнейшем, напротив, регистрировали превышение количества анти-ПА антител у кроликов, иммунизированных рПА — в 21,3 раза через 1,5 месяца; в 5,5 раза — 2 месяца и в 2,3 раза — 2,5 месяца после начала опыта. В сыворотках крови мышей и морских свинок, иммунизированных комплексом препаратом (рПА + ЕА1 + адъювант), определяли также антитела к ЕА1, но с меньшими значениями титров, менее четкой и выраженной динамикой.
На следующем этапе сравнивали протективные свойства комплексного препарата и штамма B. anthracis СТИ-1. Значение ЛД50 тест-штамма для линейных мышей, иммунизированных антигенами в сочетании с адъювантом, составило 1,9х105 (39811^1000000) спор; иммунизированных вакцинным штаммом — 3,1х104 (6310^158489) спор; интактных
— 5,0х102 (100^2512) спор. Соответственно на модели мышей индекс иммунитета комплексного препарата был 398,2, а индекс иммунитета штамма B. anthracis СТИ-1 — 63,1. В поствакцинальный период среди морских свинок, иммунизированных вакцинным штаммом, регистрировали 20% летальных случаев. Гибели животных от антигенного препарата не наблюдали. Значение ЛД50 тест-штамма в обоих случаях было 3,1х107 спор при 100% выживаемости животных. Вместе с тем, для интактных биомоделей данный показатель равнялся 3,1х102 (63^1585) спор. Следовательно, на модели морских свинок индек-
Рис. 1. Результаты ПЦР-анализа образца, полученного из лимфоцитов селезенки мышей через 4 часа после иммунизации рПА:
1 — маркеры молекулярных масс; ПЦР с праймерами к фрагментам генов: 2 — TLR
2 типа; 3 — ТЬЯ 6 типа; 4 — Р-актина (контроль).
Рис. 2. Динамика титров анти-ПА антител в сыворотках мышей линии BALB/c (круг) и морских свинок (треугольник), иммунизированных двукратно рПА (линии) или однократно штаммом СТИ-1 (пунктирные) — средние значения данных от 5 и 3 особей, соответственно.
сы иммунитета комплексного препарата и вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 были одинаково высокими — 100072,0.
Для исключения повреждающего действия основных компонентов прототипа химической вакцины на иммунную систему лабораторных животных проводили оценку апоп-тотической и пролиферативной активности лимфоцитов органов центрального и периферического иммуногенеза. Мышей иммунизировали однократно рПА или ЕА1 без адъюванта. Пробы тимуса и селезенки забирали через 4 часа, на 1, 3, 7 и 14 сутки после иммунизации. Во все сроки наблюдения апоптотическая и пролиферативная активность клеток тимуса существенно не отличалась от контрольных показателей. На 7 и 14 сутки регистрировали небольшое повышение пролиферативной активности спленоцитов мышей, иммунизированных рПА. Количество лимфоцитов в состоянии пролифирации увеличивалось до 33,7+1,6 при значении 27,7+1,6% в контрольных пробах. В свою очередь, введение ЕА1 сопровождалось некоторым увеличением числа апоптотических клеток селезенки на 7 сутки после иммунизации — 3,7+0,5 при 27,7+1,6% в контрольных образцах. Тем не менее, к концу срока наблюдения данный показатель возвращался к исходному значению — 2,8+0,3%. В продолжение всего эксперимента индекс соотношения клеток тимуса и селезенки в стадии апоптоза и пролиферации находился в пределах от 0,09 до 0,29.
Анализ токсичности рПА и ЕА1 в условиях in vivo осуществляли на модели мышей и морских свинок. Животным вводили иммунизирующую дозу антигена или дозу, превышающую ее в 2, 4 и 5 раз (без адъюванта). Гибели иммунизированных животных ни от одной из тестированных доз зафиксировано не было. Визуально и пальпаторно изменений в месте введения препаратов не обнаруживали. В течение всего периода наблюдения (7 суток) масса тела животных изменялась только в сторону увеличения ввиду естественного роста. При вскрытии умерщвленных лабораторных животных отсутствовали грубые патологические изменения.
Для патоморфологического исследования морским свинкам вводили комплекс рПА с ЕА1 в дозах, в 2 раза превышающих иммунизирующие (без адъюванта). Тестируемый препарат не приводил к гибели биомоделей и не влиял на их общее состояние. На протяжении периода наблюдения (27 суток) не отмечали снижения массы тела ни у одного из животных. При патологоанатомическом исследовании не было выявлено грубых морфологических изменений, резкого нарушения кровенаполнения сосудов, ярко выраженных проявлений дистрофии и инфильтративных процессов.
В месте введения препарата в первые сутки отмечали незначительный отек подкожной клетчатки и очаговую инъекцию сосудов. При гистологическом исследовании на фоне умеренного отека и очагового полнокровия сосудов подкожной клетчатки выявляли небольшие участки лимфоцитарной инфильтрации дермы. Однако на 3 сутки макроскопических и микроскопических изменений в области инъекции зарегистрировано не было.
Стресс-реакция организма на введение белковых антигенов заключалась, в частности, в некотором снижении массы надпочечников в течение первых 3 суток. При гистологическом исследовании отмечали умеренное расширение пучковой зоны с изменением ядерно-цитоплазматического соотношения у отдельных клеток, очаговое опустошение клеток клубочковой зоны и некоторое снижение феохромии мозгового вещества.
При гистологическом исследовании проб, взятых от иммунизированных животных с 1 по 7 сутки, регистрировали признаки умеренного функционального напряжения клеток паренхимы печени, почек и кардиомиоцитов на фоне очагового полнокровия сосудов. В ранние сроки (до 3 суток) в печени опытных морских свинок отмечали умеренный застой в системе циркуляции и оттока крови, а также функциональное напряжение светлых ге-патоцитов центра печеночных долек. К 7 суткам функциональное состояние органа у иммунизированных и неиммунизированных животных достоверно не отличалось. В течение всего периода наблюдения в пробах от морских свинок, получивших антигенный препарат, количество клеток Купфера было в 2 раза больше контрольных значений. Изменения со стороны гломерулярного аппарата почек характеризовались умеренным полнокровием капиллярных петель сосудистых клубочков почечных телец.
Патоморфологическое исследование не выявило признаков угнетения функции лим-
фоидных органов ни в одном случае. На 21 сутки у иммунизированных морских свинок отмечали увеличение массы тимуса и селезенки в 2 раза по сравнению с массой органов у контрольных животных. При гистологическом исследовании регистрировали умеренную гиперплазию фолликулярных структур. К этому же сроку увеличивалась масса региональных лимфатических узлов. Для отдаленных лимфатических узлов отмечали более чем 30-кратное ее превышение по сравнению с контрольными значениями. Тем не менее, к 27 суткам масса лимфоидных органов возвращалась к исходному уровню. В селезенке и лимфатических узлах регистрировали умеренное нарастание пролиферативной активности и изменение клеточного состава органов в период с 3 по 27 сутки. ОБСУЖДЕНИ Е
В соответствии с современной концепцией проникновение патогенов в организм контролируется взаимодополняющими звеньями иммунной системы — врожденной и приобретенной. Рецепторы неспецифического иммунитета, включая TLR, распознают консервативные патоген-ассоциированные молекулярные структуры микроорганизма; запускают каскад провоспалительных реакций, направленных на его деструкцию и элиминацию; индуцируют и регулируют развитие адаптивного иммунного ответа [18]. В этой связи, на первом этапе исследования выясняли способность белковых компонентов прототипа химической вакцины активировать рецепторы врожденного иммунитета. Отмечено, что уже через 4 часа после введения мышам рПА или ЕА1 происходит увеличение экспрессии генов TLR 2 и 6 типов. Зафиксированное нами количественное различие ампли-фицированного продукта в пробах от иммунизированных и интактных мышей подтверждает достоверность сделанного вывода. В то же время, данный факт укладывается в представление о том, что эукариотические клетки конститутивно экспрессируют рецепторы врожденного иммунитета на относительно невысоком уровне [12].
Классической составляющей иммунологической оценки прототипов сибиреязвенных вакцин является определение динамики титров антител к ПА в сыворотках иммунизированных экспериментальных животных. В целом при введении рПА биомоделям отмечали более выраженный процесс антителообразования, чем при использовании вакцинного штамма, с достижением максимума анти-ПА антител 1/40000 для мышей и морских свинок, 1/128000 для кроликов. Превышение достигало 30-кратных значений для мышей и морских свинок, 20-кратных для кроликов. Отчасти, это ожидаемая реакция макроорганизма в ответ на введение очищенных иммунногенных антигенов. Однако прослеживающаяся во всех опытах выраженность антителогенеза свидетельствует в пользу способности рПА стимулировать у лабораторных животных адекватный иммунный ответ. Существенно, что спустя 3,5 месяца после начала эксперимента титры антител к ПА в сыворотках иммунизированных рПА мышей и морских свинок оставались на довольно высоком уровне — соответственно 1/5120 и 1/8000. Вместе с тем, для этих же групп животных прослеживалась тенденция к сдвигу сроков достижения максимального уровня антител примерно на месяц. По всей вероятности, это связано с особенностями опыта: дробное с интервалом в 2 недели введение рПА и одномоментное — живой вакцины. Двукратная иммунизация кроликов вакцинным штаммом приводила к резкому «всплеску» образования антител, но в дальнейшем ситуация диаметрально менялась, и через 1,5 — 2,5 месяца отмечали превышение показателей у биомоделей, иммунизированных рПА. Обнаружение в сыворотках крови лабораторных животных, получивших комплексный препарат, значительного количества антител к ЕА1 косвенно подтверждает наличие у белка S-слоя иммуномодули-рующего действия.
Проведенное исследование позволило установить, что двукратная иммунизация животных комплексным препаратом (рПА + ЕА1 + адъювант) в соответствующих дозах обеспечивает эффективную защиту от заражения тест-штаммом B. anthracis 71/12. Значения ЛД5о тест-заражающего штамма для иммунизированных и интактных морских свинок различались на пять порядков, для иммунизированных и интактных линейных мышей — на два порядка. Индексы иммунитета антигенного препарата и штамма B. anthracis СТИ-1 для конкретного вида лабораторных животных были сопоставимы или равны. В целом полученные результаты свидетельствуют о способности комплексного препарата вызывать формирование адаптивного иммунитета и обеспечивать защиту биомоделей, сопоставимую по уровню с протективностью вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1.
Антигенный препарат не приводил к гибели морских свинок в поствакцинальный период, чем выгодно отличался от вакцинного штамма. На основании результатов цитоф-луориметрического исследования было установлено, что рПА и белок ЕА1 не индуцируют гибель тимоцитов и спленоцитов по типу апоптоза. Зарегистрированное на 7 и 14 сутки небольшое повышение пролиферативной активности спленоцитов биомоделей, иммунизированных рПА, может быть обусловлено пролиферацией В-клеток и антителопродук-цией. Тот факт, что соотношение лимфоцитов тимуса и селезенки в стадии апоптоза и пролиферации во всех пробах было меньше единицы, свидетельствует об отсутствии повреждающего действия исследуемых антигенов на иммунокомпетентные клетки. Токсичность рПА и ЕА1 in vivo определяли с использованием доз, превышающих иммунизирующие в 2, 4 или 5 раз. Тем не менее, ни в одном случае не отмечали изменения общего состояния экспериментальных животных и их гибели. Выявленные при патомор-фологическом и гистологическом исследовании небольшие изменения в органах морских свинок, иммунизированных комплексом рПА и ЕА1, укладывались в картину стресс-реакции макроорганизма на вводимый препарат и были обратимы. Двукратное превышение количества клеток Купфера в тканях печени подтверждало функциональную активацию ретикулоэндотелиальной системы. Реакция иммунокомпетентных органов являлась отражением процессов иммуногенеза. Интересно, что при гистологическом исследовании органов морских свинок, получивших рПА с ЕА1 в дозах, в 2 раза превышающих иммунизирующие, не было выявлено признаков аллергизации организма.
Таким образом, осуществлен комплекс экспериментов с использованием трех видов лабораторных животных, позволяющий оценить иммуногенность и безопасность белковых компонентов прототипа химической сибиреязвенной вакцины. На основании полученных результатов установлено, что рПА и ЕА1 индуцируют развитие врожденного иммунитета. Создаваемый ими адаптивный иммунитет характеризуется высокими значениями титров специфических антител и индексов иммунитета. Комплексный препарат по протективным свойствам не уступает вакцинному штамму. В ходе проведенного исследования не было выявлено повреждающего действия рПА и ЕА1 на клетки и ткани макроорганизма. Все вышеизложенное позволяет сделать вывод о перспективности разработки данного препарата в качестве средства специфической профилактики сибирской язвы.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации». Государственный контракт № 40-Д/1 от 29.07.2012.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дербин М.И., Гарин H.C., Тарумов B.C., Михайлов В.В., Садовой Н.В., Кузьмич М.К., Федорова Н.В., Шенцев И.В., Мунтянов П.В., Кравец И.Д., Фофанов П.Е., Илюхин В.П., Шумилов Г.П. Получение и изучение сибиреязвенного протективного антигена. Безвредность, реактогенность и эффективность концентрированной очищенной сорбированной химической сибиреязвенной вакцины. Журн. микробиол. 1977, 8: 115-120.
2. Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. М., СпецЛит., 2010.
3. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Кравченко ТЕ., Дятлов И.А., Тюрин Е.А., Степанов А.В. Никифоров В.В. Сибирская язва человека: эпидемиология, профилактика, диагностика, лечение. М., Гигиена, 2008.
4. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф., Попов Ю.А., Коннов Н.П., Киреев М.Н., Дроздов И.Г. Продукция белков S-слоя штаммами Bacillus anthracis. Биотехнология. 2004, 5: 2232.
5. Микшис Н.И., Попова П.Ю., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Попов Ю.А., Кутырев В.В. Иммуногенность протективного антигена, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis. Журн. микробиол. 2011, 1: 44-48.
6. Садовой Н.В., Кравец И.Д., Селиваненко Г.М., Харечко Г.С.. Садовая Е.А., Васильев П.Г., Литусов Н.В., Елагин Г.Д., Супотницкий М.В. Вакцина сибиреязвенная комбинированная. Патент РФ № 2115433 (A61K39/07, A61K39/40). М., Государственный реестр изобретений РФ, 1998.
7. Черкасский Е.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М., Интерсэн, 2002.
8. Шевцов А.Н., Дармов И.В., Зайцева Г.А., Боровский Д.В., Меновщиков В.А., Кунов В.К. Исследование иммунитета и аллергии после вакцинации сухой комбинированной сибиреязвенной вакциной. Журн. микробиол. 2007, 5: 51-53.
9. Brachman P. Bioterrorism: an update with a focus on anthrax. Am. J. Epidemiol. 2002, 155: 981-987.
10. Chitlaru T, Altboum Z., Reuveny S., Shafferman A. Progress and novel strategies in vaccine development and treatment of anthrax. Immunol. Rev. 2011, 239: 221-236.
11. Friedlander A., Little S. Advances in the development of next-generation anthrax vaccines. Vaccine. 2009, 27: 28-32.
12. Janssens S., Beyaert R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clin. Microbiol. Rev. 2003, 16: 637-646.
13. Kravtsov A.L., Grebenyukova T.P., Bobyleva E.V., Golovko E.M., Malyukova T.A., Lyapin M.N., Kostyukova TA., Yezhov I.N., Kuznetsov O.S. Flow cytofluorometric assay of human whole blood leukocyte DNA degradation in response to Yersinia pestis and Staphylococcus aureus. Proc. SPIE. 2001, 4241: 260-267.
14. Liu T., Matsuguchi T., Tsuboi N.et al. Differences in expression oftoll-like receptors and their reactivities in dendritic cells in BALB/c and C57BL/6 mice. Infect. Immun. 2002, 70 (12): 6638-6645.
15. Medicines in Development Vaccines. Report. 2012. Avaible at: http://www.phrma.org/sites/default/files/ pdf/vaccines2012.pdf.
16. Mikshis N.I., Kudryavtseva O.M., Shulepov D.V., Goncharova A.Yu., Bolotnikova M.F., Novikova L.V., Popov Yu.A., Kutyrev V.V. Asporogenic recombinant producer of Anthrax protective antigen. Appl. Biochem. Microbiol. 2011, 47 (7): 667-673.
17. Rynkiewicz D., Rathkopf M., Sim I. et al. Marked enhancement of the immune response to BioThrax® (Anthrax Vaccine Adsorbed) by the TLR9 agonist CPG 7909 in healthy volunteers. Vaccine. 2011, 29 (37): 6313-6320.
18. Valiante N., O'Hagan D., Ulmer J. Innate immunity and biodefence vaccines. Cell. Microbiol. 2003, 5 (11): 755-760.
Поступила 17.10.13
Контактная информация: Микшис Наталья Ивановна, д.м.н.,
410005, Саратов, ул. Университетская, 46, р.т. (845-2) 26-21-31
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
B.М.Мицура1, Е.В.Воропаев1, О.В.Осипкина1,
C.В.Жаворонок2, Д.В.Терешков3, О.Ю.Баранов1
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-28В И РНКазы L У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С
Гомельский государственный медицинский университет; 2Белорусский государственный медицинский университет, Минск; 3Гомельская областная инфекционная клиническая больница, Беларусь
Цель. Определение частоты встречаемости и клинического значения полиморфизмов генов интерлейкина-28В (1Ь28В) и РНКазы Ь у пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС). Материалы и методы. Обследованы 104 стационарных пациента с ХГС (65% мужчины; 63% с генотипом 1 вируса гепатита С — ВГС). 70 пациентов получали лечение препаратами интерферона (№N1 и рибавири-на (ЯВУ). Методом полимеразной цепной реакции определяли единичные нуклеотидные полиморфизмы ^Р) гена 1Ь28В 39743165Т^ (ге8099917), 39738787С>Т (к12979860) и гена РНКазы Ь (1385G>A). Результаты. Частота встречаемости «благоприятных» аллельных вариантов 8МР гена 1Ь28В у пациентов с ХГС была ниже, чем в популяции европейского региона. У пациентов с генотипом 1 ВГС чаще встречаются мутантные аллели в 8МР 39743165T>G (р=0,045) и 39738787С>Т (р=0,005), чем у больных с иными генотипами вируса. Выявлены более высокие значения аланина-минотрансферазы у пациентов с генотипом СС 39738787С>Т Частоты вариантов 8МР генов 1Ь28В и РНКазы Ь не различались в зависимости от скорости прогрессирования заболевания (р>0,5). Ответ на терапию ШМ/ЯВУ был выше при «благоприятных» вариантах ТТ (8МР 39743165Т^) и СС 39738787С>Т). Заключение. Обследование на 8МР 39738787С>Т гена 1Ь28В рекомендуется перед
