CC BY
55
С.М. Усов // Известия Академии аграрных наук Республики Беларусь. - 1998. - № 3. -С.74-77.
6. Изучение безвредности противовирусного препарата «М1» для цыплят-бройлеров / В.А. Прокулевич [и др.] // Экология и животный мир. - 2007. -№» 1. - С. 42.-46.
7. Состояние клеточного и гуморального иммунитета у телят при иммунизации против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и парагриппа-3 / П.А. Красочко, Н.А. Ковалев, И.А. Красочко, Е.Г. Колоницкая, И.П. Иванова // Ветеринарная наука -производству: науч. тр. БелНИИЭВ. - Минск: Хата, 2000. - Т. 34. - С. 51-57.
8. Толяронок, Г.Е. Научное обоснование применения антибиотиков при лечении и профилактике бактериальных инфекций телят и поросят / Г.Е. Толяронок // Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных: матер. Междунар. науч.-практ. конф. - Минск, 2003. - С. 282-284.
9. Шаденко, И.В. Лечение бактериальных осложнений при вирусных пневмоэн-теритах у телят / И. В. Шаденко // Ученые записки УО «ВГАВМ». - Витебск, 2004. -Т. 40. - Ч. 1. - С. 324-325.
УДК 619:615.371:616-097:618.1:616.36:636.028
ИММУНОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ КОРОВ И ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ТЕЛЯТ
П.А. КРАСОЧКО, И.А. КРАСОЧКО, О.П. ИВАШКЕВИЧ, Д.С. БОРИСОВЕЦ, Ю.В. ЛОМАКО РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского НАН Беларуси» г. Минск, Республика Беларусь, 220003 О.В. ВЫСОКОМОРНАЯ УО «Гродненский государственный аграрный университет» г. Гродно, Республика Беларусь, 230008
(Поступила в редакцию 12.01.2013)
Введение. В современных условиях ведения животноводства особую актуальность приобретают мероприятия, направленные на повышение продуктивности животных и качества сельскохозяйственной продукции. Важной проблемой в развитии животноводства все еще остаются широко распространенные гинекологические заболевания коров, сопровождающиеся абортами, родовыми и послеродовыми осложнениями (задержание последа, эндометриты), многократными непродуктивными осеменениями [3, 5].
Главным этиологическим фактором в возникновении и развитии эндометритов у коров являются вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи (ВД) крупного рогатого скота, которые также у новорожденных телят вызывают тяжело протекающие энтериты. У животных из стад с высокой степенью инфицированности вышеуказанными возбудителями значительно снижается оплодотворяемость, часто отмечаются аборты на различных стадиях беременности, а у отелившихся коров - эндометриты, вагиниты, маститы. Телята от таких коров практически все переболевают пневмоэнтеритами с высокой степенью летального исхода [2, 8-10].
322
Ассоциативные вирусные инфекции у крупного рогатого скота, вызываемые возбудителями инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи, постоянно регистрируются в различных странах Г11. По данным В.Н. Сюрина с соавт., ассоциации вышеуказанных вирусов выделены при респираторных заболеваниях от 11 до 34 %, при гастроэнтеритах - от 4 до 12 %, при бесплодии - от 5 до 23 % животных Г41. При ассоциативной инфекции организм животного подвергается не только суммарному патогенному воздействию возбудителей, но и под их влиянием происходит резкое снижение защитных функций организма. Кроме того, существенным фактором в возникновении и развитии эндометритов считают условно-патогенную и патогенную микрофлору, которая попадает в половые пути самок гематогенным и лимфогенным путями, а также из внешней среды до отела, во время отела и сразу же после его завершения [1, 6, 7].
Специфическая профилактика смешанных инфекций, среди которых ведущую роль играют инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея, осуществляется путем применения ассоциированных вакцин, гипериммунных сывороток или глобулинов. В мировой науке и практике накоплен значительный опыт борьбы с респираторными, желудочно-кишечными заболеваниями молодняка крупного рогатого скота и эндометритами у коров, проводятся глубокие исследования по разработке моно- и ассоциированных вакцин, химиотерапевтических и иммуностимулирующих препаратов [1, 6].
Моновакцины против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи крупного рогатого скота высокоэффективны, однако их применение не всегда обеспечивает желаемый эффект, так как противовирусные антитела вырабатываются только против одного возбудителя, а патологический процесс, как правило, вызывается их ассоциациями [6].
В связи с тем что среди животных в хозяйствах Республики Беларусь широко циркулируют возбудители инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи в ассоциации с представителями условно -патогенной и патогенной микрофлоры, заслуживает внимания разработка и использование для их специфической профилактики многокомпонентных вакцин, содержащих антигены наиболее распространенных возбудителей. Такие вакцины должны защищать крупный рогатый скот в случае возникновения инфекций и заметно уменьшать последующее распространение полевых штаммов вирусов и бактерий, а также не вызывать болезнь, аборты или любую местную или системную реакцию и обладать высокой генетической устойчивостью.
Это позволит значительно повысить эффективность комплекса ве-теринарно-санитарных мероприятий при вирусно-бактериальных пневмоэнтеритах, мастите и эндометритах крупного рогатого скота.
В связи с этим возникает необходимость разработки инактивиро-ванной вирусно-бактериальной вакцины для иммунизации стельных коров и телят в племенных хозяйствах.
Цель работы - изучить иммуногенность разработанной поливалентной инактивированной вирусно-бактериальной вакцины для про-
323
филактики заболеваний репродуктивных органов коров и желудочно-кишечного тракта телят.
Материал и методика иследований. Исследования проводились в условиях отдела вирусных инфекций РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского».
При конструировании поливалентной инактивированной вакцины использованы: вирус диареи с инфекционным титром 6,5 lg ТЦД50/мл, вирус инфекционного ринотрахеита с инфекционным титром 6,5 lg ТЦД50/мл, парвовирус крупного рогатого скота с титром гемагглютинирующей активности - 1:1024, Proteus mirabilis в концентрации 5 млрд. микробных тел в 1 мл, штаммы E. coli, содержащие адге-зины К88, А20, К99, в концентрации 5 млрд. микробных тел в 1 мл.
С целью изготовления инактивированных компонентов вирусов инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, парвовируса, протея и эшерихий для конструирования поливалентной вакцины были использованы следующие аттенуированные штаммы вирусов и бактерий: инфекционного ринотрахеита - КМИЭВ-6; вирусной диареи - кМиЭВ-7, парвовируса - КМИЭВ-48, E.coli с адгезивными антигенами - А20 (КМИЭВ-39А), К99 (КМИЭВ-38), К88 (КМИЭВ-41А), Proteus mirabilis - КМИЭВ-44.
Накопление вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи проводилось на культуре клеток MDBK. В качестве ростовой среды для культур клеток использована среда Игла (MEM) с 10 % нормальной сыворотки крупного рогатого скота, а в качестве поддерживающей - среда Игла (МБМ) с 2 % нормальной сыворотки крупного рогатого скота.
Накопление парвовируса проводилось на культуре клеток РК-15 (на растущие клетки с 50-60 % заполнения монослоя). В качестве ростовой среды для культур клеток использована среда Игла (DMEM) и среда 199 в соотношении 1:1 с 10 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, а в качестве поддерживающей - среда Игла (DMEM) и среда 199 в соотношении 1:1 с 5 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота.
Перед накоплением компонентов эшерихий и протея на первом этапе изучали биологические свойства бактерий и установили, что данные микроорганизмы соответствуют по своим биологическим свойствам референтным штаммам, причем все культуры оказались патогенными для белых мышей.
E.coli и Proteus mirabilis культивировали 24 ч на агаровой питательной среде, смывали стерильным 0,85%-ным раствором хлорида натрия и доводили концентрацию бактерий до 5 млрд. микробных клеток в 1 мл.
В качестве инактиванта использован теотропин в 0,2%-ной концентрации, в качестве адъюванта был использован Montanide ISA-15, который добавляли до 15 % по объему.
Для конструирования экспериментального образца вакцины брали вирусные компоненты (1:1) и бактериальные (1:1:1:1) в соотношении 3:1 соответственно.
Определение показателей качества полученного биопрепарата проводили в соответствии с постановлением Министерства сельского хозяйства Республики Беларусь № 44 от 31.06.2007 «О порядке регистрации ветеринарных препаратов на территории Республики Беларусь».
Стерильность вакцины устанавливали путем посева разработанного биопрепарата на элективные среды (мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), среду Сабуро и Китта-Тароцци) в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности».
Полноту инактивации вирусных компонентов определяли путем проведения двух последовательных пассажей в культуре клеток MDBK и РК-15, бактериальных - путем двух последовательных пересевов на среде Хоттингера.
Все образцы вакцины были проверены на безвредность и реакто-генность в опытах на белых мышах (n=10) массой 18-20 г путем подкожного введения вакцины в объеме 0,3 см3. В качестве контроля было использовано 10 мышей, которым вводили стерильный физиологический раствор в той же дозе.
Контроль иммуногенной активности поливалентной инактивиро-ванной вирусно-бактериальной вакцины для профилактики заболеваний репродуктивных органов коров и желудочно-кишечного тракта телят проводили на морских свинках массой 300-400 г и кроликах массой 2,5-3,0 кг. Морские свинки были разделены на две группы (одна опытная (ОГ) и одна контрольная группа (КГ)) по 10 гол. в каждой. Было сформировано две группы кроликов (опытная и контрольная) по 4 гол. Морские свинки были иммунизированы сконструированным образцом поливалентной инактивированной вакцины в дозе 1 мл двукратно с интервалом 14 дней, а кролики - в дозе 2,0 мл двукратно с интервалом 14 дней. Контрольным животным вводился изотонический раствор хлорида натрия в тех же дозах. Перед вакцинацией и через 21 день после второй иммунизации у лабораторных животных были отобраны сыворотки крови для проверки наличия противовирусных антител в РНГА (инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея) и РЗГА (парвовирусная инфекция), антибактериальных - в РА к E. coli (К99, A20, F41) и Proteus mirabilis.
Все полученные результаты проведенных исследований статистически обработаны с помощью компьютерных программ Biostat, Excel и StatBiom 2720.
Результаты исследований и их обсуждение. В результате проведенных исследований по определению показателей качества полученного биопрепарата установили, что сконструированная поливалентная вакцина является стерильным, безвредным и ареактогенным препаратом. В течение 10 дней посевы были стерильными, что указывает на стерильность биологического препарата. Были проведены наблюдения за животными в течение 10 дней. Все мыши были живы, признаков
угнетения не отмечено, на месте введения препарата припухлостей и некрозов не выявлено. После внесения вакцины на монослой культуры клеток МЭБК характерного для вирусов цитопатического действия (ЦПД) в течение 96 ч не выявлено.
В табл. 1 и 2 приведены данные по определению иммуногенной активности поливалентной инактивированной вирусно-бактериальной вакцины для профилактики заболеваний репродуктивных органов коров и желудочно-кишечного тракта телят.
Таблица 1. Титры противовирусных антител при определении иммуногенной активности поливалентной инактивированной вирусно-бактериальной вакцины для профилактики заболеваний репродуктивных органов коров и желудочно-кишечного тракта телят
Вид животных Группы животных Титр антител в РНГА к вирусу инфекционного ринотрахеита (^2) Титр антител в РНГА к вирусу диареи (^2) Титр антител в РЗГА к парвовирусу (^2)
до иммунизации через 21 день после второго введения вакцины до иммунизации через 21 день после второго введения вакцины до иммунизации через 21 день после второго введения вакцины
Кролики ОГ 4,75±0,25 6,25±0,25** 4,0±0,0 5,25±0,25* 4,25±0,25 7,75±0,25***
Кролики КГ 4,25±0,25 4,5±0,29 4,25±0,25 4,25±0,25 4,5±0,29 4,75±0,25
Морские свинки ОГ 2,2±0,13 4,6±0,22*** 2,5±0,22 5,7±0,21*** 3,8±0,2 6,7±0,26***
Морские свинки КГ 2,0±0,0 2,2±0,13 1,9±0,18 2,0±0,15 3,9±0,18 4,2±0,13
*Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001.
Анализируя влияние поливалентной инактивированной вакцины на гуморальный иммунитет иммунизированных кроликов, необходимо отметить, что на 21 -й день после повторной иммунизации происходит достоверное (Р<0,01) по отношению к контролю увеличение титра противовирусных антител к вирусу инфекционного ринотрахеита до 6,25 log2, что на 1,5 выше в сравнении с первоначальным уровнем. В опытной группе морских свинок произошло достоверное (Р<0,001) увеличение данного показателя в 2,1 раза.
На 21-й день после первичной вакцинации разработанным биопрепаратом наблюдается значимое (Р<0,05) повышение уровня противовирусных антител к вирусу диареи у кроликов на 1,25 в сравнении с первоначальным уровнем. Подобная тенденция наблюдается и после иммунизации поливалентной вакциной морских свинок, в крови которых происходит увеличение титров антител к вирусу диареи в 2,3 раза (Р<0,001).
В отношении противовирусных антител к парвовирусу крупного рогатого скота в опытных группах лабораторных животных после иммунизации разработанным биопрепаратом также выявлена положительная динамика антителообразования, которая характеризуется до-
326
стоверным (Р<0,001) увеличением уровня антител в крови кроликов на 3,5 в организме морских свинок - на 2,9
В то же время в группах контроля лабораторных животных, которым вводился изотонический раствор хлорида натрия, значимых изменений уровня специфических антител не происходило.
Таблица 2. Титры антибактериальных антител при определении иммуногенной активности поливалентной инактивированной вирусно-бактериальной вакцины для профилактики заболеваний репродуктивных органов коров и желудочно-кишечного тракта телят
Вид животных Группы животных Титр антител в РА к Proteus mirabilis (log2) Титр антител в РА к E.coli A20 (log2) Титр антител в РА к E.coli F41 (log2)
до иммунизации через 21 день после второго введения вакцины до иммунизации через 21 день после второго введения вакцины до иммунизации через 21 день после второго введения вакцины
Кролики ОГ 5,75±0,25 9,0±0,41*** 5,75±0,25 8,25±0,25*** 5,5±0,29 8,5±0,29***
Кролики КГ 5,5±0,29 5,75±0,25 5,5±0,29 5,75±0,25 5,25±0,25 5,5±0,29
Морские свинки ОГ 4,2±0,13 6,6±0,27*** 4,9±0,18 7,7±0,15*** 4,6±0,16 7,5±0,17***
Морские свинки КГ 4,0±0,15 4,0±0,0 4,5±0,17 4,6±0,16 4,2±0,13 4,6±0,16
***Р<0,001.
Анализируя полученные данные по выявлению антибактериальных антител в сыворотке крови лабораторных животных после введения поливалентной инактивированной вакцины, приведенные в табл. 2, следует отметить их положительную динамику, которая характеризовалась в каждом отдельном случае достоверным (Р<0,001) приростом их уровня.
На 21-й день после повторной иммунизации кроликов разработанным биопрепаратом происходит значимое увеличение количества специфических антител к Proteus mirabilis на 3,25 log2, в опытной группе морских свинок данный показатель возрос на 2,4 log2.
Увеличение титра антибактериальных антител в реакции агглютинации к E. coli A20 происходило в организме лабораторных животных опытных групп. В сыворотке крови кроликов данных показатель увеличился на 2,5 log2, морских свинок - на 2,8 log2.
Схожая ситуация наблюдается и с динамикой антибактериальных антител к штамму бактерий E. coli F41, уровень которых на 21-й день после повторной иммунизации поливалентной инактивированной ви-русно-бактериальной вакцинации достоверно увеличивался в крови кроликов на 3 log2, а в организме морских свинок - на 2,9 log2.
Заключение. Иммунный ответ у кроликов при обработке их поливалентной инактивированной вирусно-бактериальной вакциной для профилактики заболеваний репродуктивных органов коров и желудочно-кишечного тракта телят характеризовался достоверным увеличени-
ем уровня противовирусных антител на 1,25-3,5 log2 и антибактериальных - на 2,5-3,25 log2; у морских свинок динамика противовирусных антител характеризовалась увеличением их уровня в 1,8-2,3 раза, антибактериальных - на 2,4-2,9 log2, что свидетельствует о высокой иммуногенной активности разработанной поливалентной инактивированной вирусно-бактериальной вакцины для профилактики заболеваний репродуктивных органов коров и желудочно-кишечного тракта телят и позволяет использовать разработанный биопрепарат для проведения дальнейших исследований в производственных условиях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Апатенко, В.М. Смешанные инфекции сельскохозяйственных животных / В.М. Апатенко. - Киев: Урожай, 1990. - 172 с.
2. Бакулов, И. А. Особенности распространения вирусных болезней животных в современных условиях и их профилактирование / И.А. Бакулов, Г.Г. Юрков // Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии. - Казань, 1980. - С. 4-5.
3. Борисова, Т.В. Эффективность эроконда при мастите и эндометрите у коров / Т.В. Борисова // Матер. Всерос. науч. и учеб.-метод. конф. по акушерству, гинекологии и биотехн. размножению животных. - Воронеж, 1994. - С. 216.
4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин [и др.]. - М.: Всерос. науч.-исслед. и технол. ин-т биол. пром-сти, 1998. - 928 с.
5. Григорьева, Т.Е. Лечение и профилактика эндометритов у коров / Т.Е. Григорьева. - М.: Росагропромиздат, 1988. - С. 16-31.
6. Новиков, О.Г. Эпизоотология наиболее распространенных инфекционных болезней крупного рогатого скота, разработка средств и методов их профилактики и лечения: автореф. дис. ... д-ра вет. наук; 16.00.03 / О.Г. Новиков // Всерос. науч.-исслед. вет. ин-т патологии, фармакологии и терапии. - Воронеж, 1994. - 42 с.
7. Феоктистова, Н.А. Биологические особенности бактерий рода Proteus и их роль в патологии животных / Н.А. Феоктистова // Ветеринария с.-х. животных. - 2007. -№ 3. - C. 38-40.
8. Фомин, Ю.В. Случаи абортов у стельных коров, вызванные вирусом инфекционного ринотрахеита / Ю.В. Фомин, Н.В. Фоменко // Тез. докл. Всесоюзной межвузов. науч. конф. по вет. вирусологии. - М., 1973. - С. 44-45.
9. Фукс, П.П. Вирусно-микоплазменная патология генитальных и респираторных органов крупного рогатого скота (этиология, патогенез, диагностика): автореф. дис. ... д-ра вет. наук; 16.00.03 / П.П. Фукс. - Казань, 1990. - 38 с.
10. Чомаев, А.М. Лечение послеродовых эндометритов у коров / А.М. Чомаев // Зоотехния. - 1997. - № 10. - С. 28-29.
УДК 619:578.832.1:636.5
ОЧИСТКА И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ РЕОВИРУСА ПТИЦ
А.А. ГУЛЯКО, И.В. НАСОНОВ, И.С. РАДЮШ РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского НАН Беларуси» г. Минск, Республика Беларусь, 220003
(Поступила в редакцию 16.01.2013)
Введение. Основным средством профилактики инфекционных заболеваний остаются вакцины. В ветеринарной практике в основном
