CC BY
30VETERINARY MICROBIOLOGY, VIROLOGY AND EPIZOOTOLOGY
УДК 619:616.98-07/.091: 636.2
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ АНАЭРОБНОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ ЖИВОТНЫХ
А.Г.Спиридонов - кандидат биологических наук, ст.н.с.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, Казань, Научныйгородок-2; тел. +7(843) 2-39-53-37, е-таИ: [email protected]).
Представлены материалы исследований по разработке иммуноферментной тест-системы для определения специфических антител к бактериям Cl.perfringens. В качестве производственных использовали штаммы Cl.perfringens: №28 (тип А), 1В-1 (тип В), №392 (тип С), №213 (тип Д). Для получения антигена суточную суспензию бактерий О. perfringens, содержащую 20 млрд. микробных клеток в 1 см3 (по 5 млрд. микробных клеток каждого серотипа), озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе с частотой 20 мГц в течение 15 мин при 40С, затем эндотоксин осаждали сульфатом аммония и очищали дифференцированным растворением преципитата в 0,02 М фосфатном буфере с последующим диализом против водопроводной воды. Контрольную положительную сыворотку с тирами специфических антител не ниже 1:12800 к антигенам бактерий Cl.perfringens получили путем гипериммунизации крупного рогатого скота корпускулярными антигенами и анатоксинами. Проводили стандартизацию основных условий проведения реакции ИФА. Определение концентрации сорбции антигена осуществляли при параллельном тестировании различных разведений конъюгата. Наиболее приемлемый показатель титра сывороток крови животных выявили при разведении конъюгата 1:2500 и концентрации сорбированного антигена 5-8 мкг/см3. Производственное испытание иммуноферментной тест-системы осуществляли в скотоводческих хозяйствах трех регионов РФ, неблагополучных по анаэробной энте-ротоксемии телят. Всего исследовали 677 проб сывороток крови, в том числе 240 от больных анаэробной энтеротоксемией животных, 389 проб от вакцинированных против анаэробной энтеротоксемии и 48 от клинически здоровых животных из стационарно благополучного хозяйства. Установили, метод ИФА позволяет выявлять специфические антитела к бактериям Cl.perfringens у 97,7% вакцинированных и 94,6% больных анаэробной энтеротоксемией животных. Положительные результаты лабораторного и производственного испытания тест-системы позволяют рекомендовать ее к внедрению в ветеринарную практику РФ.
КЛючЕВЫЕ СЛОВА: анаэробная энтеротоксемия, С1.регМпдепэ, телята, диагностика, иммуно-ферментный анализ.
В структуре заболеваемости сельскохозяйственных животных наибольшее экономическое значение имеют желудочно-кишечные болезни молодняка, в том числе анаэробная энтеротоксемия, возбудителями которой являются бактерии Clostridium perfringens (Cl.perfringens) [2, 6, 8]. На сегодняшний день диагноз на инфекционную энтеротоксемию животных ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторного исследования патологического материала. Недостатками лабораторного метода являются трудоемкость и длительность исследований, требующего для постановки диагноза до 8 рабочих дней, а также высокая его себестоимость (дороговизна питательных сред, реактивов, затраты на приобретение и содержание лабораторных животных) [1, 5, 9]. Совершенно очевидно, что современная диагностическая служба должна опираться на такие высокоспецифичные и чувствительные методы диагностики, которые позволяли бы получить воспроизводимые, достоверные результаты в пределах метода, и должны быть признаны пригодными для проведения широкомасштабных исследований в условиях ветеринарных лабораторий. Этими требованиями в значительной степени отвечает твердофазный непрямой вариант иммуноферментного анализа [2].
В ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработана ассоциированная вакцина против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят [4, 7]. Для контроля ее качества требуется разработать метод определения антигенной активности вакцины путем установления титров специфических антител в сыворотке крови вакцинированных животных к бактериям Cl.perfringens.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилась разработка ИФА тест-системы для определения специфических антител к бактериям Cl.perfringens в сыворотке крови животных.
Материалы и методы. При изготовлении ди-агностикума в качестве производственных использовали штаммы Cl.perfringens: №28 (тип А), Ш-1 (тип В), №392 (тип С), №213 (тип Д), полученные из ФГБУ «ВГНКИ».
При получении антигена для сенсибилизации полистироловых планшет суточную суспензию бактерий СкрегШдепБ, содержащую 20 млрд. микробных клеток в 1 см3 (по 5 млрд. микробных клеток каждого серотипа), озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе с частотой 20 мГц в течение 15 мин при 40С до полного разрушения клеток. Затем эндотоксин осаждали сульфатом аммония при 40% насыщении, рН 7,0 и очищали дифференцированным растворением преципитата в
ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ, ЭПИЗООТОЛОГИЯ
0,02 М фосфатном буфере рН 6,8 с последующим диализом против водопроводной воды.
Контрольную положительную сыворотку к антигену бактерий 01.регШдепв получали путем гипериммунизации клинически здорового молодняка крупного рогатого скота 6-7-месячного возраста. Для этой цели применяли корпускулярные антигены и анатоксины производственных штаммов бактерий 01.регШдепвсе-ротипов А, В, С и Д. Корпускулярный антиген представлял собой суспензию инактивированных формалином бактерии 01.регШдепв, содержащую по 2,5 млрд. микробных клеток каждого серотипа в 1 см3. Для получения анатоксина бактерии О.регШдепв выращивали в жидкой питательной среде в течение 7 ч, потом токсин инактивировали формалином при температуре 370С в течение 10 сут и очищали путем центрифугирования и фильтрации культуральной жидкости через бактериальные фильтры.
Гипериммунизацию животных проводили 4-х кратно с интервалом 14 дней. При этом животным вводили одновременно корпускулярный антиген подкожно и анатоксин - внутримышечно в нарастающих дозах. Для предупреждения анафилактического шока, начиная со второго цикла иммунизации, животным вводили по 2 см3 антигена подкожно за 30-40 мин до введения основной дозы антигена. Через 20 дней после последнего введения антигена у животных из яремной вены брали пробу крови для определения титров специфических антител. Производственное взятие крови производили при наличии антител в сыворотке крови быков-продуцентов к О.регШдепв в титрах не ниже 1:12800 в ИФА.
Контрольную отрицательную сыворотку, не содержащую антител к 01.регШдепв, получали от молодняка крупного рогатого скота 6-7-месячного возраста из хозяйства, благополучного по анаэробной энтеротоксемии.
Иммуноферментный анализ проводили в 96-лу-ночных плоскодонных планшетах для иммунологических реакций по общепринятой методике. Результаты реакции учитывали по показаниям оптической плотности при длине волны 490 нм.
Результаты исследований. Вначале проводили стандартизацию основных условий постановки реакции ИФА. При определении оптимальной концентрации антигена для адсорбции на полистироловый 96-луночный планшет оценивали интенсивность иммуноферментной реакции при концентрациях антигена в растворе: 2,0; 2,5; 5,0; 8,0; 10 мкг/см3. В качестве тестируемых образцов использовали «положительные» и «отрицательные» контрольные образцы сывороток крови животных. Проводили подбор концентрации сорбции антигена при параллельном тестировании различных разведений конъюгата. Наиболее приемлемый показатель титра сывороток крови животных выявили при разведении конъюгата 1:2500 и концентрации сорбированного антигена 5-8
мкг/см3. Таким образом, данное разведение конъю-гата, при исходной концентрации сорбированного антигена 5-8 мкг/см3, сочли оптимальным и использовали в дальнейшей работе.
Проводили определение оптимального времени экспозиции исследуемых сывороток, для установления которого в 3-х повторностях оценивали интенсивность реакции в зависимости от времени инкубирования специфических и отрицательных сывороток в серийных разведениях при температуре 370С. При этом конъюгат использовали в рабочем разведении 1:2500. Установили, что показатели оптической плотности исследуемых сывороток в диапазоне от 15 до 60 мин возрастали, а далее стабилизировались. Наблюдаемый эффект зафиксировали для сывороток, обладающих различным уровнем специфической активности. На этом основании 60-минутную экспозицию сывороток считали достаточной для достижения максимальной и стабильной реакции.
Для учета и интерпретации результатов, полученных тест-системой ИФА, определяли позитивно-негативный порог тест-системы, который находился в диапазоне <15% - >22%. В дальнейшем все пробы, значение Ксв которых было меньше позитивно-негативного порога, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв равным или превышающим этот показатель - положительными.
Провели межлабораторное комиссионное испытание компонентов тест-системы на специфичность, чувствительность и воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа. В опытах использовали контрольную положительную сыворотку к бактериям 01.регШдепв, контрольную отрицательную сыворотку по отношению к бактериям 01.регШдепв, сыворотку крови от вакцинированных против анаэробной энте-ротоксемии и больных анаэробной энтеротоксемией телят, а также гетерогенные гипериммунные сыворотки (сальмонеллезную, эшерихиозную). При этом установили, что все компоненты набора активны и специфичны в ИФА. Специфический антиген не реагирует с гетерогенными гипериммунными сыворотками (саль-монеллезной, эшерихиозной), тогда как с гомологичными сыворотками (гипериммунной сывороткой и сыворотками крови, полученными от вакцинированных против анаэробной энтеротоксемии и явно больных животных) дает положительную реакцию в высоких титрах - 1:3200 - 1:12800.
Производственное испытание иммунофермент-ной тест-системы проводили в скотоводческих хозяйствах 3 регионов РФ, неблагополучных по анаэробной энтеротоксемии телят. Всего исследовали 677 проб сывороток крови, в том числе 240 - от больных анаэробной энтеротоксемией животных, 389 проб от вакцинированных против анаэробной энтеротоксемии и 48 - от клинически здоровых животных из стационарно благополучного хозяйства. Результаты серологического исследования представлены в таблице.
27
ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИОНАЛОВ ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
VETERINARY MICROBIOLOGY, VIROLOGY AND EPIZOOTOLOGY
Таблица
Результаты исследования сывороток крови крупного рогатого скота на наличие специфических антител к
бактериям О.регМпдепз
Наименование региона Количество проб Состояние животных Реагируют положительно в ИФА к Cl.perfringens
количество проб
всего %
Республика Татарстан 187 больные, не вакцинированные 178 95,2
234 вакцинированные 228 97,4
Самарская область 35 больные, не вакцинированные 32 91,4
126 вакцинированные 124 98,4
Нижегородская область 18 больные, не вакцинированные 17 94,4
29 вакцинированые 28 96,5
Всего 240 больные, не вакцинированные 227 94,6
389 вакцинированые 380 97,7
Республика Татарстан 48 клинически здоровые, не вакцинированные из благополучного хозяйства - -
Из таблицы видно, что метод ИФА позволяет выявлять специфические антитела к бактериям 01.регШдепв у 97,7% здоровых вакцинированных и у 94,6% больных анаэробной энтеротоксемией животных.
Заключение. Разработана и испытана в производственных условиях иммуноферментная тест-си-
Литература
стема для диагностики анаэробной энтеротоксемии животных и иммунологического мониторинга вакцинированного поголовья, положительные результаты которых позволяют рекомендовать ее к внедрению в ветеринарную практику РФ.
1. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции / Б.И.Антонов, В.В.Борисова, П.М.Волкова [и др.]. - М.: Агропромиздат, 1986. - 352 с.
2. Гаффаров, Х.З. Иммуноферментный анализ в диагностике реовирусной инфекции крупного рогатого скота / Х.З.Гаффаров, М.А.Ефимова, О.В.Москвичев // Ветеринарный врач. - 2011. - № 5. - С. 14-16.
3. Куриленко, А.Н. Бактериальные и вирусные болезни молодняка с.-х. животных / А.Н.Куриленко, В.Л.Кру-пальник, Н.В.Пименов. - М.: КолосС, 2006. - 296 с.
4. Патент №2428202 Рос. Федерация, МПК А61Р 031/04, А61К 039/116, А61К 039/108, А61К 039/08. Вакцина ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят / Г.Н.Спиридонов, А.А.Иванов, Х.Н.Макаев, М.Т.Хурамшина, А.Г.Спиридонов, Э.Р.Галиуллина; заявитель и патентообладатель ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - № 2010124555/15; опубл. 10.09.2011, Бюл. №25.
5. Салимов, В.А. Некоторые особенности патологоанатомической диагностики анаэробной энтеротоксемии телят, вызванной Cl.perfringens типа А / В.А.Салимов, Н.П.Салимова // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях: мат. науч.-практ. конф. - Воронеж, 2002. - С. 527-528.
6. Инфекционная энтеротоксемия молодняка сельскохозяйственных животных в регионе Среднего Поволжья и Предуралья. / Г.Н.Спиридонов, А.Ф.Махмутов, М.Т.Хурамшина, А.Г.Спиридонов // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: мат. науч.-практ. конф. - Краснообск, 2010. - С. 134-139.
7. Современные подходы к специфической профилактике и лечению анаэробной энтеротоксемии и эшери-хиозной диареи телят / А.Г.Спиридонов, Д.Д.Насертдинов, Х.Н.Макаев, Г.Н.Спиридонов // Ветеринарный врач. - 2015. - № 6. - С. 12-15.
8. Novel insights into the epidemiology of Clostridium perfringens type A food poisoning / M.Lindstrom, A.Heikinheimo, P.Lahti, H.Korkeala // Food Microbiol. - 2011. - № 28 - P. 192-198.
9. Enteritis associated with Clostridium perfringens type A in 9-month-old calves / B. Savic [et al.] // Can. Vet. J. -2012. - № 53 - P. 174-176.
ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ, ЭПИЗООТОЛОГИЯ
ENZYME LINKED IMMUNOASSAY (ELISA) METHOD FOR DIAGNOSTICS OF ANIMALS ANAEROBIC ENTEROTOXEMIA
Spiridonov A.G. - Candidate of Biological Sciences.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: [email protected]).
The research data on developing ELISA test-system to detect specific antibodies against bacteria Cl.Perfringens are presented. The strains were used as producton: № 28 (type A), LD-1 (type B), № 392 (type C), № 213 (type D). To obtain antigen the daily suspension of Cl.Perfringens containing 20 milliards of microbial cells in 1 cm3 (5 milliards of microbial cells in each serotype), was sounded on a ultrasound disintegrator of 20 mHertz for 15 minutes at 400C, then Endotoxin was precipitated by ammonium sulfate and purified by differential solving of precipitation in 0,02 M phosphate buffer followed by dialysis against tap water. The positive test serum with antibody titers not below than 1:12800 against Cl. Perfringens antigens was obtained by hyperimmunization of cattle using corpuscular antigens and anatoxins. The standardization of the basic conditions for conducting ELISA reaction was carried out. The antigen sorbtion concentration was detected while simultaneous testing of different conjugant dilutions. The most acceptable animals blood serum titer index was detected at conjugate dilution 1:2500 and in sorbet antigen concentration of 5-8 mkg/cm3. The production testing of ELISA test-system was carried out in unwell for calves anaerobic enterotoxemia cattle breeding farms of the 3 regions of the Russian Federation. Altogether 677 blood serum samples were examined, including 240 - from anaerobic enterotoxemia animals, 389 samples - from vaccinated against anaerobic enterotoxemia and 48 - from clinically health animals in stationary well-being farm. The ELISA method was found to make it possible to detect specific antibodies against Cl.Perfringens bacteria in 97.7% vaccinated and 94,6 % anaerobic enterotoxemia animals. The positive results of laboratory and production test of the test-system enable to recommend it to be implemented it into veterinary practice of the Russian Federation.
KEYWORDS: anaerobic enterotoxemia, Cl. Perfringens, calves, diagnosis, Enzyme linked immunoassay (ELISA) analysis.
References
1. Laboratornye issledovaniya v veterinarii. Bacterialnye infektsii [Laboratory research in veterinary medicine. Bacterial infections] / B.I.Antonov,V.V.Borisova,P.M.Volkova [et al.]. - М.: Agropromizdat, 1986. - 352 p.
2. Gaffarov, Kh.Z. Immunofermentny analiz v diagnostike reovirusnoy infektsii krupnogo rogatogo skota [Using ELISA in cattle reovirus infection diagnostics] / Kh.Z.Gaffarov M.A.Efimova, O.V.Moskvichev // Veterinarny vrach. -
2011. - № 5. - Р. 14-16.
3. Kurilenko, A.N. Bacterialnye I virusnye bolezni molodnyaka selskokhozyaystvennykh zhivotnykh [Bacterial and viral diseases of young farm animals] / A.N.Kurilenko, V.L.Krupalnik, N.V.Pimenov. - M.: KolosS, 2006. - 296 p.
4. Patent Ros. Federatsiya, Патент РФ на изобретение №2428202. MPK A61P 031/04, A61K 039/116, A61K 039/108, A61K 039/08. Vaktsina assotsiirovannaya protiv anaerobnoy enterotoksemii I esherikhioznoy diarei telyat [Associated vaccine against anaerobic enterotoxemia and colibacillus diarrhea] / G.N. Spiridonov, A.A.Ivanov, Kh.N.Makaev, М.Т. Khuramshina, A.G. Spiridonov, E.R.Galiullina; applicant and patent possessor FGBU ФГБУ «FCTRB-VNIVI». - № 2010124555/15; published. 10.09.2011, Бюл. № 25.
5. Salimov, V.A. Nekotorye osobennosti patologoanatomicheskoy diagnostiki anaerobnoy enterotoksemii telyat, vyzvannoy Cl. perfringens tipa A [Some peculiarities of postmortem diagnosis of anaerobic enterotoxemia caused by Cl. perfringens Cl. perfringens type A / V.A.Salimov, N.P.Salimova. // Aktualnye problemy bolezney molodnyaka v sovremennykh usloviyakh: materialy nauch.-prakt. konf. [Actual problems of young farm animals in modern conditions: Proceedings from sci.-pract. conf.]. - Voronezh, 2002. - P. 527-528.
6. Infektsionnaya enterotoksemiya molodnyaka selskokhozyaystvennykh zhivotnykh v regione Srednego Povolzhya I Preduralya [Infectious enterotoxemia of young farm animals in the regions of Middle Volga and Middle Urals ] / G.N.Spiridonov A.F.Makhmutov, М.Т.Khuramshina, A.G.Spiridonov // Aktualnye voprosy veterinarnoy meditsiny Sibiri: materialy nauch.-prakt. konf. [Actual problems of Siberian veterinaty medicine: Proceedings from sci.-pract. conf.]. - Krasnoobsk, 2010. - P. 134-139.
7. Sovremennye podkhody k spetsificheskoy profilaktike I lecheniyu anaerobnoy enterotoksemii I esherikhioznoy diarei telyat [Modern approaches to specific prevention and treatment of calves anaerobic enterotoxemia and colibacillus diarrhea] / A.G.Spiridonov, D.D.Nasertdinov, Kh.N.Makaev, G.N.Spiridonov // Veterinarny vrach. - 2015. - № 6. - Р. 12-15.
8. Novel insights into the epidemiology of Clostridium perfringens type A food poisoning / M.Lindstrom, A.Heikinheimo, P.Lahti, H.Korkeala // Food Microbiol. - 2011. - № 28 - P. 192-198.
9. Enteritis associated with Clostridium perfringens type A in 9-month-old calves / B.Savic [et al] // Can. Vet. J. -
2012. - № 53 - P. 174-176.
ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИОНАЛОВ ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
29
