CC BY
109
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 1, 2012
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.371:579.852.13].07
Т. Н. Мосунова, Л. В. Бакулина, М. Ю. Дубровин, Н. В. Богачева, Т. Л. Бочкарева,
К. А. Воробьев, И. В. Дармов
ИММУНОФЕРМЕНТНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРОВ СЫВОРОТОЧНЫХ ПРОТИВОБОТУЛИНИЧЕСКИХ ТИПА A АНТИТЕЛ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ЛЮДЕЙ БОТУЛИНИЧЕСКИМ ТРИАНАТОКСИНОМ
ФГУ 48 Центральный НИИ Министерства обороны Российской Федерации, Киров
Разработана и оценена эффективность методики иммуноферментного определения противоботулинических типа A антител в сыворотках крови человека. Наличие антител регистрируют в сыворотках крови после второй и последующих иммунизаций людей бутулиническим трианатоксином (титр от 1:400 до 1:3200). В ряде случаев можно также отметить тенденцию к возрастанию титра антител уже после первого введения анатоксина (титр до 1:200). При определении взаимосвязи между регистрируемыми в ИФА титрами противоботулинических антител и активностью сывороток при защите белых мышей от токсина коэффициент корреляции между представленными величинами составил 0,58.
Ключевые слова: иммуноферментный анализ, противоботулинические типа A антитела, сыворотка крови
Mosunova T.N., Bakulina L.V., Dubrovin M.Yu., Bogatcheva N.V., Botchkareva T.L., Vorobiyev K.A., Darmov I.V THE IMMUNE-ENZYME TESTING OF TITERS OF SERUM ANTI-BOTULIN ANTIBODIES TYPE A DURING IMMUNIZATION OF PATIENTS WITH BOTULIN TRIANATOXIN The article discusses the effectiveness of the technique of immune-enzyme detection of anti-botulin antibodies type A in human blood serum. The presence of antibodies is registered in blood serum after second and subsequent immunization with botulin trianatoxin (titer from 1:400 to 1:3200). The establishment of relationship between the registered titers of anti-botulin antibodies and the activity of serum during protection of white mice from toxin revealed the correlation coefficient between these values as 0.58.
Key words: immune-enzyme analysis, anti-botulin antibody type A, blood serum
В Российской Федерации для профилактики ботулизма при работе с культурами Clostridium botulinum и их токсинами используют ботулинический трианатоксин, представляющий собой смесь анатоксинов типов A, В и Е. Курс первичной иммунизации состоит из трех прививок: двукратной вакцинации с интервалом 25—30 сут и ревакцинации через 6—9 мес. Последующие однократные ревакцинации проводят каждые 5 лет. Однако в случае нарушения схемы иммунизации (своевременная ревакцинация может быть пропущена вследствие декретного отпуска, болезни и т. д.) необходимо принимать решение о предельных сроках перерыва между ревакцинациями, при превышении которых необходимо заново проводить трехкратное введение анатоксина. Для обоснования таких решений, а также для выявления рефрактерных лиц, вакцинация которых не обеспечила выработку должного иммунного ответа, необходимо определение уровня противоботу-линических антител косвенными методами.
До настоящего времени в качестве "золотого стандарта" при оценке активности лечебных ботулинических сывороток, а также напряженности иммунитета у человека используют метод определения токсиннейтрализующей активности сывороток в биопробе на белых мышах. При всех своих достоинствах (высокая чувствительность, специфичность) метод определения антитоксинов в биопробе имеет существенные недостатки: необходимость большого объема сыворотки, длительность анализа (не менее 8 суток с учетом предварительного титрования токсина), использование большого количества животных, опасность проведения исследований для персонала. Эти недостатки делают невозможным использование биопробы для широких скрининговых исследований, альтернативным решением данной проблемы является применение метода иммуноферментного анализа (ИФА) [4, 6].
Целью наших исследований была разработка и проверка эффективности методики иммуноферментного определения проти-воботулинических типа A антител в сыворотках крови человека.
Для корреспонденции:
Богачева Наталья Викторовна, канд. мед. наук, нач. инфекц. отд-ния Адрес: 610033, Киров, ул. Московская, 114/1-36 Телефон: 52-72-37
Материалы и методы. Для исследования использовали сыворотки крови, полученные от лиц, подвергавшихся плановой иммунизации как ботулиническим трианатоксином, так и другими вакцинными препаратами. На момент написания статьи были получены 61 сыворотка крови от иммунизированных трианаток-сином лиц и 31 сыворотка от лиц, в анамнезе которых иммунизация против ботулизма не зарегистрирована.
Сыворотки крови лиц, в анамнезе которых не зафиксирована иммунизация против ботулизма, рассматривали как отрицательные. Однако необходимо отметить, что полностью исключить наличие в таких сыворотках антитоксических антител нельзя. Опыт использования ботулинического токсина в лечебных и косметических целях показал, что введение даже безвредных микродоз препарата приводит к развитию заметной иммунной защиты от токсина, проявляющейся в неэффективности последующих введений лечебного препарата [2, 3, 8]. Поэтому наличие антитоксических антител может быть обусловлено косметическими процедурами с использованием препаратов "Botox" или "Dysport", а также контактом с анатоксином или бытовыми отравлениями малыми дозами токсина. Для снижения вероятности влияния этих неконтролируемых факторов при формировании отрицательного контрольного образца, используемого при отработке методики определения противоботулинических антител, были объединены равные объемы 5 сывороток крови, полученные от лиц не старше 30 лет, не иммунизированных против ботулизма.
В качестве положительного контрольного образца взята смесь равных объемов 5 сывороток крови, полученных от лиц, многократно иммунизированных трианатоксином (3 введения в ходе первичного курса вакцинации и 2 ревакцинации).
Специфические антитела определяли методом ИФА. В качестве твердофазного антигена использовали высокоочищенный ботулинический типа А анатоксин, полученный из соответствующего нейротоксина по методу, разработанному ранее в 48 ЦНИИ Минобороны России [1] и включающему 4 стадии: переосаждение сульфатом аммония при степенях насыщения 20 и 40%, гель-проникающую хроматографию на сефакриле S-300, адсорбционную хроматографию на гидроксиапатите и ионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе. После очистки препарат подвергали детоксикации формалином. Анализ проводили на стандартном оборудовании и при использовании стан-
36
ИММУНОЛОГИЯ
Таблица 1
Титры противоботулинических типа А антител в сыворотках крови лиц, вакцинированных и не вакцинированных ботулиниче-ским трианатоксином
Кратность введения трианатоксина донору сыворотки
Интервал между последней иммунизацией и забором крови
Процент лиц с указанными титрами противоботулинистических антител, %
До вакцинации (n = 31) 1 < 100 1 100 1 200 1 400 1 800 1 1600 1 3200
87,1 6,5 3,2 3,2 — — —
1 2—4 нед (n = 6) 50,0 33,3 16,7 — — — —
2 2—4 нед (n = 5) — — — 20,0 20,0 20,0 40,0
3 1—12 мес (n = 4) — — — 25,0 25,0 50,0 —
36—60 мес (n = 4) — — 25,0 50,0 25,0 — —
4 12—36 мес (n = 9) — — 11,1 55,6 11,1 22,2 —
36—60 мес (n = 6) — 33,3 33,3 16,7 16,7 66,7 —
> 5 2—4 нед (n = 3) — — — — — 66,7 33,3
12—36 мес (n = 7) — — 28,6 14,3 42,8 14,3 —
36-60 мес (n = 8) — — 37,5 25,0 25,0 12,5 —
дартных реактивов для ИФА. В лунки полистироловых планшетов Costar (США) вносили анатоксин в количестве 20 мкг/мл в объеме 100 мкл и выдерживали в течение 18—20 ч при 4oC. После окончания инкубации планшеты промывали трижды фосфатно-солевым буферным раствором с 0,05% твина-20 (ФСБ-Т). В отмытом от анатоксина планшете последовательно инкубировали анализируемые сыворотки или контрольные образцы и иммуноферментный конъюгат против IgG человека (специфичный к у-цепи; "Sigma", США) в объеме 100 мкл на лунку. Продолжительность инкубации сывороток и конъюгата составила 60 мин при 37oC. По окончании инкубации каждого реагента лунки трижды промывали ФСБ-Т. После инкубации конъюгата и отмывки планшета в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора субстратной смеси на основе тетраметиленбензидина ("Sigma", США) и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением стоп-реагента (1М раствор серной кислоты). Результаты учитывали на фотометре Stat-Fax 2100 ("Awareness", США) по поглощению света при длине волны 450 нм. Все разведения анализируемых сывороток и конъюгата осуществляли ФСБ (рН 7,4) с добавлением 0,05% твина-20 и 2% нормальной кроличьей сыворотки.
При определении токсиннейтрализующей активности сывороток в биопробе на белых мышах животным вводили ботуло-токсин типа А с взятой в различных разведениях исследуемой сывороткой. По числу выживших животных оценивали антитоксическую активность сыворотки, которую выражали в международных единицах (ME). Одна ME нейтрализует 104 • ЛД50 боту-линического токсина типа А.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью статистического пакета Statistica 6.0 для Windows ХР с использованием параметрических и непараметрических методов статистики.
Результаты и обсуждение. Эффективность определения противоботулинических антител проверяли по двум критериям. Во-первых, результаты анализа должны позволять надежно дифференцировать сыворотки крови неиммунных людей от сывороток лиц, подвергавшихся вакцинации против ботулизма. Во-вторых, методика должна позволять регистрировать иммунный ответ на введение трианатоксина (табл. 1).
Среднее значение оптической плотности индикаторной смеси при анализе отрицательных сывороток в разведении 1:100 составило 0,274 ед. со среднеквадратичным отклонением 0,046 ед. За титр сывороток принимали их максимальное разведение, при котором величина сигнала в ИФА превышала 0,366 ед. (Хо + 2а). С использованием этого критерия при анализе разведенных в 100 раз сывороток крови, взятых у сотрудников после второй и последующих иммунизаций, положительные результаты получены в 100% случаев. В ряде случаев можно также отметить тенденцию к возрастанию титра антител уже после первого введения анатоксина.
При анализе отрицательных сывороток в 4 случаях из 31 оптическая плотность индикаторной смеси также превысила указанное выше пороговое значение (доноры № 146, 208, 459 и 454), причем в одном случае (донор № 146) это превышение зарегистрировано даже при разведении сыворотки в 400 раз. Эти результаты могли быть обусловлены как недостаточной специфичностью анализа, так и наличием в сыворотках определенного уровня антитоксических антител даже при отсутствии в анамнезе прививок против ботулизма. Для проверки этих возможностей ряд сывороток был проанализирован в реакции торможения. Для этой цели в анализируемые пробы (разведения сывороток в 100 раз) добавляли лечебную лошадиную противо-ботулиническую сыворотку типа А в разведении 1:200. Контролем служили сыворотки с добавлением нормальной лошадиной сыворотки (табл. 2).
Как и следовало ожидать, добавление лечебной сыворотки к сывороткам крови иммунизированных доноров (№ 38 и 448) привело к резкому снижению сигнала в ИФА за счет блокирования иммобилизированного на полистироле анатоксина. При анализе сывороток крови доноров № 144 и 208 такое снижение не отмечено. Следовательно, регистрируемый в этих случаях сигнал обусловлен неспецифическим связыванием сывороточных белков с твердой фазой.
В случае же анализа отрицательных сывороток № 146, 454 и 459, как и анализа иммунных сывороток, зарегистрировано зна-
Таблица 2
Влияние лечебной противоботулинической типа А сыворотки на величину сигнала при определении в ИФА противоботули-нических типа А антител в сыворотках крови человека
Кратность введения триана-токсина донору сыворотки Номер донора крови Оптическая плотность (Х ± Т ) индикаторной смеси при анализе сыворотки, ед., с добавлением
нормальной лошадиной сыворотки противоботули-нической сыворотки типа A
До вакцинации 144 0,166 ± 0,025 0,186 ± 0,031
146 0,763 ± 0,042 0,442 ± 0,029
208 0,455 ± 0,035 0,476 ± 0,030
459 0,363 ± 0,028 0,162 ± 0,030
454 0,407 ± 0,027 0,335 ± 0,032
4 38 1,696 ± 0,085 0,745 ± 0,090
5 448 2,042 ± 0,093 0,962 ± 0,098
37
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 1, 2012
Таблица 3
Титры противоботулинических типа A антител в сыворотках крови людей до и после иммунизации
Номер донора крови Кратность введения трианатоксина Титр сывороток
по иммунизации после иммунизации
227 1 < 100 < 100
228 < 100 200
281 < 100 < 100
280 < 100 < 100
209 2 100 1600
216 < 100 1600
282 3 400 1600
208 400 3200
359 4 800 3200
207 200 3200
279 400 3200
чимое снижение оптической плотности индикаторной смеси при добавлении лечебной противоботулинической сыворотки. Таким образом, есть все основания полагать, что, несмотря на отсутствие в анамнезе доноров прививок против ботулизма, эти сыворотки крови содержат противоботулинические антитела и должны быть исключены из числа отрицательных контрольных образцов.
На момент проведения работ у нас имелось 11 пар сывороток, взятых у одних и тех же доноров до очередной прививки и через 2—4 нед после нее (табл. 3). Эти сыворотки использованы при оценке возможности применения методики для подтверждения эффективности иммунизации. Во всех 7 случаях после второй и последующих прививок зарегистрировано возрастание титров антител: минимальное возрастание (донор № 282) в 4 раза, максимальное (донор № 216)—более чем в 16 раз. Некоторые изменения активности сывороток можно отметить и после первого введения анатоксина, однако, как отмечено выше, в этом случае уровень антител был на пределе чувствительности анализа (см. табл. 3).
Полученные данные свидетельствуют о возможности использования предлагаемой методики для оценки эффективности иммунизации ботулиническим трианатоксином.
Априорно предполагаемым недостатком иммуноферментного определения противоботулинических антител по сравнению с биопробой является то обстоятельство, что в ИФА регистрируются все связывающиеся с токсином антитела, а не только обладающие протективными свойствами. Поэтому было принято решение экспериментально определить корреляцию между результатами определения противоботулинических антител, регистрируемых этими двумя методами. В наших опытах на белых мышах была оценена токсиннейтрализующая активность 21 сыворотки крови 18 доноров (табл. 4).
В целом полученные результаты свидетельствуют о явной взаимосвязи между регистрируемыми в ИФА титрами противоботу-линических антител и активностью сывороток при защите белых мышей от токсина. Коэффициент корреляции между представленными величинами составил 0,58. Средние значения токсиннейтра-лизующей активности при титре 1:400 составляли 0,19 МЕ/мл, при титре 1:800 — менее 0,55 МЕ/мл, при титре 1:1600 — 1,28 МЕ/мл, при титре 1:3200 — 2,03 МЕ/мл. В то же время, как и в работах зарубежных авторов [5, 6, 7], ряд сывороток при относительно невысоких титрах антител оказали значительный протективный эффект на животных (доноры № 136 и 36) и, наоборот, в ряде случаев ток-синнейтрализующая активность была ниже, чем это можно было ожидать с учетом зарегистрированного в ИФА уровня противобо-тулинических антител (доноры № 281 и 391).
Отчасти это можно объяснить тем, что в ИФА регистрируются все антитела к токсину, а в биопробе — только протектив-ные. Кроме этого, причиной несовпадения результатов оценки активности сывороток этими двумя методами может быть недостаточная воспроизводимость биопробы, особенно при ограниченном количестве животных.
При исследовании иммунных сывороток в 3 случаях они были получены от одного и того же донора в разные сроки после иммунизации. Через 24 мес после первой ревакцинации (т е. четвертого введения трианатоксина) в сыворотке крови донора №
Таблица 4
Титры противоботулинических антител и токсиннейтрализу-ющая активность сывороток крови лиц, иммунизированных трианатоксином
Номер донора крови Число имму- низаций донора крови Интервал между последней иммунизацией и забором крови, мес Титр противоботу-линических антител в ИФА Токсинней- трализующая активность сыворотки, МЕ/мл
37 5 49 200 < 0,14
391 1 1 200 0,14
357 5 60 400 0,14
118 4 16 400 0,14
211 3 60 400 0,18
104 3 17 400 0,31
225 5 60 800 < 0,14
108 2 1 800 < 0,14
325 3 5 800 0,18
359 4 60 800 0,31
41 3 29 800 0,66
136 5 23 800 1,00
36 5 24 800 1,45
281 3 2 1600 0,14
391 3 3 1600 0,14
37 4 24 1600 0,31
111 2 1 1600 0,58
317 5 1 1600 3,16
392 5 1 1600 3,33
359 5 1 3200 1,45
2 4 5 3200 3,16
37 зарегистрирован титр антител 1:1600, токсиннейтрализующая активность сыворотки составила 0,31 МЕ/мл. Через 43 мес после той же иммунизации титр антител снизился до 1:200, при этом закономерно уменьшилась и протективная активность сыворотки (< 0,14 МЕ/мл). Не противоречат также друг другу результаты анализа сыворотки крови донора № 359. Вторая ревакцинация (пятое введение трианатоксина) привела к росту как уровня антител (с 1:800 до 1:3200), так и токсиннейтрализующей активности (с 0,31 до 1,45 МЕ/мл). У донора № 391 после третьего введения трианатоксина зарегистрирован значительный рост титра проти-воботулинических антител по сравнению с первой иммунизацией (с 1:200 до 1:1600), однако не наблюдали изменение протектив-ных свойств сыворотки. Эти данные, по-видимому, следует также объяснить недостаточной воспроизводимостью метода биопробы, хотя нельзя исключить и вариант индивидуальных особенностей иммунного ответа донора на вакцинацию.
Таким образом, получены предварительные данные о пригодности разработанной методики ИФА для оценки уровня про-тивоботулинических типа A антител в сыворотках крови человека при широких скрининговых исследованиях. * 1
ЛИТЕРАТУРА
1. Патент 2230325, РФ, МКИ 7 G 01 N 33/531, А 61 К 39/08. Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа A / Грачев О. Е., Елагин Г. Д., Дубровин М. Ю. и др.
2. DressierD., SaberiF. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. — 2007. — Vol. 78, N 1. — P. 108—109.
3. Jankovic J., SchwartzK. // Neurology. — 1995. — Vol. 45, № 9. — P. 1743—1746.
4. Lindsey C., SmithL. et al. // Biologicals. — 2003. — Vol. 31, № 1. — P. 17—24.
5. Sesardic D., JonesR. et al. // Mov. Disord. — 2004. — Vol. 8. — P. 85—91.
6. Siegel L. S. // J. Clin. Microbiol. — 1988. — Vol. 26, N 11. — P. 2351—2356.
7. Tsui J., WongE. et al. // Ann. Neurol. — 1988. — Vol. 24. — P. 181.
8. ZuberM., SebaldM. et al. // Neurology. — 1993. — Vol. 43, № 9. — P. 1715—1718.
Поступила 11.10.10
38
