CC BY
173
ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИОННЫХ РАБОТ
УДК 616.34-002
Д.Д. МУХАМЕТОВА1, Д.И. АБДУЛГАНИЕВА1, О.Д. ЗИНКЕВИЧ2, Н.А. САФИНА2, А.Х. ОДИНЦОВА3
казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49 2Казанская государственная медицинская академия, 420012, г. Казань, ул. Муштари, д. 11 Республиканская клиническая больница МЗ РТ, 420064, г. Казань, ул. Оренбургский Тракт, д. 138
Иммунный ответ к кишечной микробиоте при воспалительных заболеваниях кишечника
Мухаметова Диляра Дамировна — аспирант кафедры госпитальной терапии, тел. +7-904-763-40-11, e-mail: muhdilyara@gmail.com1 Абдулганиева Диана Ильдаровна — доктор медицинских наук, заведующая кафедрой госпитальной терапии с курсом эндокринологии, тел. +7-987-296-27-68, e-mail: diana_s@mail.ru1
Зинкевич Олег Данилович — кандидат биологических наук, и.о. заведующего ЦНИЛ КГМА, тел. (843) 236-50-53, e-mail: zinkevich_oleg@mail.ru2
Сафина Нэлли Ахметовна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ЦНИЛ КГМА, тел. (843) 236-50-53, e-mail: nellyasafina@mail.ru2
Одинцова Альфия Харисовна — кандидат медицинских наук, заведующая отделением гастроэнтерологии, тел. +7-987-290-53-44, e-mail: odincovaa@yandex.ru3
В статье представлены результаты исследования показателей иммунного ответа к антигенам кишечной микрофлоры у больных с воспалительными заболеваниями кишечника. В исследование было включено 55 пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника в стадии обострения и 15 человек контрольной группы. У больных с язвенным колитом и болезнью Крона выявилось понижение специфических Ig A, Ig M и повышение Ig G к большинству изучаемых антигенов по сравнению с контрольной группой. Данные изменения коррелировали с длительностью заболевания, эндоскопической активностью, клиникой и тяжестью заболевания.
Ключевые слова: кишечная микробиота, иммунный ответ, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника.
D.D. MUKHAMETOVA1, D.I. ABDULGANIEVA1, O.D. ZINKEVICH2, N.A. SAFINA 2, A.Kh. ODINTSOVA3
1Kazan State Medical University, 49 Butlerov St., Kazan, Russian Federation, 420012 2Kazan State Medical Academy, 11 Mushtari St., Kazan, Russian Federation, 420012 3Republican Clinical Hospital of MF of RT, 138 Orenburgskiy Trakt St., Kazan, Russian Federation, 420064
Immune response to the intestinal microbiota in inflammatory bowel disease
Mukhametova D.D. — postgraduate student of the Departmemt of hospital therapy, tel. +7-904-763-40-11, e-mail: muhdilyara@gmail.com1 Abdulganieva D.I. — D. Med. Sc., Head of the Departmemt of Hospital Therapy with a course of Endocrinology, tel. +7-987-296-27-68, e-mail: diana_s@mail.ru1
Zinkevich O.D. — Cand. Biol. Sc., Acting Head of CSRL KGMA, tel. (843) 236-50-53, e-mail: zinkevich_oleg@mail.ru2
Safina NA — Cand. Biol. Sc., Senior Researcher of of CSRL KGMA, tel. (843) 236-50-53, e-mail: nellyasafina@mail.ru2
Odintsova A.Kh. — Cand. Med. Sc., Head of the Departmemt of Gastroenterology, tel. +7-987-290-53-44, e-mail: odincovaa@yandex.ru3
The article presents the results of a study of immune response to antigens of the intestinal microbiota in patients with inflammatory bowel disease. The study included 55 patients with flare of inflammatory bowel disease and 15 people in the control group. In patients with ulcerative colitis and Crohn’s disease were revealed specific reduction of Ig A, Ig M and rising of Ig G to most studied antigens in comparison with the control group. These changes correlated with duration of disease, endoscopic activity, clinical features and disease severity. Key words: intestinal microbiota, immune response, Crohn’s disease, ulcerative colitis, inflammatory bowel diseases.
Таблица 1.
Уровень Ig A у пациентов с ЯК и БК по сравнению с контрольной группой
№ Исследуемые антигены Средние значения Ig A, мкг/мл
контроль ЯК БК
1 гликолипиду Rе — мутанта Salmonella minnesota 0,014±0,002 0,008±0,001* 0,013±0,002
2 ЛПС E.coli O14 0,061±0,012 0,035±0,01* 0,037±0,009
3 Bifidobacterium bifidum 0,023±0,003 0,013±0,002* 0,024±0,008
4 белковым антигенам E.coli М 17 0,41±0,09 0,2±0,05* 0,20±0,005
5 Pseudomonas aeruginosa 0,22±0,04 0,19±0,06 0,59±0,42
6 Proteus mirabilis 0,11±0,01 0,07±0,01* 0,11±0,03
7 Klebsiella pneumoniae 11,95±4,55 8,97±4,02 4,0±1,0
8 Staphylococcus aureus 17,24±5,90 29,5±12,88 26,49±17,0
9 Streptococcus spp. 25,67±7,03 30,15±13,4 27,9±15,38
10 Candida albicans 19,85±5,14 11,95±2,4 49,3±21,8
Примечание: * — p<0,05
Одной из актуальных проблем в гастроэнтерологии были и остаются воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым относятся болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). По тяжести течения, частоте осложнений и летальности они занимают одну из ведущих позиций в структуре болезней пищеварительной системы [1].
В настоящее время выделяют следующие основные факторы, приводящие к развитию ВЗК: генетическая предрасположенность, факторы окружающей среды, комменсальная микробиота просвета кишечника и нарушения иммунного ответа [2].
По мнению C. Abraham и R. Medzhitov иммунная система кишечника защищает организм хозяина от проникновения патогенов и транслокации резидентной микрофлоры при её чрезмерном росте [3]. Вместе с этим должна сохраняться иммунная толерантность к резидентным микробам кишечника. На экспериментальных моделях было показано, что нарушение этого баланса ассоциировано с кишечным воспалением и, можно предположить, является одним из условий возникновения воспалительных заболеваний кишечника у человека. Однако до конца остается непонятным, что запускает нарушения в функционировании иммунной системы [4].
В норме кишечный эпителий является эффективным барьером от транслокации различных антигенов из просвета кишки. Воспалительный процесс стенки кишки приводит к нарушению барьерной функции слизистой, стимулирует транслокацию бактериальных антигенов из просвета кишки и иммунный ответ к ним [5]. В конечном итоге иммунный ответ становится системным, что может выражаться в повышении концентрации сывороточных антибактериальных антител [6], косвенно отражая степень нарушения целостности барьера слизистой кишечника. Исходя из данного предположения мы провели исследование концентрации антител классов IgG, IgM и IgA у пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом.
Цель исследования — изучить состояние гуморального иммунного ответа к антигенам некоторых представителей микробиоты кишечника при ВЗК.
Материалы и методы
В исследование проспективно были включено 55 пациентов с ВЗК в стадии обострения (35 пациентов с ЯК, 20 с БК) и 15 здоровых добровольцев, составивших группу сравнения. У всех определялась концентрация циркулирующих иммунных комплексов, общих IgA, IgM и IgG и специфических Ig A, IgM и IgG — к гликолипиду (ГЛП) Rе — мутанта Salmonella minnesota, Bifidobacterium bifidum, липополисаха-ридам (ЛПС) E.coli O14, белковым антигенам E.coli М 17, P.aeruginosa, P.mirabilis, C. albicans, K.pneumoniae, Strep. spp., S. aureus методом иммуноферментного анализа.
В качестве антигена эндотоксина использовали гликолипид S. minnesota RE 595 (Sigma, USA), ЛПС E.coli (Sigma, USA). В качестве антигенов P.mirabilis, P.aeruginosa, S. aureus, K. pneumonia, C. albicans и др. использовали ультразвуковые дезинтеграты этих бактерий, подвергнутые ультрацентрифугированию и гельфильтрации [7]. Концентрацию антител выражали в мкг/мл.
Средний возраст больных БК составил 30,7±5,2 года, Як — 38,1±4,2 года, в группе сравнения — 30,4±6,6 года. Мужчин и женщин при ЯК было 18 (51%) и 17 (49%), при БК — 9 (45%) и 11 (55%) соответственно.
По степени тяжести больные с БК распределились следующим образом: легкой степени тяжести — 7, средней — 6, тяжелой — 7 пациентов. При ЯК: легкой — 10, средней — 16, тяжелой — 9. Тяжесть обострения оценивалось по индексу активности БК (CDAI, индекс Беста) [8] и индексу активности ЯК (Мейо) [9].
Таблица 2.
Уровень ^ M при ЯК и БК к некоторым представителям кишечной микробиоты по сравнению с группой контроля
№ Исследуемые антигены Средние значения IgM, мкг/мл
контроль ЯК БК
1 гликолипиду Rе — мутанта Salmonella minnesota 7,24±2,47 5,12±1,56 3,50±1,47*
2 ЛПС E.coli O14 11,43±4,11 6,19±2,28* 5,21±2,05*
3 Bifidobacterium bifidum 12,36±3,24 9,66±3,67* 7,85±2,98*
4 белковым антигенам E.coli М 17 27,15±12,41 24,24±10,58 11,37±4,26*
5 Pseudomonas aeruginosa 32,93±10,91 43,48±26,98 16,35±5,62*
6 Proteus mirabilis 21,30±11,82 19,04±7,67 9,58±3,56
7 Klebsiella pneumoniae 75,57±62,22 50,69±30,45 24,99±16,79*
8 Staphylococcus aureus 30,20±14,32 16,05±4,94 11,36±4,62*
9 Streptococcus spp. 32,08±10,66 21,12±6,29* 16,04±4,80*
10 Candida albicans 38,00±15,50 29,56±16,98 19,41±9,59*
Примечание: * — p<0,05
Таблица 3.
Уровень ^ G при ЯК и БК к некоторым представителям кишечной микробиоты по сравнению с группой контроля
№ Исследуемые антигены Средние значения IgG, мкг/мл
контроль ЯК БК
1 гликолипид Rе — мутанта Salmonella minnesota 1,26±0,29 1,62±0,55 1,42±0,37
2 ЛПС E.coli O14 2,75±0,78 13,71±13,07 12,13±12,38
3 Bifidobacterium bifidum 10,72±3,68 6,16±1,92* 5,60±2,20*
4 белковые антигены E.coli М 17 17,11±5,77 50,55±43,49 32,58±10,79*
5 Pseudomonas aeruginosa 11,23±3,61 18,14±4,04* 25,60±7,89*
6 Proteus mirabilis 12,75±3,86 19,13±4,51 24,05±7,53*
7 Klebsiella pneumoniae 48,43±27,60 57,63±17,65 86,27±50,79
8 Staphylococcus aureus 70,66±9,56 219,70±152,62 162,18±135,67
9 Streptococcus spp. 85,67±14,42 226,94±118,38 162,18±135,67
10 Candida albicans 111,64±77,32 127,32±59,93 139,71±90,96
Примечание: * — p<0,05
Длительность заболевания составила 6,2±1,6 года. По течению пациенты с БК и ЯК, соответственно, распределились следующим образом: острое течение — 3 (15%) и 6 (17%), рецидивирующее — 16 (80%) и 25 (71,5%), непрерывно-рецидивирующее — 1 (5%) и 4 (11,5%).
Результаты и обсуждение
Нами было выявлено снижение уровня ^ А при ЯК и БК к большинству определяемых антигенов кишечной микробиоты по сравнению с контрольной группой
(табл. 1). Хотя показатель общего ^ А у 91,7% пациентов с Як и 85% с БК находился в пределах нормы.
Известно, что ^ A выполняет функцию изоляции в первой линии обороны, обеспечивает местный иммунитет желудочно-кишечного тракта. Имеющийся дефицит этих антител у пациентов с ВЗК описан и в литературе [10], а также в экспериментах на животных [11]. Таким образом, у пациентов с ВЗК нарушено противодействие к комменсальной микробиоте, создаются условия для колонизации ими кишечника и проникно-
вения через слизистую кишечника растворимых антигенов.
При анализе показателя Ig M у наших пациентов, было выявлено, что уровень Ig M был снижен при ЯК и БК ко всем антигенам изучаемой микробиоты по сравнению с контрольной группой (табл. 2).
Из данной таблицы видно, что при обострении ЯК и БК были снижены уровни антиэндотоксино-вых Ig M — к гликолипиду Rе — мутанта Salmonella minnesota (при БК — p<0,05) и ЛПС E.coli O14 (p<0,05). Эти антигены входят в состав ЛПС большинства патогенных и условно патогенных грамо-трицательных бактерий, в частности энтеробактерий [12]. В литературе имеются данные о том, что бактериальные эндотоксины, попавшие во внутреннюю среду организма, способны играть определенную роль в патогенезе иммунопатологических состояний при ВЗК [13].
Анализ полученных данных выявил снижение IgM к Bifidobacterium bifidum (p<0,05), были снижены показатели IgM к основным грам-отрицательным представителям кишечной микробиоты — белковым антигенам E.coli М 17 (при БК — p<0,05), P.aeruginosa при БК (p<0,05), P.mirabilis, K.pneumoniae (при БК — p<0,05) и грам-положительным — S. aureus (при БК — p<0,05), Strep. spp. (p<0,05), а также к C^lbicans (при БК — p<0,05). При ЯК отмечается повышение Ig M к P.aeruginosa. При этом уровень общего Ig M находится в пределах нормы у 100% пациентов с ВЗК. Известно, что этот вид антител появляется раньше всего при контакте с антигеном, нейтрализует крупные чужеродные клетки, активирует систему комплемента [14].
Однозначного объяснения снижения Ig M к ком-менсальной микробиоте при обострении ЯК и БК не существует. Возможно, данное снижение вызвано феноменом «потребления», когда большая часть антител этого класса находится на периферии и поэтому отмечается относительное снижение центральном кровотоке. Также полученный факт может быть связан с тем, что ЯК и БК у данных пациентов протекает хронически и снижается способность В-лимфоцитов, находящихся в постоянной активации, к трансформации в плазматические клетки.
Было показано, что уровни Ig G при ВЗК к большинству определяемых антигенов повышены (табл. 3).
Анализ полученных данных показал, повышение уровня антиэндотоксиновых антител Ig G (гликолипиду Rе — мутанта Salmonella minnesota, ЛПС E.coli O14), Ig G к белковым антигенам E.coli М 17 (при БК — р<0,05), P.aeruginosa (p<0,05), P.mirabilis (при БК — p<0,05), K.pneumoniae, S.aureus, Strep. spp. и C^^cans. При этом уровень общего Ig G находится в пределах нормы у 62,5% больных с ЯК и 77% у больных с БК, повышен у 25% больных с ЯК.
Также отмечалось снижение Ig А, Ig M и Ig G к Bifidobacterium bifidum при ЯК (p<0,05) и Ig M, Ig G при БК (p<0,05). Имеющийся недостаток и самих этих бактерий, обладающих протективными свойствами, уменьшающих признаки воспаления, неоднократно подтвержден и в экспериментальных моделях ВЗК на мышах [15].
Известно, что Ig G появляется спустя какое-то время после контакта с антигеном, образует иммунные комплексы, участвует в активации системы комплемента, стимулирует фагоцитоз.
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) у наших больных были повышены у 78,3% больных с ЯК и 81,8% больных с БК. Что также косвенно указывает на избыточное поступление антигена. ЦИК представляет собой комплекс антигена, антитела и компонента комплемента. Повышение этого показателя характерно для всех аутоиммунных заболеваний.
Нами было выявлено, что при увеличении тяжести БК и ЯК отмечалась тенденция к снижению IgM, при ЯК с увеличением тяжести заболевания достоверно снижались Ig M к ГЛП Rе — мутанта Salmonella minnesota, ЛПС E.coli O14, Bifidobacterium bifidum, белковым антигенам E.coli М 17, P.aeruginosa, C^bcans; повышались Ig G к P.aeruginosa и P.mirabilis; при БК снижались Ig М к ГЛП Re-мутанта Sal. minnesota, ЛПС E.coli O14 и Bifidobacterium bifidum.
Большинство показателей Ig A и Ig M коррелировали с эндоскопической картиной пациентов с ЯК — с увеличением эндоскопической активности увеличиваются Ig A к ГЛП Re-мутанта Sal. minnesota, ЛПС E.coli O14, Bifidobacterium bifidum, P.aeruginosa, P.mirabilis, K.pneumoniae, C^lbicans и уменьшались Ig M к ГЛП Re-мутанта Sal. minnesota, к белковым антигенам E.coli М 17, P.aeruginosa, P.mirabilis, K.pneumoniae, S. aureus и C^lbicans.
Показатели гуморального иммунного ответа имели достоверные корреляции с клиническими проявлениями: при БК с повышением частоты стула понижалась концентрация IgM к ЛПС E.coli O14 и Bifidobacterium bifidum, с усилением абдоминальной боли уменьшались IgG к K.pneumoniae, с увеличением потери веса увеличивались Ig G к S. aureus и Strep. spp., с увеличением вздутия живота увеличивались IgG к ГЛП Re-мутанта Sal. minnesota; при ЯК с увеличением частоты стула уменьшались Ig M к ГЛП Rе — мутанта Salmonella minnesota, ЛПС E.coli O14, с усилением болей в животе уменьшались Ig M к ГЛП Re-мутанта Sal. minnesota, ЛПС E.coli O14, K.pneumoniae, Strep. spp., Ig G к C^lbicans и повышались Ig G к P.mirabilis и Ig A к Bifidobacterium bifidum. С увеличением количества тенезм увеличивались Ig M к P.aeruginosa и Ig A к белковым антигенам E.coli М 17.
При анализе полученных данных выявлена корреляция с длительностью заболевания — с увеличением длительности БК уменьшались Ig G к S. aureu, Strep. spp. и с увеличением длительности ЯК также уменьшались Ig G к S. aureus, Strep. spp. и увеличивались Ig A к белковым антигенам E.coli М 17, K.pneumoniae.
Выводы
1. У большинства больных с язвенным колитом и болезнью Крона в период обострения снижен уровень Ig А, Ig M и повышен Ig G к большинству антигенам кишечной микробиоты по сравнению с контрольной группой.
2. Была выявлена тенденция к снижению Ig M и повышению Ig G у более тяжелых больных при обострении воспалительных заболеваний кишечника.
3. Имелась корреляция всех классов специфических антител с длительность заболевания, эндоскопической картиной и особенностями клинического течения воспалительных заболеваний кишечника.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ткачев А.В., Мкртчян Л.С., Никитина К.Е. и др. Воспалительные заболевания кишечника: на перекрестке проблем // Практическая медицина. Гастроэнтерология. — 2012. — № 3 (12).
2. Sa'ad Y. Salim, Johan D. Soderholm. Importance of disrupted intestinal barrier in inflammatory bowel diseases // Inflammatory Bowel Diseases. — 2011 January. — Vol. 17, Issue 1. — Р. 362-381.
3. Abraham C., Medzhitov R. Interactions Between the Host Innate Immune System and Microbes in Inflammatory Bowel Disease // Gastroenterology. — 2011 May. — Vol. 140, Issue 6. — P. 1729-1737.
4. Wehkamp J., Antoni L., Ostaff M., Stange E.F. The Intestinal Barrier in Implications for Future Therapeutic Intervention // Falk Foundation e.V. — 2013. — P. 36-37.
5. Porras M., Martin M.T., Yang P.C. et al. Correlation between cyclical epithelial barrier dysfunction and bacterial translocation in the relapses of intestinal inflammation // Inflamm Bowel Dis. — 2006 Sep. — Vol. 12, № 9. — Р. 843-52.
6. Осадчая О.И., Боярская А.М. Влияние энтеросорбции на развитие гуморальных реакций иммунитета у больных с неспецифическим язвенным колитом // Газета «Новости медицины и фармации». Медицина сегодня. — 2011. — № 11-12. — С. 371-372.
7. Булатов В.П. Роль системной эндотоксинемии, антиэндотоксино-вого и антибактериального иммунитета в развитии язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у детей / В.П. Булатов, А.А. Камалова, О.Д. Зинкевич, Н.А. Сафина // Педиатрия. — 2011. — Т. 90, № 2. — С. 19-23.
8. Best W.R., Becktel J.M., Singleton J.W. Rederived values of the eight coefficients of the Crohn's disease activity index (CDAI) // Gastroenterology. — 1979. — Vol. 77. — Р. 843-6.
9. Lewis J.D., Chuai Sh., Nessel L. et al. Use of the Non-invasive Components of the Mayo Score to Assess Clinical Response in Ulcerative Colitis // Inflamm Bowel Dis. — 2008 December. — Vol. 14, № 12. —
Р. 1660-1666.
10. Brandtzaeg P., Carlsen H.S., Halstensen T.S. The B-cell system in inflammatory bowel disease // Advances in Experimental Medicine and Biology. — 2006. — Vol. 579. — P. 149-167.
11. Maeda S., Ohno K., Uchida K., Nakashima K. et al. Decreased immunoglobulin A concentrations in feces, duodenum, and peripheral blood mononuclear cells of dogs with inflammatory bowel disease // Journal of Veterinary Internal Medicine. — 2013 January/February. — Vol. 27, Issue 1. — P. 47-55.
12. Аниховская И.А. Выявление групп риска, выбор тактики обследования и оценка эффективности лечения различных заболеваний по показателям антиэндотоксинового иммунитета: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — М., 2001. — 18 с.
13. Champion K., Chiu L., Ferbas J., Pepe M. Endotoxin neutralization as a biomonitor for inflammatory bowel disease // PLoS One. — 2013 Jun 24. — Vol. 8, № 6. — e67736.
14. Хамитов Р.Ф., Латфуллин И.А., Богоявленская О.В и др. Основы лабораторной диагностики. Учебно-методическое пособие для системы послевузовского профессионального образования. — Казань, 2009. — С. 67.
15. Philippe D., Heupel E., Blum-Sperisen S. et al. Treatment with Bifidobacterium bifidum 17 partially protects mice from Th1-driven inflammation in a chemically induced model of colitis // International Journal of Food Microbiology. — Vol. 149, Issue 1. — 2011 September 1. — P. 45-49.
УВАЖАЕМЫЕ АВТОРЫ! Перед тем как отправить статью в редакцию журнала «Практическая медицина», проверьте:
■ Направляете ли Вы отсканированное рекомендательное письмо учреждения, заверенное ответственным лицом (проректор, зав. кафедрой, научный руководитель), отсканированный лицензионный договор.
■ Резюме не менее 6-8 строк на русском и английском языках должно отражать, что сделано и полученные результаты, но не актуальность проблемы.
■ Рисунки должны быть черно-белыми, цифры и текст на рисунках не менее 12-го кегля, в таблицах не должны дублироваться данные, приводимые в тексте статьи. Число таблиц не должно превышать пяти, таблицы должны содержать не более 5-6 столбцов.
■ Цитирование литературных источников в статье и оформление списка литературы должно соответствовать требованиям редакции: список литературы составляется в порядке цитирования источников, но не по алфавиту.
Журнал «Практическая медицина» включен Президиумом ВАК в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.
