CC BY
21ИММУННОФЕРМЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА ВЛКРС -ИНФЕКЦИИ
Мальцева Н.А. (mail@sssu.ru) (1), Олийник Е.И.(3), Молчанов В.П.(4),
Баранов В.И (4), Животов А.А. (2)
(1)Южно-Российский государственный университет экономики и сервиса, Шахты,
(2)Станция по борьбе с болезнями животных, Шахты,
(3)Станция по борьбе с болезнями животных, Москва,
(4)Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт, Новочеркасск
Важнейшая проблема лейкозов человека и животных в настоящее время приобрела общебиологическое значение. Лейкоз крупного рогатого скота (ЛКРС) - хроническая инфекционная болезнь, наносящая значительный экономический ущерб животноводству и являющаяся угрозой национального генофонда. Несмотря на проводимые оздоровительные мероприятия, уровень инфицированности стад крупного рогатого скота в Российской Федерации остается достаточно высоким (20-70%), регулярно выявляется 1-3% больных животных с клиническими проявлениями болезни.
Этиологическим агентом заболевания является ретровирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), относящийся к семейству Retroviridae и имеющий большое морфологическое и эволюционное сходство с вирусом Т-клеточного лейкоза человека [2-5, 9].
В ряду мероприятий по искоренению ЛКРС своевременной и точной диагностике принадлежит одно из самых важных мест: больных животных выявляют гематологическим методом с последующим их убоем, инфицированных изолируют по результатам иммунологических тестов.
Широкое применение в практике ветеринарии нашла реакция иммунодиффузии в геле (РИД), как наиболее простая и доступная для сероэпидемиологических исследований, выполняемых в полевых условиях [2, 10]. Эффективность данного теста обусловлена преципитабельностью комплекса антиген-антитело, а также значительным гуморальным ответом инфицированных животных, однако метод имеет ряд недостатков (относительно низкая чувствительность, недостаточная специфичность, значительные временные затраты, требует больших доз антигена).
В последние годы для диагностики ВЛКРС-инфекции разработан и широко используется за рубежом метод иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на применении антивидового конъюгата с использованием ферментов-маркеров [1, 6, 7, 8]. Метод ИФА обладает рядом значительных преимуществ: более высокая, чем в РИД, чувствительность и специфичность, возможность автоматизации процесса и сокращения времени анализа. Кроме того, с помощью ИФА можно обнаружить антитела к ВЛКРС в моче и молоке [6]. Однако в нашей стране для практических целей ИФА не применяется.
Целью настоящей работы является изучение диагностической ценности метода ИФА в сравнении с РИД.
Материалы и методы. Постановку РИД проводили в модификации Miller J.M. [10] при использовании стандартного диагностического набора Курской биофабрики. ИФА-определение проводили в соответствии с методическими рекомендациями ВИЭВ [1] : источником вируса в работе служила перевиваемая линия клеток почки эмбриона овцы (FLK), хронически инфицированная ВЛКРС. Антиген ВЛКРС получали с помощью высокоскоростного центрифугирования осветленной культуральной жидкости (5 000 об/мин 30 мин.) в течение 2 часов при 27 000 об/мин в роторе Ti-35 центрифуги L5-65 «Beckman» (США) на сахарозной подушке (15%). Осадок повторно центрифугировали через раствор сахарозы при тех же условиях в роторе SW-27.1, а затем в линейном градиенте концентрации сахарозы при 24 000 об/мин при 40С в роторе SW-27.1 16 часов. Фракции с максимальной активностью объединяли и центрифугировали при
27 000 об/мин 2 часа в роторе Ti-35. Осадок ресуспендировали в ЗФР и инактивировали добавлением глутаральдегида. Конъюгат готовили следующим образом: из сыворотки крови кролика против иммуноглобулинов крупного рогатого скота выделяли иммуноглобулиновую фракцию, для чего к сыворотке добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония в ЗФР, центрифугировали 20 мин. при 8000 об/мин. Осадок дважды промывали 50% раствором NH4SO4 на ЗФР и диализовали против 0,01М натрийкарбонатного буфера, рН 9,5; 4 мг пероксидазы растворяли в 1 мл дистиллированной воды, добавляли 0,2 мл 0,1М перйодата натрия, перемешивали 20 мин., RT. Раствор диализовали 12 час против 0,0001М натрийацетатного буфера рН 4,4 при 40С. Затем добавляли 100 мл 0,2М натрийкарбонатного буфера (рН 9,5) и 8 мг антивидового иммуноглобулина кролика, рН должен быть выше 9. После 2-часовой выдержки при комнатной температуре добавляли 0,1 мл NaBH4 и оставляли на 2 часа при 40С. Конъюгат осаждали равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония, растворяли в 1 мл ЗФР и диализовали 12 часов против ЗФР.
Титр антигена определяли по конкурентной схеме: в ряд лунок сенсибилизированной пластины вносили по 100 мкл слабоположительной сыворотки (1:10) в ЗФРТ. Затем в этих лунках готовили серийные разведения антигена от 1/20, в последнюю контрольную лунку антиген не добавляли. Пластину инкубировали 30 мин. при 370С, промывали, вносили конъюгат и проводили ИФ-определение. При этом в лунках, соответствующих высоким концентрациям антигена, наблюдалось уменьшение регистрируемого сигнала относительно контроля. В этом случае титром антигена считается то разведение, при котором оптическая плотность содержимого соответствующей лунки не менее, чем в 2 раза меньше, чем сигнал в контрольных лунках, где отсутствует конкурирующей за связывание с антителами антиген. Иммуноферментное определение антител к ВЛКРС в сыворотках крови проводили следующим образом: для сенсибилизации пластин в лунки вносили по 100 мкл раствора антигена в концентрации 10 мкг/мл, инкубировали 16
часов при 40С, затем содержимое лунок удаляли и лунки трижды промывали 0,1% раствором Твин-20 в ЗФР. Тестируемые образцы сывороток, а также положительную, отрицательную и слабоположительную контрольные сыворотки разводили в 100 раз в ЗФРТ. Для определения рабочего разведения конъюгата кроличьих антибычьих антител с пероксидазой хрена проводили сравнительное титрование конъюгата на пластинах, сенсибилизированных параллельно вирусным антигеном и бычьими иммуноглобулинами. Затем проводили титрование конъюгата в разведении от 1 к 100 (или 1:250, 1:500 и выше). Рабочим разведением конъюгата считается такое разведение, при котором при отсутствии сигнала при том же разведении на пластинах с антигеном сигнал на пластине с сывороткой составляет примерно 1 оптическую единицу.
Для проведения анализа в лунки сенсибилизированных пластин вносили по 1 00 мкл образцов тестируемых сывороток и контрольных сывороток. Пластины инкубировали 30 мин. при 370С. После удаления содержимого лунки промывали 3 раза ЗФРТ (200 мкл в течение 2-3 мин.). Добавляли по 100 мкл рабочего раствора конъюгата в лунки пластины и инкубировали 30 мин. при 370С. После удаления содержимого лунки промывали 3 раза ЗФРТ, как это описано выше. Затем добавляли 100 мкл хромогенного субстрата для пероксидазы и инкубировали 30 мин. при комнатной температуре. Результаты ИФ-анализа фиксировали визуально или на 8-ми канальном фотометре при длине волны 405 нм. Результаты учитывали с помощью спектрофотометра (при длине волны 405 нм) или визуально. В первом случае сыворотки следует считать положительными, если оптическая плотность в соответствующих лунках превышает значение А-+1/2/А+-А-/, где А- -оптическая плотность для отрицательного контроля, а А+ -оптическая плотность для слабоположительной сыворотки. В случае визуальной оценки положительным следует считать сыворотку, если в соответствующей лунке окраска ближе по интенсивности к окраске лунок, отвечающих слабоположительной сыворотке, чем к лункам отрицательных контролей.
Опыты по изучению диагностической ценности ИФА-анализа проводили с пробами сывороток крови коров из хозяйств Ростовской области.
Результаты проведенных исследований приведены в таблице 1 . Таблица 1. Результаты иммунологических тестов при ВЛКРС-инфекции.
Всего сследовано проб Положит. в РИД Положит. в ИФА
Кол-во % Кол-во %
3704 1917 51 2296 62
В результате проведенных исследований 3704 проб сывороток крови коров дойного стада из хозяйств Ростовской области обнаружено позитивно реагирующих в РИД -1917, что составляет 51% и при использовании ИФА -2296 проб, что составляет 62%. Как следует из приведенных данных, при
использовании ИФА выявляется большее количество инфицированных животных, следовательно ИФА является более чувствительным методом, чем РИД. Представляется возможным рассмотреть вопрос о внедрении метода диагностики ИФА в практику ветеринарии.
Литература
1 . Методические рекомендации по определению антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа. -ВИЭВ, 1983.
2. Гулюкин М.И., Дун Е.А., Замараева Н.В. и др. -Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. -2000. -№3. -с. 60-62.
3. Еремин В.Ф. -Разработка способа получения антигена из ВЛКРС для выявления антител у инфицированных животных в РИД: канд. дисс. -М., 1986.
4. Орлянкин Б.Г., Гулюкин М.И. и др. -Ветеринария, -2000. -№5. -с. 17-19.
5. Парфанович М.И. и др. -Ветеринария, 1974, №4., с. 47-49.
6. Carli K.T., Bantmar H. at al. -Res. In Vet. Science. -1993. -V.55. -P. 394395.
7. Lehetbauer W. -Labor. Rax. Med. -1982. -№2. -P.40-42.
8. Meyer. U., et al. -Arch. exp. Vet. -1983. -V.37. -№5. -P.661-666.
9. Miller J.M., Miller L.D., Olson C. -J. Nat. Cancer Inst. -1969. -V.43. -P. 1297-1305.
10. Miller J.M., Olson C. -J. Watl. Cancer Inst. -1972. -V.49, n.5. -P. 14591461.
