ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИДОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ, НАСЕЛЯЮЩИХ ПОБЕРЕЖЬЕ АЛЖИРА Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 579.68

Хаффарессас Ясин, аспирант-микробиолог Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород, Россия e-mail: [email protected]

Haffaressas Yacine, aspirant microbiologist Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod, Russia e-mail: [email protected]

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИДОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ, НАСЕЛЯЮЩИХ ПОБЕРЕЖЬЕ АЛЖИРА

(Identification of Cyanobacteria species that populate the Algerian coasts)

Цианобактерии, чьи предковые представители являются источником фотосинтеза кислорода, являются основными участниками эволюции и экологии живых сообществ и играют важную роль в кислородном цикле. Частота и интенсивность цветения цианобактерий увеличилась в последние десятилетия. Это увеличение в основном объясняется воздействием антропогенного влияния, которое привело к усилению эвтрофикации водоемов и созданию благоприятной водной среды для циа-нобактерий и, в меньшей степени, последствиями изменения климата, способствующими развитию цианобактерий. Четыре основных рода потенциально токсин-продуцирующих цианобактерий образуют цветение в водоемах: Planktothrix, Microcystis, Anabaena и Aphanizomenon. Эти роды имеют свои собственные экологические характеристики и не встречаются в однотипной среде и / или в одно и то же время года.

Ключевые слова: Цианобактерии, Цветение, Токсины, Морские водные среды.

Введение. Цианобактерии или цианопрока-риоты или сине-зеленые водоросли - это фотосин-тезирующие прокариоты, которые по классификации относят к царству эубактерий, а также уже давно их относят к царству растений, поскольку они обладают такими характеристиками: -бактерии: нет ядра и органеллы; -водоросли: наличие хлорофилла и фикоби-липротеинов (принадлежность пигментов) и способность к фотосинтезу.

Представлены как в морских водных средах, так и средах с пресной водой.

В районах, подверженных сильной эвтрофи-кации (обогащение питательными веществами из окружающей среды), они способны быстро размножаться и формировать цветение. Кроме того, некоторые виды синтезируют токсины, ответственные за интоксикацию человека и животных, иногда со смертельным исходом. Цианобактерии присутствуют на всех континентах и изучаются такими дисциплинами, как экология, токсикология, таксономия или микробиология.

Цианобактерии размножаются бесполым путем, т.е вегетативным делением.

Cyanobacteria, whose ancestral representatives are at the origin of oxygen photosynthesis, are major players in the evolution and ecology of living communities and play a major role in the oxygen cycle. The frequency and intensity of cyanobacterial efflorescence has increased in recent decades. This increase is mainly attributed to the impact of anthropogenic pressures that led to the increasing eutrophica-tion of water bodies and the creation of favorable cy-anobacterial aquatic environments and to a lesser extent, the effects of climate change favoring the development of cyanobacteria. Four main genera of potentially toxin-producing cyanobacteria form efflorescence in mid-water bodies: Planktothrix, Micro-cystis, Anabaena and Aphanizomenon. These genera have ecological characteristics of their own and are not found in the same type of environment and / or at the same time of the year.

Keywords: Cyanobacteria, Efflorescence, Toxins, Marine Aquatic Environments.

Есть пять порядков разделения: на двадцать семь семей, которые включают сто шестьдесят шесть родов цианобактерий: Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales, Stigonematales.

В Африке эти организмы и их токсины стали предметом нескольких исследований.

Цианобактерии представлены морфологическим разнообразием и функциональной уникальностью в среде водных фотосинтезирующих организмов, которое дает им конкурентное преимущество перед остальными сообществами фитопланктона.

Морфологическая организация этих организмов очень разнообразна: одиночные одноклеточные или колония, многоклеточные нитевидные с оболочкой (так называемые нити) или без (называемые трихомами), с дифференцированием или без дифференцирования клеток.

Эти организмы имеют три различных типа клеток [1]:

-Вегетативные клетки различных форм: круглые, овальные, прямоугольные, квадратные; с

однородным клеточным содержимым или нет; с вакуолями с газом или без.

-Гетероцисты, клетки специализируются на фиксации атмосферного азота, встречаются только у представителей порядка Stigonematales и Nostocales.

-Акинеты, устойчивые клетки, так как имеют толстую стенку и содержат резервы,позволяющие данным порядкам (Nostocales и Stigonematales) выживать в неблагоприятных условиях окружающей среды.

Рис. 1: Колониальный одноклеточные цианобактерии из рода ЛУогошсЫша

Рис. 2: Цианобактерии, организованные в виде трихом, род АрИапкошепоп

Рис. 3: Цианобактерии, организованные в виде нити, род Р1гогт'кГшт

Функциональная организация

Цианобактерии лишены ядерной оболочки, митохондрий, эндоплазматической сети и жгутика.

& карбоксисомы; CPG: гранула цианофицина; Т: тилакоиды Р: Гранулы полифосфата N нуклеоплазма; G: Гранулы гликогена; PB: фикобилисома; GV: везикул с газом.

(А) с двойной Тилакоидной мембраной

(Б) Клеточная оболочка c внешней мембраной, слоем пептидогликани и плазматической мембраной.

Рис. 4: трихома цианобактерий (род АпаЬаепа)

Рис. 5. Схематическое изображение функциональной организации

вегетативной клетки цианобактерий [2].

Пигменты.

Реализация кислородного фотосинтеза включает в себя набор фотосинтезирующих пигментов. Термин "пигмент" соответствует тому, что эти молекулы окрашиваются из-за их способности улавливать солнечное излучение. Цианобактерии синтезируют несколько типов пигментов, таких, как хлорофилл и фикобилипротеины или аксессуаров пигментов, таких, как фикоцианин, фико-эритрин и аллофикоцианин. Этот состав пигментов специфичен для цианобактерий и позволяют им использовать солнечную радиацию в большей степени по сравнению с другими водорослями.

Цианобактерии обычно различаются по морфологическим признакам (Размер клетки, наличие оболочки, цвет). Тем не менее, эти функции могут меняться в зависимости от условий окружающей среды, которые могут затруднить идентификацию отдельных видов. В таком случае помочь может наличие или отсутствие гетероци-сты (рис. 4), клетки, позволяющей фиксировать атмосферный азот и, придающей цианобактерии способность расти в обедненных азотных средах.

Может наблюдаться другой тип клеток -Акинеты.

Цианобактерии также имеют газовые вакуоли, которые позволяют им корректировать свои позиции в толще воды, регулируя их флотирование.

ЦЕЛИ. Цель диссертации: с использованием методов молекулярной биологии идентифицировать различные виды цианобактерий, населяющих побережье Алжира.

Задачи

1. Анализ литературы по изучаемой пробле-

ме.

2. Сбор материала для исследований.

3. Идентификация типов цианобактерий по анатомическим и морфологическим критериям.

4.Определение количества каждого типа цианобактерий в морской воде.

5. Анализ химического состава морской воды на участках сбора проб цианобактерий.

6. Физико-химический анализ образцов морской воды.

7. Анализ содержания токсинов цианобактерий в бактериальных микросистемах.

8. Молекулярно-генетический анализ выделенных образцов цианобактерий.

9. Создание модели прогнозирования зависимости изобилия и биомассы цианобактерий от условий окружающей среды.

Сбор материала для исследования

Сбор цианобактерий:

Сбор токсичных водорослей выполняется с использованием сети для планктона с размером ячейки 20 мкм, имеющий сборник. Эта операция заключается в фильтраации 50 литров поверхностной воды с использованием сети для планктона, а затем опорожнение сборника (100 мл), содержащего все микроорганизмы диаметром более 20 мкм.

Содержание сборника или коллектора выливают в непрозрачный (затененный) флакон, содержащий 5 мл раствора 13% формальдегида. Это позволяет, во-первых, фиксировать структуры, содержащиеся в фильтрате и, во-вторых, избежать какой-либо бактериальной активности. Затем на флаконе отмечается место и дата сбора.

Идентификация типов цианобактерий

Идентификация типов собранных цианобак-терий осуществляется с помощью оптического микроскопа по анатомическим, морфологическим признакам, представляющим собой идентификационные ключи, описанные ВоштеПу Р. [3].

При этом используются следующие критерии: структура микроводорослей (клеточная или

нитчатая), форма (колонии или трихомы), размер и цвет, наличие или отсутствие желатиновой оболочки, акинет, гетероцист, вакуолей газа.

Подсчет определенных цианобактерий:

Подсчет цианобактерий осуществляется после наблюдения в оптический микроскоп (увеличение 10х 40 и 100), удельный объем (0,1 мл) гомогенного образца. Этапы идентификации и подсчета цианобактерий осуществляется соответственно DaPaz и др. [4]: (1) по горизонтальному пути по всей длине ламели; (2) четкий сдвиг высоты ламели примерно на одно поле зрения микроскопа (во избежание дублирования). Эта операция повторяется восемь раз.

Четыре основных типа потенциально -токсичных цианобактерий способных к цветению: Planktothrix, Microcystis, Anabaena и Aphanizomenon [5]. При этом виды Anabaena и Aphanizomenon обычно развиваются в начале лета, и часто заменяются Microcystis в конце сезона. Внутри рода Planktothrix часто встречаются два вида Planktothrix agardhii и Planktothrix rubescens.

Обилие питательных веществ (фосфора и, во вторую очередь, азота) и стабильности водной толщи - факторы, благоприятствующие пролиферации цианобактерий в основном в летний и ранне-осенний период [6].

В работе Souissi M^ др. [7], проходящей в период с июня 2001 года по июнь 2002 года (Озе-роУбейра (Oubeira) находящееся на севере Алжира), по наблюдениям описываются морфо-анатомические признаки микроводорослей, по которым в собранном материале удалось выявить наличие 11 типов цианобактерий, из которых 9 признаны потенциально токсичными *: Anabaena*, Microcystis*, Oscillatoria*,

Pseudanabaena*, Merismopedia, Aphanizomenon*, Gomphosphaeria*, Cylindrospermum*,

Synechocystis*, Lyngbya * и Phormidium.

По итогам исследования выявилось преобладание плотности рода Anabaena. Но наиболее высокая частота возникновения принадлежит роду Microcystis.

Таблица. - Типы потенциально-токсичных цианобактерий, наблюдаемые во Франции и связан-

Типы потенциально-токсичных цианобактерий Токсины

Anabaena

Aphanizomenon

Coelosphaerium

Lyngbya Anatoxines

Microcystis Cylindrospermopsines

Nostoc Debromoaplysiatoxine

Oscillatoria Lyngbyatoxine

Phormidium Microcystines

Planktothrix Microviridines

Pseudanabaena Saxitoxines

Rhaphidiopsis

Synechococcus

Woronichinia

Rhaphidiopsis

Anabaenopsis

Cylindrospermopsis

Анализ химического состава морской воды на участках сбора проб цианобактерий

Фосфор и азот необходимы для пролиферации цианобактерий. Это предельные питательные вещества, то есть рост цианобактерий ограничивается наличием фосфора и/или азота. Таким образом, рассматривается соотношение между общим азотом (TN) и общим фосфором (TP). Низкое соотношение TN:TP (от 5 до 29), как правило, способствует развитию цианобактерий [8].

Действительно, цианобактерия имеет большее сродство к фосфору, чем другие водоросли. Кроме того, они способны его накапливать. Что касается азота, цианобактерии могут фиксировать атмосферный азот в своих гетероцистах.

Физико-химический анализ образцов морской воды

Физические параметры:

Эти показатели - инструменты экосистемных изменений, которые могут быть связаны с изменением биомассы водорослей и цианобактерий.

Прозрачность

Пролиферация цианобактерий может снизить прозрачности воды, что является предупреждающим сигналом, в частности, цветения цианобакте-рий.

Прозрачность толщи воды измеряется с помощью устройства, называемого "диск Секки", который делится на белые и черные области, которые погружают в воду. Прозрачность вычисляется по глубине, на которой более невозможно различить белые и черные области диска. Мы можем говорить о вариации прозрачности, если наблюдается разница в 20 до 30 см между двумя измерениями. Этот метод не нормируется, даже при широком использовании его в лимнологии.

Мутность

Метод определения такого показателя как мутность основан на измерении света, отраженного от частиц, взвешенных в толще воды, и его значение обычно увеличивается в зависимости от числа этих частиц, oни могут быть органическими или неорганическими, и состоящими из микроорганизмов, в том числе фитопланктона. Измерение мутности осуществляется с помощью стандартных методик в соответствии с NF ISO 7027 и выражается в NFU (Nephelometric Formazine Unit) из-за сильного поглощения света фитопланктоном результирующий сигнал может быть мал по сравнению с эквивалентной плотностью инертных твердых частиц. Увеличение мутности воды в присутствии цианобактерий может быть ограничено.

Свет

Возможность иметь доступ и использовать имеющийся свет является определяющим фактором в жизнедеятельности цианобактерий. В зависимости от природы света, доступного для фотосинтеза, цианобактерии способны модифицироваться, на уровне транскрипции, экспрессии генов, участвующих в синтезе фикобилисом и определении качественного состава последних [9]. Engelman (1902) описал дополнительный меха-

низм хроматической адаптации. Boresch (1919, 1921) показал, что это изменение цвета соответствовало изменению в соотношении клеток между фикоцианина и фикоэритрина.

Температура

Большинство цианобактерий, способных к цветению, проявляет наибольший рост при температуре 20-25 °С [10]. Тем не менее, оптимальная температура может значительно варьироваться в зависимости от рассматриваемого типа цианобак-терий. Таким образом, термофильные виды Synechococcus демонстрируют повышение темпов роста до 35-45 °С [11] и даже способнык к размножению при температурах выше 70°C. Виды, которые могут образовывать цветение в районах с умеренным климатом, различают Oscillatoriale тип Planktothrix agardhii или Planktothrix rubescens, виды, способные представить цветение при низких температурах (<10°С), Nostocale (Aphanizomenon flosaquae,Anabaena flos-aquae, Anabaena spiroides) и Chroococcale ( Microcystis spp), требуют более высоких температур (оптимум около 20-25°С) и таким образом формируют события массивных изменений в летний период и в начале осени.

Химические параметры:

Химические параметры связаны, в основном, с метаболизмом фитопланктона, и теми изменениями, которые наблюдаются днем, когда преобладает фотосинтез, и ночью, когда доминирующим является дыхание. На практике ночные измерения могут быть выполнены по утрам, так как период фотосинтеза осуществляется между 12 ч и 18 ч. Эти параметры указывают на наличие пролиферации, но они не являются достаточно чувствительными для определения начала динамики распространения.

Кислород

Кислород производится фотосинтезирующи-ми организмами и является хорошим показателем метаболической активности и количества биомассы.

В течение дня он производится в количествах, достаточных для употребления его для дыхания в течение ночи микроорганизмами, растениями и животными, обитающими в воде.

Таким образом, амплитуда циркадных изменения концентрации кислорода может дать четкую картину наличия и значения пролиферации. Измеренная переменная, либо концентрация кислорода выражается в мг. л-1, проценте насыщения кислородом. Растворимость кислорода, в основном, зависит от температуры воды, и должна быть измерена на месте с помощью оксиметра вручную или непрерывно. Значительные ежедневные колебания являются свидетельством увеличения биомассы и, как следствия, увеличения продукции фитопланктона.

pH

В слабо минерализованной воде рH может находиться в пределах от 1 до иногда более 2 еди-

ниц в день, в связи с фотосинтезом и дыханием биомассы.

Информативным показателем наличия пролиферации является амплитуда его циркадных изменений. Она зависит от фотосинтетической активности, буферной способности воды и ее естественного pH. Простое правило предполагает, что вариации считаются значительными в малой буферной среде от 0,5 единиц рН при анализе в этой области. Кроме того, можно контролировать больше параметров, которые связаны с сообществами фотосинтезирующих организмов или циа-нобактерий.

Дозировка хлорофиллa «а»

Количество хлорофилла "а" коррелирует с биомассой живых фотосинтезирующих организмов (водорослей и цианобактерий). Как для других параметров, метод выборки играет очень важную роль для интерпретации и анализа ситуации на месте. Существует два унифицированных метода для определения дозировки хлорофилла "а": спек-трофотометрия после экстракции ацетоном до 90 % (Afnor T90-117) и высоко эффективная жидкостная хроматография или HPLC (AfnorT90-116). Спектрофотометрия может быть осуществлена месте при наличии прибора, но анализы по модели HPLC проводятся в лаборатории. Учитывая чувствительность этих методов, их можно использовать для определения цветения цианобактерий на ранних стадиях и отслеживать динамику распространения.

Анализ флуоресценции пигмента

Благодаря различиям, существующим в составе пигмента различных фотосинтезирующих микроорганизмов, можно квалифицировать и подсчитать цианобактерии путем анализа флуоресценции, испускаемой клетками, возбуждаемыми световой стимуляцией. В настоящее время на рынке присутствует два типа погружных зондов на основе этого принципа:

-Первый, размещенный на рынке в 2002 году, помогает различать классы фотосинтезирующих микроорганизмов (chlorophycées, diatomées, cyanobactéries, cryptophycées) путем измерения флуоресценции при эмиссии 680 нм, характерного хлорофилла «а», после возбуждения на определенную длину волны различных типов аксессуаров пигментов [13]. Информация собирается и обрабатывается с помощью программного обеспечения, которое обеспечивает оценку количества (выраженного в ^g/l эквивалента хлорофилла «а») из различных классов фотосинтезирующих микроорганизмов.

-Второй, появившийся на рынке в 2004 году, посвящен исследованиям цианобактерий, поскольку он основан исключительно на определении фикоцианина, который является синим пигментом цианобактерий. Его результаты в ^g/l фикоцианин. В настоящее время, нет опубликованного исследования, которое предоставляет информацию о преимуществах и недостатках этого инструмента. Эти методы, которые до сих пор не валидизированы и проверяются, являются перспективными, поскольку они могут в конечном итоге позволить преодолеть нынешние трудности в мониторинге циа-нобактерий.

Анализ содержания токсинов цианобактерий в бактериальных микросистемах

Цианотоксины классифицируются в соответствии с их токсическими эффектами, наблюдаемыми у высших организмов: гепатотоксины, нейротоксины и дерматоксины.

Гепатотоксины включают в себя три основных семейства токсинов: microcystin, nodularin и cylindrospermopsin.

Микроцистины

Микроцистины являются токсинами, наиболее часто встречающимися в окружающей среде (Sivonen и Jones, 1999). Микроцистины - производные цианобактерий, которые включают в себя разнообразие типов, в том числе главных образующих цветение: Microcystis, Planktothrix, Aphanizomenon, Anabaena [14]. На сегодняшний день были определены более 80 типов микроци-стинов [15]. Наиболее серьезные случаи отравления у человека, описанные на сегодняшний день, происходили при проведении у больных диализа водой, содержащей Микроцистин, что привело к смерти 60 пациентов. Также считается, что микро-цистины вызывают повышенный риск развития рака печени у населения, регулярно потребляющего загрязненную воду [16].

Микроцистин - единственный цианотоксин, для которого ВОЗ было создано токсикологическое опорное значение (1 ^gMC-LR /l). Это значение применяется во многих странах как способ регулирования качества воды или в качестве рекомендации.

Наиболее часто наблюдаемым и наиболее токсичным является гепатотоксин микроцистин-LR [17]. На данный момент ни один из методов идентификации токсинов и дозировка токсинов не нормируется, хотя идентификация и определение микроцистинов в настоящее время на пути к стандартизации ISO

метод

CLHP high performance liquid chromatography Экстракция клеток с помощью 75% жидкого метанола или концентратамикроцистина растворенного на С18

ELISA Микроцистины растворены или выделены из клеток по методу жидкой экстракции

PP2a proteins phosphatase type 2 Микроцистины растворены или выделены из клеток по методу жидкой экстракции

Выделение ДНК, амплификация и секвени-рование

Выщеление ДНК

Выделение rDNA16S осуществляется с помощью Kit Qiagen (Cat. No. 69506) (Приложение 1). Для других штаммов, секретирующих оболочку и слизь извлечение выделение происходит с помощью экстракции фенол-хлороформом и осуществляется в соответствии с протоколом, представленным в Приложении 2.

Амплификация и секвенирование Амплификация ДНК из каждого штамма проходит в три повтора, в конечном объеме 50 мкл на

пробирку, содержащую 2 мкл экстракта ДНК (в

-1

концентрации от 10 до 20 нг мкл ) или 8 мкл культуры, 5 мкл буфера "10X ПЦР-буфер» (Fermentas, Канада), 5 мкл MgCl^ 25 мМ,4 мкл 10

мМ ДНТФ Mix, 2 мкл праймеров 10 пмоль / мкл, 1 мкл Taq полимеразы (Fermentas, Канада) и 23 или 29д1 из MilliQ воды, ПЦР проводят в четыре этапа: этап денатурации при 94°С в течение 5 минут этап из 30 циклов денатурации при 94 ° С в течение 30 сек, лигирования при 57 ° с в течение 30 сек. и удлинения при 72°С в течение 1,5 минут этап удлинения при 72°С в течение 5 мин этап прекращения при 10°С в течение 2 мин. Электрофорез проводят под действием электрического поля 40 мА,180В 30 - 40 минут, для того, чтобы перенести продукты на 1,5% агароз-ный гель, содержащий бромид этидия (BET). Затем гель фотографируют в УФ-свете, чтобы обозначить миграции. Продукты будут очищены и секвенированы компанией Геном Экспресс (Genome Express) (Meylan, Франция,

www.genome-express.com).

Выбор молекулярного маркера и прайме-

ров

Наиболее часто используемым для прокариот маркером является ген рибосомальной 16S. Однако, этот регион является достаточно переменчивым, чтобы достоверно различать многие виды цианобактерий [18].

В литературе описаны первые 700 пар оснований гена 16S, которые соответствуют наиболее переменной части последнего и более информативны, чем другие [19]. Среди праймеров: 27 и 781ab праймер, которые позволяют определять эту область [20]. К тому же, они определяют циа-нобактерии.

Виды цианобактерий могут быть дифференцированы с помощью гипервариабельном молекулярного маркера [20], например, спейсера (не ко-

дирующего области между двумя генами). Поэтому мы решили использовать спейсер (ITS -«Internal Transcribed Spacer'») между рДНК 16S и 23S, называемый также ITS1 16S- 23S.

Так же праймеры могут амплифицировать эти части генома цианобактерии, в том числе те, которые описаны [20]. После проверки на некоторых штаммах, праймеров 23CITS и 16CITS, разработанных Нейланом и др., (1997), оказалось, что они являются наиболее подходящими и с более высоким уровнем амплификации, чем другие.

Выбор изучаемого вида

Многие штаммы принадлежат к трем потенциально токсичным видам, это Cylindrospermopsis и Anabaena (Nostocales) и род Microcystis (Chroococcales).

Вид Cylindrospermopsis был изучен в предыдущей работе [21], в данном исследовании приоритет был отдан двум оставшимся видам. С практической точки зрения, ITS1 16S-23S из Nostocales делятся на два ампликона, в отличие от Chroococcales, что значительно усложняет анализ. Таким образом, мы выбрали для амплификации 16S-23S ITS1 вида Microcystis, для которых доступно большее количество последовательностей в GenBank (137 последовательности против 14 последовательностей для рода Anabaena и ничего для вида Cylindrospermopsis).

Выбор последовательностей, импортированных из GenBank

В GenBank, последовательности рДНК 16S родов и видов, и последовательности ITS1 рода Microcystis, найденных для филогенетического анализа.

Создание модели прогнозирования зависимости изобилия и биомассы цианобактерий от условий окружающей среды

Одной из главных ролей экологии как науки является ознакомление общества с экологическими проблемами. Поэтому экология должна стремиться производить средства для описания, понимания и предвидения будущего развития нашей среды (Peters, 1991).

Это происходит в основном за счет создания моделей, обобщающих знания, полученные в различных исследованиях, связанных с функционированием биотических сообществ (физиологии, биогеохимии, географии и т.д.), и с целью помочь предсказать их эволюцию. Эти модели, путем их строительства и проверки, могут, в свою очередь, позволить взглянуть по-новому на подходы к пониманию изученных явлений (рис. 6).

Рис. 6. Этапы производства модели (Этапы 1-5) (Guisan и Zimmermann, 2000)

Заключение

Целью данной работы является предоставление данных о различных видах цианобактерий, населяющих побережье Алжира, с различными морфологическими и трофическими характеристиками с использованием современных методов идентификации молекулярной биологии.

Алжир не застрахован от риска для здоровья населения, связанного с наличием токсичных цианобактерий. Однако многое еще пред-

стоит сделать, с точки зрения общественной информации и проведения эпидемиологических обследований государственных и частных служб здравоохранения. Детерминизм производства токсинов должен быть проверен на большом количестве сайтов, если кто-то хочет иметь возможность проверить их. Также было бы желательно создать модель, которая предназначена для прогнозирования их развития и понимания изучаемого явления, а также для предотвращения любого риска массовой интоксикации.

Литература

1. Komärek J. Phenotype diversity of the cyanopro-

karyotic genus Cylindrospermopsis (Nosto-cales)/ Komarek J. [et al.] // Review Czech Phycol. -2002. - Vol.3. - P.1-30.

2. Stanier R.Y. Phototrophic prokaryotes: the cya-

nobacteria / Stanier R.Y. [et al.] //A. Rev. Microbiol. -1977. -Vol.31. - P.225-274.

3. Bourrelly P. Les algues d'eau douce/ Bourrelly P.

//N. Boubée & Cie Paris. - 1985. - Vol.3. -P.606.

4. Da Paz M.Phytoplancton des zones mytilicoles de

la baie de Vilaine et Intoxication par les coquillages/ Da Paz M. [et al.] //Rev. Trav. Inst. Pêches marit. -1983. -Vol.3. -P. 233266.

5. Chorus I. Toxic Cyanobacteria in Water/ Chorus

I. [et al.] // E & F Spon. -1999.

6. Rapport de l'Afsset et de l'Afssa. Evaluation des

risques liés à la présence de cyanobactéries et de leurs toxines dans les eaux destinées à l'alimentation, à la baignade et autres activités récréatives/ Maisons-Alfort. -2006.

7. SOUISSI M. Les Cyanobactéries d'un plan d'eau

douce (Le Lac OUBEIRA- EL KALA). Inventaire et Répartition Spatiale/ SOUISSI M. [et al.] //Revue Sciences & Technologie C, Université des Frères Mentouri Constantine. -2004. -N°22. -P.38-42.

8. Huisman J. Population dynamics of harmful cya-

nobacteria/ Huisman J. [et al.] //Springer, Dordrecht. -2005. -P. 143-176.

9. Kehoe M.D. Responding to color: The regulation

of complementary chromatic adaptation/ Ke-hoe M.D. [et al.] //Annu. Rev. Plant Biol. -2006. -Tom 57. -P. 127-150.

10. Reynolds C. Ecology of Phytoplankton/Reynolds

C.//Cambridge University Press. -2006.

11. Kratz W. A. Nutrition and growth of several

bluegreen algae/ Kratz W. A. [et al.] // Amer. J. Bot. - 1955. - Vol.42. - P.282-287.

12. Beutler M. Fluorometric depth-profiling of chlo-

rophyll corrected for yellow substances. In: Arzul G (ed) Aquaculture environment and

marine phytoplankton/ Beutler M. [et al.]// IFREMER Brest. -2002. -P. 231-238

13. Beutler M. A. Fluorometric method for the differ-

entation of algal populations in vivo and in situ/ Beutler M. [et al.]// Photosynth. Res. -2002. -Vol. 72.-P.39-53.

14. Briand, J.F. Health hazards for terrestrial verte-

brates from toxic cyanobacteria in surface water ecosystems/ Briand, J.F. [et al.] //Vet. Res. -Vol.34. -P361-377.

15. Sivonen K. Bioactive compounds produced by

cyanobacteria. In: The Cyanobacteria: Molecular Biology, Genomics and Evolution/ Sivonen K. [et al.] // (eds A. Herrero & E. Flores) Caister Academic Press, Norfolk. -2008. - P. 159-197.

16. Svircev Z. Leptospirosis distribution related to

freshwater habitats inthe Vojvodina region (Republic of Serbia)/ Svircev Z . [et al.] // Sci. China Ser. -2009. - Vol.10. -P.965-971.

17. Chorus I. Toxic cyanobacteriain water: a guide to

their public health consequences,monitoring

and management/ Chorus I. [et al.] // E & FN Spon London. -1999.

18. Hoffmann L. Nomenclature of Cyano-

phyta/Cyanobacteria: round table on the unification of the nomenclature under the Botanical and Bacteriological Codes/ Hoffmann L. [et al.] // Algol. Stud. -2005. -Vol. 117. -P.13-29.

19. Gugger M. Polyphyly of true branching cyano-

bacteria (Stigonematales)/ Gugger M. [et al.] // Int. J. Syst.Evol. Microbiol. -2004. -Vol.54. -P.349-357.

20. Neilan B.A. rRNA sequences and evolutionary

relationships among toxic and nontoxic cyanobacteria of the genus Microcystis/ Neilan B.A. [et al.] // Int J Syst Bacteriol. -1997. -Vol. 47. -P.693-697.

21. Gugger M. Genetic diversity of Cylindrosper-

mopsis strains (Cyanobacteria) isolated from four continents / Gugger M. [et al.] //Appl. Env. Microbiol. - 2005. - Vol.71. - P. 10971100.

Приложение 1:

Extraction protocol kit QuiaGen (Cat No. 69506):

According to the Gram-negative bacterial DNA purification protocol (which includes cyanobacteria):

- take 2 mL of culture and place in a 15 mL falcon

- centrifuge for 10 min at 4000 rpm, remove the supernatant

- make 2 rinse cycles with milliQ water add 180 ^L of ATL buffer, then vortex

According to the animal tissue DNA purification protocol:

- make 2/3 cycles of freezing / thawing, (10min at -20 ° C / 5min at 55 ° C)

- add 20 ^L of proteinase K, then vortex

- Incubate at 55 ° C for 3h, vortex every 30 min

- vortex for 15s

- add 200 ^L of buffer AL, then vortex

- Incubate for 10 min at 70 ° C, then vortex

- add 200 ^L of 100% ethanol, then vortex

- centrifuge for 3 minutes at 4000 rpm

- pipette the volume into the DNeasy spin column (2 mL)

- centrifuge at 8000 rpm for 1 min

- put the column in a new 2 mL tube

- add 500 ^L of AW1 buffer

- centrifuge at 8000 rpm for 1 min

- put the column in a new 2 mL tube

- add 500 ^L of AW2 buffer

-centrifuge at 14000 rpm to dry the membrane for 3 min

- centrifuge at 14000 rpm for 3 min in a new tube

- put the column in a new tube with plug

- add 100 ^L of AE buffer

- Incubate for 1 min at room temperature

- centrifuge at 8000 rpm for 1 min

- add 50 ^L of AE buffer in the same tube

- Incubate for 1 min at room temperature

- centrifuge at 8000 rpm for 1 min

- make a measurement of optical density (XADN = 260) before the PCR.

- conservation of the extract at -20 ° C

Приложение 2 :

Phenol-chloroform extraction protocol (according to U. Dorigo, INRA Thonon les Bains):

- take 2 ml of culture in an eppendorf tube

- centrifuge at 4 ° C at 4000 rpm for 10 min (instead of filtration)

- remove the supernatant and then wash twice with milliQ water

- add 750 ^L of lysis buffer

centrifuge at 4 ° C at 4000 rpm for 10 minutes

- freeze at -80 ° C for 15 min

- defrost at 55 ° C for 2 minutes

- sonicate in an ultrasonic bath for 2 min, then vortex

- centrifuge 30s at maximum speed

- add 47 ^L of lysosyme and incubate at 37 ° C for 45 minutes

- centrifuge 30s at max speed

- add 75 ^L of SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) then 10 ^L of proteinase K

- Incubate at 55 ° C for 1h30, vortex every 30 min

- freeze at -80 ° C for 5 min

- defrost at 55 ° C for 2 minutes

- sonicate in an ultrasonic bath for 2 min, then vortex, repeat 3 times

- add 10 ^L of proteinase K

- Incubate at 55 ° C for 1h, vortex from time to time

- centrifuge 30s at max speed

- centrifuge at 4 ° C at 12000 rpm for 5 min

- recover the supernatant in a new eppendorf tube, record the volume harvested

purify with an equal volume of phenol-chloroform-isoamyl alcohol, centrifuge at 4 ° C. at 12000 rpm for 5 min, then

recover the upper phase, which contains the DNA, in a new eppendorf tube

repeat the previous step until there are no more proteins at the interface of the two phases.

- remove the excess phenol-chloroform-isoamyl alcohol by adding an equal volume of chloroform-alcohol-isoamyl, centrifuge at 4 ° C at 12000 rpm for 5 min, then recover the upper phase in a new eppendorf tube

- add 10% of the sodium acetate volume

- add 200% of the volume of absolute ethanol to cold, observe a white precipitate, then mix by tube inversion

- keep at -80 ° C for 2 hours

centrifuge at 4 ° C at 12000 rpm for 30 min, then remove the supernatant

- wash the pellet with 300 ^L of ethanol 80%

centrifuge at 4 ° C at 12000 rpm for 10 min, then remove the supernatant

- to dry the pellet, centrifuge at speed vac for 25 min

- add 50 ^L of TE (EDTA tris)

solubilize the DNA at 37 ° C for 1 h and then overnight in the refrigerator

- make a measurement of optical density (XADN = 260) before the PCR. -conservation of the sample at -20 ° C

Поступила в редакцию: 14.06.2019 г.

Хаффарессас Ясин, aспирант-микробиолог, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород, Россия, e-mail: [email protected]

Haffaressas Yacine, aspirant microbiologist, Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod, Russia, e-mail: [email protected]