CC BY
96
УДК 574.5+615.917
Т.Б. Калинникова, М.Х. Гайнутдинов, Р.Р. Шагидуллин
Институт проблем экологии и недропользования АН РТ, tbkalinnikova@gmail. com
МЕТОДЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ТОКСИНОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ
ЦИАНОБАКТЕРИЯМИ (ОБЗОР)
Цианобактерии продуцируют широкий спектр цианотоксинов с различными механизмами токсического действия. В период «цветения» цианобактерии представляют потенциальную опасность для организма человека при возможном их попадании в питьевую воду и реальную опасность для организмов водоплавающих птиц, рыб и зоопланктона. В настоящее время не вызывает сомнений необходимость разработки методов биотестирования как для мониторинга известных цианотоксинов, так и для выявления неидентифицированных в настоящее время ци-анотоксинов. В работе представлен обзор современных исследований, посвященных разработке методов биотестирования нескольких групп цианотоксинов (гепатотоксины, нейротоксины и цитотоксины) с использованием организмов мышей, рыб, беспозвоночных животных, растений, микроорганизмов, ферментов и культур клеток.
Ключевые слова: цианобактерии; цианотоксины; методы биотестирования.
Цианобактерии - это фотосинтезирующие бактерии, которые обитают в водоемах и широко распространены во всем мире. В благоприятных условиях цианобактерии быстро размножаются и вызывают так называемое «цветение» воды. Многие вторичные метаболиты цианобактерий являются токсинами, представляющими опасность для здоровья человека и животных. Цианоток-сины обычно подразделяют на группы, которые отражают их токсическое действие на системы и органы человека (Codd et а1., 2005). Каждый из цианотоксинов может продуцироваться более чем одним видом цианобактерий, и некоторые виды способны продуцировать не один, а несколько токсинов. В настоящей статье приведен обзор методов биотестирования цианотоксинов с использованием различных многоклеточных и одноклеточных организмов.
Основные группы токсинов, продуцируемых цианобактериями
Токсины, продуцируемые цианобактериями, представляют потенциальную опасность для организма человека (табл.).
Гепатотоксины в основном представлены ми-кроцистинами и ежегодно обнаруживаются в водоемах по всему миру. Другая группа гепато-токсинов, нодулярины, впервые была выявлена в бассейне Балтийского моря (МегйиоШ et а1., 2017). В настоящее время в научной литературе имеется информация о том, что нодулярины были обнаружены в водных экосистемах Турции (Ма-zur-Marzec et а1., 2013; Sahindokuyucu Kocasari et а1., 2015). Более того, продуцент нодуляринов Nodularia spumigena была обнаружена не только
в соленой, но и в пресной воде (Akcaalan et al., 2009). Еще одну группу гепатотоксинов, цилин-дроспермопсины, ранее выявляли только в водоемах субтропической и тропической зоны. Однако в последнее время их обнаруживают в водоемах во многих европейских странах. Это может быть связано как с изменением климата, так и с инвазией видов-продуцентов этих токсинов в водоемы Европы.
К нейротоксинам относятся анатоксин-а, го-моанатоксин-а, анатоксин-а^) и некоторые другие. Анатоксин-а и гомоанатоксин-а были обнаружены в водоемах большинства европейских стран (Англия, Ирландия, Франция, Нидерланды, Германия, Италия, Дания, Португалия, Польша) (Meriluoto et al., 2017). Эти токсины в основном продуцируются цианобактериями Anabaena sp., Dolichospermum sp. и Aphanizomenon sp. Менее токсичный нейротоксин, дигидроанатоксин-а, был выделен из штаммов Oscillatoria sp., Phor-midium sp. и Cylindrospermum stagnale (Méjean et al., 2014). Ингибитор ацетилхолинэстеразы анатоксин-а^) в Европе встречается реже. В настоящее время он обнаружен в Дании (Henriksen et al., 1997) и Шотландии (Devic et al., 2002). Сакситок-сины были обнаружены во Франции, Финляндии и Испании в водоемах, в которых присутствовали Aphanizomenon spp. (Cirés et al., 2014; Ledreux et al., 2010; Rapala et al., 2005).
Цилиндроспермопсин, обладающий геноток-сичным и цитотоксичным действием, до недавнего времени обнаруживали только в регионах с теплым климатом: Австралии (Ohtani et al., 1992; Saker, Neilan, 2001), Новой Зеландии (Stirling,
Таблица. Влияние токсинов, продуцируемых цианобактериями, на здоровье человека (EPA, 2014)
Цианотоксины Количество известных вариантов и аналогов Основной орган -мишень действия Воздействие на здоровье Цианобактерии, продуцирующие токсин
Микроцистин-LR 80-90 Печень Боли в животе Рвота и диарея Воспаление печени и геморрагия Острая пневмония Острый дерматоз Поражение почек Стимулирование образования опухолей Microcystis Anabaena Planktothrix Anabaenopsis Aphanizomenon
Цилиндроспермопсин 3 Печень Cylindrospermopsis Aphanizomenon Anabaena Lyngbya Rhaphidiopsis Umezakia
Анатоксин-а 2-6 Нервная система Чувство покалывания, жжения, онемения, сонливость Нарушения речи Обильное слюнотечение Остановка дыхания, вызывающая летальный исход Anabaena Planktothrix Aphanizomenon Cylindrospermopsis Oscillatoria
Quilliam, 2001), Таиланде (Li et al., 2001) и других тропических и субтропических областях (Rzyms-ki, Poniedzialek, 2014). Впервые цилиндроспер-мопсин был выделен из цианобактерии Cylindros-permopsis raciborskii во время эпидемии гепато-энтерита в одном из штатов Австралии (Meriluoto et al., 2017). В настоящее время цилиндроспер-мопсин выявлен и в других регионах. В частности, в Европе он был обнаружен в двух мелководных озерах в восточной части Бранденбурга (Fastner et al., 2003), в Венгрии (Kiss et al., 2002), Италии, Испании (Manti et al., 2005; Quesada et al., 2006), Финляндии, Франции, Чехии и Польше (Blahova et al., 2009; Brient et al., 2009; Kokocinski et al., 2009; Spoof et al., 2006). Известно более 12 видов-продуцентов этого цианотоксина (de la Cruz et al., 2013), среди которых цианобактерии рода Aphanizomenon, Anabaena, Chrysosporum и Oscil-latoria (Bernard et al., 2017; Kokocinski et al., 2013; Rzymski, Poniedzialek, 2014). Парадоксально, но в Европе распространен штамм Cylindrospermopsis raciborskii, продуцирующий нодулярины, но не цилиндроспермопсин (Meriluoto et al., 2017). Например, в Сербии была отмечена массовая гибель рыб в водоеме с высокой численностью Cylin-drospermopsis raciborskii, хотя ни микроцистины, ни сакситоксины, ни цилиндромпермопсины в воде выявлены не были. При этом Cylindrosper-mopsis raciborskii сам по себе оказывал летальное действие на Artemia salina (Svirtcev et al., 2016). Помимо цилиндроспермопсина в водоемах обнаруживаются 7-дезокси-цидиндроспермопсин,
7-эпи-цилиндроспермопсин, 7-дезокси-десуль-фо-цилиндроспермопсин и 7-дезокси-десуль-фо-12-ацетил-цилиндроспермопсин (Cirés, Ballot, 2016; de la Cruz et al., 2013; Rzymski, Poniedzialek, 2014; Wimmer et al., 204), токсическое действие которых требует изучения.
Помимо трех рассмотренных групп циано-токсинов (гепатотоксины, нейротоксины и ци-тотоксины) в водных экосистемах присутствует большое количество неидентифицированных экзометаболитов цианобактерий (Elersek et al., 2017). Ситуация осложняется появлением во многих водоемах инвазивных видов цианобактерий, качественный состав экзометаболитов которых может меняться в зависимости от особенностей акваэкосистемы. Ранее уже упоминался вид Cy-lindrospermopsis raciborskii, продуцирующий ци-линдроспермопсин в теплом австралийском климате и нодулярины в умеренном климате Европы, где он является видом-вселенцем (Meriluoto et al., 2017). Среди других инвазивных видов цианобактерий в водоемах Европы можно назвать Chrysosporum bergii, Chrysosporum ovalisporum и Shaero-spermopsis aphanizomenoides (Kastovsky et al., 2010; Koreivienè, Kasperovicenè, 2011; Quesada et al., 2006). Дальнейшее распространение этих видов и увеличение их численности усилит токсикологическую нагрузку на европейские водоемы.
Для идентификации цианобактерий в большинстве лабораторий традиционно используется световая микроскопия. Этот метод дает возможность определять цианобактерии до вида, но не
позволяет отличить токсикогенные штаммы от нетоксикогенных. В последнем случае необходимо использовать методы молекулярной биологии (Humbert, 2017). Для анализа наличия цианоток-синов в воде чаще всего используют методы инструментального анализа, такие как газовая хроматография, жидкостная хроматография и жидкостная хроматография в сочетании с масс-спек-трометрией.
Однако в последние годы стало очевидным, что для идентификации токсикантов, продуцируемых цианобактериями, по-прежнему необходимо использовать методы биотестирования. В 1980-е годы для получения информации об опасности цианотоксинов для человека и животных проводили эксперименты с лабораторными мышами. Эти исследования позволили выявить биологически активные вещества, потенциально опасные для здоровья человека. В настоящее время разрабатываются новые методы для биотестирования цианотоксинов с использованием микроорганизмов, беспозвоночных животных и культур клеток. Эти методы позволят выявить новые биологически активные вещества, продуцируемые цианобактериями, включая опасные для здоровья человека и животных, и охарактеризовать спектр их токсического действия.
Очевидно, что реальные масштабы опасности цианобактерий и их метаболитов для здоровья человека до конца не познаны. Например, эксперименты in vitro выявили стимуляцию эстрогенной активности млекопитающих экссудатами циано-бактерий (Sychrova et al., 2012). Показано, что стимуляция воспалительного ответа микроцисти-ном-LR не является следствием долговременного ингибирования протеинфосфатаз микроцистина-ми (Adamovsky et al., 2015).
Использование организмов мышей и рыб для биотестирования цианотоксинов
Организмы лабораторных мышей являются основными моделями в современной токсикологии из-за их большого сходства с организмом человека. Поэтому лабораторные мыши изначально были использованы и продолжают использоваться для выяснения потенциальной токсичности вторичных метаболитов цианобактерий.
В настоящее время для биотестирования ци-анотоксинов чаще всего используются главным образом самцы белых мышей неинбредной линии Swiss (Agrawal et al., 2012). Токсичность определяется путем внутрибрюшинных инъекций лизата клеток цианобактерий (Terao et al., 1994). Через 24 часа животных забивают и проводят гистологическое исследование печени: отмечают наличие дегенерации и вакуолизации паренхимы,
наличие очагов гиперемии и геморрагии (Agrawal et al., 2006; Terao et al., 1994). Перед умерщвлением у животных берут образцы крови для анализа уровня основных печеночных ферментов, таких как аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфа-таза и лактатдегидрогеназа (Agrawal et al., 2006).
Токсичность цианотоксинов для мышей определяется ЛД50, выраженной в миллиграммах на килограмм массы тела. Если ЛД50 не превышает 1000 мг, вещество считается нетоксичным (Bernard et al., 2003). Использование мышей для целей биоиндикации подразумевает наличие комфортных условий для размножения и выращивания достаточного количества животных для экспериментов. Во многих странах проведение подобных исследований рассматривается как нарушение научной этики, и поэтому ограничено. Кроме того, следует иметь в виду, что при наличии в исследуемом образце более чем одного цианотоксина можно определить только общую токсичность. При этом токсин с самым быстрым и сильным действием может маскировать действие остальных токсичных веществ (Gupta et al., 2003).
В то же время организмы мышей для биотестирования наличия цианотоксинов в пресноводных экосистемах используются очень редко, хотя в ряде случаев это использование актуально. Например, известно, что вторичные метаболиты цианобактерий рода Anabaena являются нейротоксинами (Калинникова и др., 2017), нарушающими функции холинергической системы ингибированием ацетилхолинэстеразы (анаток-син-a^)) и гиперактивацией никотиновых рецепторов ацетилхолина (анатоксин-а и гомоанаток-син-а) (Калинникова и др., 2017). Анатоксин-а^) в ряде случаев являлся причиной отравления и гибели свиней, собак, телят и птиц, потреблявших воду из природных водоемов во время цветения цианобактерий (Cook et al., 1989; Onodera et al., 1997; Pushner et al., 2008, 2010). В связи с тем, что анатоксин-а^) чрезвычайно токсичен для мышей при его внутрибрюшинных инъекциях (Sivonen, 2000), очевидно, что внутрибрюшинное введение мышам лизата клеток цианобактерий из природных водоемов в период их цветения может быть использовано для мониторинга опасности анаток-сина-а^) в пресноводных экосистемах. В отличие от анатоксина-а^), токсичность анатоксина-а и гомоанатоксина-а довольно низкая при внутри-брюшинном введении в организм мышей (ЛД50 ~ 300 мкг/кг массы тела) (Fawell, James, 1994) и особенно низкая при пероральном введении (> 5000 мкг/кг массы тела) (Fitzgeorge et al., 1994). В то же время, описан случай отравления 37 собак во Франции питьевой водой, загрязненной циано-
бактерией Phormidium favosum, продуцирующей анатоксин-а (Gugger et al., 2005). Очевидно, что эта цианобактерия и, возможно, другие виды рода Anabaena продуцирует не только анатоксин-а, но и другой цианотоксин. Очевидно, что и в этом случае введение лизатов цианобактерий в организм мышей позволило бы выявить их токсичность.
При использовании мышей для биотестирования цианотоксинов необходимо учитывать, что их токсическое действие на организм в некоторых случаях слабо проявляется в течение 24 часов после внутрибрюшинного введения, но развивается в последующие дни (Ohtani et al., 1992). Такое позднее проявление острой токсичности на организмы мышей характерно для цилиндроспер-мопсина: ЛД50 через 24 часа составляет 2.1 мг/ кг массы тела, но снижается в 10 раз до 0.2 мг/ кг массы тела при продлении наблюдения токсического эффекта до 120-144 часов (Ohtani et al., 1992).
Цианотоксины вызывают сильные изменения в организмах рыб. При этом наблюдаются повреждения печени, нарушения ионного гомеос-таза, изменения поведения и гибель (Bury et al., 1995; Tencalla et al., 1994). Чаще других видов в научной литературе, посвященной проблеме биотестирования цианотоксинов, упоминаются мальки форели, тиляпии и карпа (Beveridge et al., 1993; Bury et al., 1995). При этом рыбы являются менее привлекательными моделями для биоиндикации цианотоксинов, чем мыши. Это в первую очередь связано с методическими трудностями при инъекциях цианотоксинов в организмы рыб. Проведение экспериментов с инкубацией рыб в воде, содержащей экстракты цианобактерий, подразумевает получение больших количеств этих экстрактов. Для поддержания постоянного уровня токсинов в среде инкубации необходима регулярная смена воды в аквариуме с добавлением соответствующего количества исследуемых веществ (Rymuszka, 2012). Определение токсичности при пероральном введении может сопровождаться побочными эффектами за счет разрушения токсинов различными способами (Agrawal et al., 2012).
Использование организмов беспозвоночных для биотестирования цианотоксинов
Для выявления токсинов и других вторичных метаболитов цианобактерий широко используются беспозвоночные животные, в первую очередь организмы зоопланктона (Agrawal et al., 2001; Rohrlack et al., 2003). В составе пресноводного зоопланктона доминируют четыре группы организмов: простейшие, коловратки и два подкласса ракообразных: кладоцеры и копеподы. К
организмам зоопланктона относятся и личинки более крупных животных: кольчатых червей, рыб и ракообразных (Rothhaupt, 1991). Эти организ-мы-фильтраторы питаются клетками цианобакте-рий и испытывают прямое действие цианотокси-нов. Этим и определяется их привлекательность для биотестирования.
Колонии цианобактерий, изолированные клетки, культуры клеток, их экстракты и очищенные вещества оказывают негативное влияние на большинство организмов зоопланктона (Agrawal et al., 2001, 2005a, 2005b; Beattie et al., 2003; DeMott et al., 1991; Ferrao-Filho et al., 2000; Matveev et al., 1994; Mundt et al., 2001; Raymont, 1983; Turell, Middlebrook, 1988; Yasuno, Sugaya, 1991). Во время «цветения» цианобактерий в составе зоопланктона доминируют коловратки и мелкие кладо-церы (Nanidi, Rao, 1998). В литературе имеются данные о том, что наиболее сильное воздействие цианобактерии оказывают на организмы кладо-цер и копепод, и в меньшей степени - на коловраток (Gilbert, 1990; Kirk, Gilbert, 1992). Именно поэтому большинство исследователей предпочитает использовать Daphnia sp. для изучения негативного действия цианобактерий на организм.
В научной литературе имеется большое количество данных о влиянии цианобактерий на рост, размножение, выживание и питание дафний, но эти данные весьма противоречивы (Agrawal, Agrawal, 2011). Хорошо известно, что большинство видов дафний чувствительны не только к ци-анотоксинам в высоких концентрациях (10 мкг/ мл и более) (Mundt et al., 2001), но и к другим токсикантам, например, к ингибиторам протеаз (Agrawal et al., 2001; Blom et al., 2003; Rohrlack et al., 2003, 2004). Это снижает привлекательность использования дафний для определения токсичности скоплений цианобактерий. Однако совместное применение различных экспериментальных критериев, таких как выживание, подавление питания, темпы роста популяции и др., позволяет оценивать токсичность цианобактерий. При этом очень важно перед началом эксперимента разрушить колонии или крупные филаменты цианобактерий, чтобы не нарушать нормального питания дафний и не создавать механических препятствий для них (Agrawal, 2010; Agrawal et al., 2001). К недостаткам использования Daphnia в биотестировании цианотоксичности относится невозможность определять токсины в низких концентрациях и сложности со стандартизацией культивирования дафний в лаборатории (Agrawal et al., 2012).
В последнее время для выявления токсичности цианобактерий используются жаброногие
ракообразные, в частности личинки Artemia salina (Beattie et al., 2003; Kiviranta et al., 1991; Vezie et al., 1996). Используя эти организмы можно определять токсины в концентрации 1-10 мкг/ мл. Личинки Artemia salina чувствительны к ми-кроцистинам и нодуляринам. Однако прежде чем рекомендовать этот организм как универсальный для определения токсичности цианобактерий необходимо провести дополнительные исследования и разработать методы определения других токсинов, в частности ингибиторов протеаз, с помощью Artemia salina.
Другим жаброногим ракообразным, которое используется в биотестировании является Thamnocephalus platyurus, организм которого чувствителен к большинству, если не ко всем, цианотоксинам (Agrawal et al., 2012). Биотесты с Thamnocephalus platyurus дают хорошо воспроизводимые результаты при использовании стандартных промышленных тест-наборов. К сожалению, эти наборы достаточно дорогостоящие и имеют небольшой срок хранения (6 месяцев) (Agrawal et al. 2012). При тестировании с помощью Thamnocephalus platyurus шести близкородственных микроцистинов, включая микроци-стин-LR, не было обнаружено корреляции между их острой токсичностью и ингибированием про-теинфосфатаз. Наибольшая острая токсичность в этих экспериментах была выявлена у микроци-стина-RR, но его активность по ингибированию протеинфосфатаз была намного слабее (Kiviran-ta et al., 1993). Результаты этого исследования показали, что токсичность микроцистинов для Thamnocephalus platyurus определяется не инги-бированием протеинфосфатаз, а другими механизмами.
Для биотестирования токсичности цианобак-терий можно использовать взрослых насекомых и их личинок (Agrawal et al., 2005a; Blom, Jüttner, 2005). Выявлена чувствительность личинок комара Aedes aegyptii к нейротоксинам и гепатоток-синам, содержащимся в цианобактериях. Взрослые особи комара обыкновенного Culex pipiens чувствительны к инъекциям микроцистина-LR (Agrawal et al., 2012). Несмотря на чувствительность обоих видов комаров к цианотоксинам, их использование в биотестировании ограниченно сложностью культивирования в лаборатории (Agrawal et al., 2012). Чувствительность взрослых особей домовой мухи Musca sp., капустной моли Plutella sp. и египетской хлопковой совки Spodoptera sp. к инъекциям как очищенного микроцистина-LR, так и природных образцов сравнима с токсичностью этого вещества для мышей и с токсичностью инсектицидов для насекомых
(Swoboda et al., 1994). Однако сложность содержания этих насекомых в лаборатории и трудности проведения микроинъекций ограничивают их использование в биотестировании (Agrawal et al., 2012).
Микроцистины в образцах цианобактерий токсичны для взрослых особей плодовой мушки Drosophila melanogaster (Delaney, Wilkins, 1995). Методы культивирования дрозофил в лаборатории просты и не требуют специального оборудования. Исследуемые вещества вводятся перораль-но; для этого их наносят на фильтровальную бумагу, смоченную раствором сахарозы, и помещают в пробирки с мухами, которые предварительно голодали 24 часа (Agrawal et al., 2012). Использование дрозофил в биотестировании цианоток-синов ограничивается их нечувствительностью к нейротоксичным экстрактам Aphanizomenon sp. (Delaney, Wilkins, 1995).
Для выявления сакситоксинов в цианобакте-риях и моллюсках можно использовать пустынную саранчу Schistocerca gregaria. Саранчу легко культивировать в лаборатории. Исследуемые вещества можно вводить в виде инъекций объемом 10 мкл. Результат тестирования проявляется в течение 90 минут в виде паралича насекомых (McElhiney et al., 1998). ЛД50 для очищенного сак-ситоксина составляет 8 мкг/г массы тела саранчи. К сожалению, саранча оказалась нечувствительной к микроцистину-LR и анатоксину-а. Относительная токсичность исследованных сакситок-синов значительно отличалась от выявленной в экспериментах с млекопитающими. Тем не менее, саранча остается привлекательным модельным организмом для мониторинга сакситоксинов и других паралитических ядов (Cook et al., 2006).
Использование микроорганизмов для биотестирования цианотоксинов
Использование микроорганизмов в качестве биотестеров в токсикологических исследованиях позволяет в короткие промежутки времени определять низкие концентрации веществ. В случае с определением токсичности цианобактерий использование микроорганизмов не всегда удобно. Показана токсичность водных и метанольных экстрактов из цианобактерий для аденовируса, вируса герпеса 1 типа и некоторых штаммов вируса гриппа (Ostensvik et al., 1998). Метанольные экстракты Nodularia spumigena HÜ 280 и Synecho-cystis aquatilis 428 оказывают слабое токсическое действие на вирус герпеса 1 типа. Водные экстракты Calothrix gracilis 96 и Oscillatoria sp. подавляют размножение вируса гриппа A в культуре клеток почки собаки MDCK. Все перечисленные эксперименты были выполнены с неочищенными
экстрактами бактерий. При этом не было выявлено корреляции между антивирусной активностью и содержанием токсинов. В других исследованиях было показано, что цианобактерии подавляют активность вируса иммунодефицита человека HIV 1. Эта биологическая активность определяется наличием в цианобактериях серосодержащих гликолипидов (Loya et al., 1998) и не связана с микроцистинами или другими токсическими метаболитами. Таким образом, в настоящее время вирусы не могут служить надежными биоиндикаторами для определения цианотоксинов.
Использование бактерий для выявления циано-токсинов ограничивается определением токсичности экстрактов из цианобактерий, но не чистых токсинов, таких как микроцистин-LR. Показана высокая чувствительность Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus и Bacillus subtilis к водным и ме-танольным экстрактам из пяти видов цианобакте-рий (Lam et al., 1996). Экстракты н-гексаном из Oscillatoria sp., Nostoc sp., Cylindrospermum majus, Calothrix gracilis, Limnothrix redekei и метаноль-ные экстракты из Anabaena variabilis, Gloeocapsa caldariorum, Pseudoanabaena catenata, Limnothrix redekei подавляют рост Bacillus subtilis SBUG 14. Кроме того, экстракт н-гексаном из Limnothrix redekei активен в отношении Staphylococcus aureus SBUG 11 и Micrococcus flavus SBUG 16 (Ostens-vik et al., 1998). При этом не отмечено корреляции между токсичностью экстракта в отношении бактерий и содержанием в нем цианотоксинов. Несмотря на это, возможность использования бактерий в биотестировании цианотоксинов заслуживает дополнительного исследования. С другой стороны, имеются данные о том, что природные популяции гетеротрофных бактерий устойчивы к действию токсинов (Christoffersen, 1996; Mundt et al., 2001), и в некоторых случаях наблюдается положительное действие цианобактерий на рост бактерий (Christoffersen, 1996; Jones, Orr, 1994b). Кроме того, показано возможное участие бактерий рода Pseudomonas в деградации биомассы ци-анобактерий (Jones et al., 1994a).
Для определения токсинов широко используется биолюминесцентный метод Микротокс, основанный на уменьшении свечения Photobacteri-um phosphoreum. Предполагалось, что он позволит определять микроцистины в биомассе циано-бактерий (Lawton et al., 1990). При применении этого метода оказалось, что тест-организмы реагируют на неизвестные компоненты экстрактов из цианобактерий, не содержащих микроцистины (Veize et al., 1996). При использовании трех штаммов грамотрицательных бактерий методом пламенной фотометрии было показано, что сакситок-
сины снижают внутриклеточное содержание K+ и Na+ (Pomati et al., 2003). Еще один метод биотестирования с использованием микроорганизмов основан на ингибировании токсинами синтеза пигмента продигиозина бактериями Serratia mar-cescens. Он выявил слабую корреляцию между концентрацией цианотоксинов и снижением синтеза пигмента (Dierstein et al., 1989). Таким образом, лишь некоторые штаммы микроорганизмов могут быть использованы в биотестировании для определения токсичности популяций цианобакте-рий.
Использование растений в биотестировании цианотоксинов
Вторичные метаболиты цианобактерий, включая микроцистины, обладают альгицидным и гербицидным действием (Agrawal et al., 2012). В научной литературе имеется очень небольшое количество работ, посвященных разработке простого, недорогого и чувствительного метода выявления цианотоксинов в питьевой воде с использованием растений. Так, было выявлено значительное уменьшение длины корней и листьев и уменьшение веса проростков кресс-салата Lep-idium sativum после шестидневной экспозиции к микроцистину-LR в концентрации 10 мкг/л по сравнению с контрольными экспериментами. У опытных растений была повышена активность глутатион-8-трансферазы и глутатионперокси-дазы (Gehringer et al., 2003). Токсичность ми-кроцистинов, кроме микроцистина-LR, а также биологическая активность других цианотоксинов в экспериментах с кресс-салатом не изучалась. Поэтому возможность использования Lepidium sativum для биотестирования цианотоксинов требует дополнительного изучения.
Показано подавление прорастания пыльцы табака Nicotiana tabacum цилиндроспермопси-ном в концентрациях 5-1000 мкг/мл (Metcalf et al., 2004). Этот феномен может быть использован при разработке теста для биотестирования ци-линдроспермопсина, хотя для исследования природных образцов потребуется предварительная концентрация проб.
Использование культур клеток в биотестировании цианотоксинов
Биотестирование цианотоксинов с использованием культур клеток млекопитающих является удобной заменой экспериментам с животными. Хорошо известно, что микроцистины вызывают острые поражения печени. Поэтому на первом этапе использовались гепатоциты крыс сразу после их изоляции из организмов животных (Henze, 1996). Токсичность оценивалась по содержанию ключевого печеночного фермента лактатдегидро-
геназы. Чаще всего изолированные гепатоциты инкубируют с очищенным токсином или экстрактом цианобактерий в течение определенного времени с последующим определением выживаемости клеток в тесте с (3,4,5-диметилтиазол-2 ил)-2,5-дифенилтетразолий бромидом (Aune, Berg, 1986). С использованием этого подхода впервые было проведено сравнительное исследование токсичности разных микроцистинов и показано, что наиболее токсичным является ми-кроцистин-LR, а токсичность микроцистина-RR в сто раз меньше (Gupta et al., 2003). Позднее для оценки гепатотоксичности пресноводных циано-бактерий стали использовать культивируемые кусочки печени (Bhattacharya et al., 1996). Этот метод, как и предыдущий, основан на определении уровня лактатдегидрогеназы в клетках, но более прост в исполнении.
Помимо гепатоцитов для биотестирования цианотоксинов могут использоваться и другие клетки. Еще в 1981 году было высказано предположение, что агглютинация эритроцитов может служить индикатором уровня микроцистинов (Carmichael, Bent, 1981). К сожалению, эта гипотеза не была подтверждена экспериментально. Результаты экспериментов с культурой фиброб-ластов хомяка V79 оказались сходными с результатами экспериментов на мышах (Lawton et al., 1994). Позднее было показано, что микроцистин обладает не только гепатотоксичным, но и им-муномодулирующим действием. Микроцистин повышает частоту апоптоза лейкоцитов, полученных от здоровых волонтеров. В лейкоцитах же, полученных от больных с заболеваниями почек, микроцистин-LR снижал продукцию реактивных форм кислорода. Авторы исследования предлагают использовать лейкоциты как биоиндикатор в мониторинге микроцистинов (Codd et al., 1989).
Влияние экстрактов из природной колонии цианобактерий и изолированной культуры Microcystis aeruginosa на активность сукцинатдегидро-геназы было исследовано в экспериментах с двумя культурами клеток рыб. Это культура PLHC-1, полученная из карциномы печени Poeciliopsis lucida и культура RTG-2 фибробластподобных клеток, выделенных из гонад радужной форели Oncorhynchus mykiss. Значения EC50 в этих экспериментах оказались сходными для обоих экстрактов. В обеих клеточных культурах наблюдались повышенная секреция везикул, закругление клеток, уменьшение размера клеток и их количества, вакуольная дистрофия клеток, жировое перерождение клеток и апоптоз. При этом культура PLHC-1 оказалась более чувствительной к токсическому действию экстракта из природной попу-
ляции цианобактерий (Pichardo et al., 2006).
Для биотестирования нейротоксинов с использованием культур клеток необходима разработка специальных методик и подбор соответствующих клеточных линий. В частности, для биотестирования сакситоксинов предлагается использовать культуру клеток нейробластомы (Gallacher, Birkbeck, 1992; Jellet et al, 1992).
Резюмируя результаты, представленные в этом разделе, следует отметить, что необходимы дальнейшие экспериментальные исследования как для разработки методов биотестирования, так и для выбора культур клеток, которые можно использовать для выявления всех известных в настоящее время цианотоксинов.
Использование ферментов для биотестирования цианотоксинов
Известно, что микроцистины и нодуляри-ны являются ингибиторами протеинфосфатазы 1 и протеинфосфатазы 2A (Lambert et al., 1994). Поэтому ингибирование протеинфосфатаз может использоваться в качестве чувствительного метода для скрининга микроцистинов и нодуля-ринов. Первоначально для выявления цианоток-синов проводили эксперименты, в которых количественно определяли высвобождение фосфата из субстрата, меченного 32P (Holmes, 1991). Этот метод позволял определять микроцистины и но-дулярины в количестве менее одного нанограмма. Метод успешно использовался для количественного определения микроцистинов в природной воде и в питьевой воде до и после ее очистки (Holmes, 1991). Несмотря на высокую чувствительность, этот метод не нашел широкого применения из-за необходимости использования радиоактивного субстрата, что в свою очередь требует наличия специальной лаборатории и оборудования. J. An и W.W. Carmichael (An, Carmichael, 1994) предложили определять ингибирование протеинфосфатаз колориметрическим методом без использования изотопов. Использование метода ингибирования протеинфосфатаз оказалось весьма полезным при определении токсичности микроцистинов в образцах природной воды. Этот метод был рекомендован для широкого использования при повседневном скрининге проб воды (Ward et al., 1997). Однако следует иметь в виду, что при использовании метода ингибирования протеинфосфатаз не всегда могут быть получены достоверные результаты, как позитивные, так и негативные. Поэтому необходимо провести дополнительную экспертную оценку этого метода прежде, чем он будет рекомендован для широкого применения. Не следует забывать и о том, что с помощью этого метода можно выявлять только
микроцистины и нодулярины.
Ингибирование ацетилхолинэстеразы может использоваться для биотестировании нейроток-синов (Сагш^ае1, 1992). Это очень чувствительный метод. В настоящее время он является единственной альтернативой использованию мышей при биотестировании анатоксинов. К сожалению, этот метод не является селективным, поскольку выявляет и другие токсиканты в природных образцах, такие как фосфорорганические пестициды (Сагш^ае1, 1997).
Иммуноферментный анализ цианотокси-нов
Иммуноферментный анализ в настоящее время является наиболее перспективным для быстрого определения микроцистинов и нодуляри-нов в пробах, благодаря высокой чувствительности, специфичности и простоте проведения. С использованием метода иммуноферментного анализа может быть проанализировано большое количество образцов за короткий промежуток времени. Метод основан на связывании монокло-нальных и поликлональных антител с токсинами. В настоящее время имеются антитела, позволяющие определять микроцистины-ЬЯ, -ЯЯ, -УЯ, -LF, -LW и нодулярин в концентрации менее 100 нг/л и сакситоксины в концентрации от 10 нг/л (А§^а1, 2012).
Заключение
«Цветение» цианобактерий, продуцирующих цианотоксины, выявлено в водоемах и водотоках 65 стран мира (Codd et а1., 2005), включающих в себя Россию, Беларусь и Украину (Белых и др., 2013; Никитин и др., 2012). Повсеместное распространение токсичных цианобактерий и их потенциальная, а в ряде случаев реальная опасность для организмов человека, беспозвоночных, рыб и птиц, обитающих в пресноводных водоемах, объясняют большое внимание к цианотоксинам, сохраняющееся уже три десятилетия.
Мониторинг содержания цианотоксинов в пресноводных экосистемах чрезвычайно сложен по нескольким причинам. Во-первых, цианоток-сины представляют собой большую группу химических веществ с разной структурой и качественно различными механизмами токсического действия. Только для микроцистинов идентифицировано около 80 вариантов. Во-вторых, известно, что один вид цианобактерий может продуцировать не один, а два или более видов цианоток-синов. При этом спектр продуцируемых одним видом бактерий цианотоксинов может изменяться в зависимости от среды его обитания. Кроме того, в природной воде цианотоксины находятся
как в свободной, так и в связанной клетками ци-анобактерий формах. В-третьих, для идентификации цианотоксинов в основном используются эксперименты с грызунами, и возможно наличие неизвестных в настоящее время цианотоксинов, малотоксичных для грызунов, но токсичных для организмов пресноводных беспозвоночных или рыб. В-четвертых, «цветение» цианобактерий зависит от сезонных изменений температуры и поступления в воду биогенных элементов (азота и фосфора).
В настоящее время вопрос об опасности того или иного цианотоксина поднимается в различных странах в связи с обнаружением цианоток-синов в питьевой воде (Калинникова и др., 2017; Meriluoto et al., 2017). Потенциальная опасность цианотоксинов из питьевой воды для организма человека связана не только и не столько с «цветением» цианобактерий в водоемах, используемых в качестве источников питьевой воды, сколько с эффективностью очистки воды от цианобактерий и цианотоксинов. В то же время в природе организмы водоплавающих птиц, рыб и зоопланктона в период «цветения» токсичных цианобакте-рий неизбежно длительное время подвергаются действию цианотоксинов. Поэтому для оценки опасности цианобактерий для пресноводных экосистем необходима разработка новых методов биоиндикации цианотоксинов и внедрение этих методов в систему мониторинга состояния пресноводных экосистем.
Список литературы
1. Белых О.И., Гладких А.С., Сороковикова Е.Г., Тихонова И.В., Потапов А.С., Федорова Г.А. Микроцистин-про-дуцирующие цианобактерии в водоемах России, Беларуси и Украины // Химия в интересах устойчивого развития. 2013. Т. 21. С. 363-378.
2. Калинникова Т.Б., Гайнутдинов М.Х., Шагидуллин Р.Р. Цианотоксины - потенциальная опасность для пресноводных экосистем и здоровья человека // Российский журнал прикладной экологии. 2017. № 2. С. 3-19.
3. Никитин О.В., Степанова Н.Ю., Мукминов Н.М. Индикация цианотоксинов в природных водах Республики Татарстан // Уч. зап. КГАВМ. 2012. Т. 212. С. 341-344.
4. Adamovsky O., Moosova Z., Pekarova M., Basu A., Babica P., Sindlerova L.S., Kubala L. Immunomodulatory potency of microcystin, an important water-polluting cyanobacterial toxin // Environ. Sci. Technol. 2015. V. 49. P. 12457-12464.
5. Agrawal M.K. Zooplankton-based bioassay for investigating toxic cyanobacteria // Protocols on algal and cyanobacterial research / Eds. S.N. Bagchi, D. Kleiner and P. Mohanty. New Delhi: Narosa Publishers, 2010. P. 281-288.
6. Agrawal M.K., Bagchi D., Bagchi S.N. Acute inhibition of protease and suppression of growth in zooplankter, Moina macrcopa, by Microcystis blooms collected in Central India // Hydrobiologia. 2001. V. 464. P. 37-44.
7. Agrawal M.R., Bagchi D., Bagchi S.N. Cysteine and serine protease-mediated proteolysis proteolysis in body homogenate of a zooplankter, Moina macrocopa, is inhibited by the toxic
cyanobacterium, Microcystis aeruginosa PCC7806 // Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 2005a. V. 141. P. 33-41.
8. Agrawal M.K., Zitt A., Bagchi D., Weckesser J., Bagchi S.N., Von Elert E. Characterization of proteases in guts of Daphnia magna and their inhibition by Microcystis aeruginosa PCC 7806 // Environ. Toxicol. 2005b. V. 20. P. 314-322.
9. Agrawal M.K., Ghosh S.K., Bagchi D., Weckesser J., Erhard M., Bagchi S.N. Occurrence of microcystin-containing toxic water blooms in Central India // J. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 16. P. 212-218.
10. Agrawal M., Agrawal M.K. Cyanobacteria-herbivore interaction in freshwater ecosystem // J. Microbiol. Biotechnol. Res. 2011.V. 1. P. 52-66.
11. Agrawal M., Yadav S., Patel C., Raipuria N., Agrawal M.K. Bioassay methods to identify the presence of cyanotoxins in drinking water supplies and their removal strategies // Eur. J. Exp. Biol. 2012. V. 2. P. 321-336.
12. Akcaalan R., Mazur-Marzes H., Zalewska A., Albay M. Phenotypic and ecological characterization of toxic Nodularia spumigena from a freshwater lake in Turkey // Harmful Algae. 2009. V. 8. P. 273-278.
13. An J., Carmichael W.W. Use of a colorimetric protein phosphatase inhibition assay and enzyme linked immunosorbent assay for the study of microcystins and nodularins // Toxicon. 1994. V. 32. P. 1495-1507.
14. Aune T., Berg K. Use of freshly prepared rat hepatocytes to study toxicity of blooms of the blue-green algae Microcystis aeruginosa and Oscillatoria agardhii // J. Toxic. Environ. Health. 1986. V. 19. P. 325-336.
15. Beattie K.A., Ressler J., Wiegand C., Krause E., Codd G.A., Pflugmacher S. Comparative effects and metabolism of two microcystins and nodularin in the brine shrimp Artemia salina //Aquat. Toxicol. 2003. V. 62. P. 219-226.
16. Bernard C., Harvey M., Briand J.F., Bire R., Krys S., Fontaine J.J. Toxicological comparison of diverse Cylindrospermopsis raciborskii strains: evidence of liver damage caused by a French C. raciborskii strain // Environ. Toxicol. 2003. V. 18. P. 176-186.
17. Bernard C., Ballot A., Thomazeau S., Maloufi S., Furey A., Mankiewicz-Boczek J., Pawlik-Skowronska B., Capelli C., Salmaso N. Cyanobacteria associated with the production of cyanotoxins // Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis / Eds. J. Meriluoto, L. Spoof and G.A. Codd. John Wiley & Sons, Ltd., 2017. P. 503-527.
18. Beveridge M.C.M., Baird D.J., Rahmatullah S.M.,Lawton, L.A., Beattie K.A., Codd G.A. Grazing rates on toxic and non-toxic strains of cyanobacteria by Hypophthalmichthys molitrix and Oreochromis niloticus // J. Fish Biol. 1993. V. 43. P. 901-907.
19. Bhattacharya R., Rao P.V., Bhaskar A.S., Pant S.C., Dube S.N. Liver slice culture for assessing the hepatotoxicity of freshwater cyanobacteria // Hum. Exp. Toxicol. 1996. V. 15. P. 105-110.
20. BlahovaL., Oravec M., Marsalek B., Sejnohova L., Simek Z., Blaha L. The first occurrence of the cyanobacterial alkaloid toxin cylindrospermopsin in the Czech Republic as determined by immunochemical and LC/MS methods // Toxicon. 2009. V. 53. P. 519-524.
21. Blom J.F., Bister B., Bischoff D., Nicholson G., Jung G., Sussmuth R.D,. Juttner F. Oscillapeptin J, a new grazer toxin of the freshwater cyanobacterium Planktothrix rubescens // J. Nat. Pro. 2003. V. 66. P. 431-434.
22. Blom J.F., Juttner F. High crustacean toxicity of microcystin congeners does not correlate with high protein phosphatase inhibitory activity // Toxicon. 2005. V. 46. P. 465470.
23. Brient L., Lengronne M., Bormans M., Fastner J. First
occurrence of cylindrospeimopsin in freshwater in France // Environ Toxicol. 2009. V. 24. P. 415-420.
24. Bury N.R., Eddy F.B., Codd G.A. The effects of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa, the cyanobacterial toxin microcystin-LR and ammonia on growth rate and ionic regulation of brown trout (Salmo trutta L.) // J. Fish Biol. 1995. V. 46. P. 1042-1054.
25. Carmichael W.W., Bent P.E. Hemagglutination method for detection of freshwater cyanobacteria (blue-green algae) toxins // Appl. Environ. Microbiol. 1981. V. 41. P. 1383-1388.
26. Carmichael W.W. Cyanobacteria secondary metabolites - the cyanotoxins // J. Appl. Bacteriol. 1992. V. 72. P. 445-459.
27. Carmichael W.W. The cyanotoxins // Adv. Bot. Res. 1997. V. 27. P. 211-256.
28. Cirés S., Wormer L., Ballot A., Agha R., Wiedner C., Velazquez D., Casero M.C., Queseda A. Phylogeography of cylindrospermopsin and paralytic shellfish toxin-producing Nostocales cyanobacteria from Mediterranean Europe (Spain) // Appl. Environ. Microbiol. 2014. V. 80. P. 1359-1370.
29. Christoffersen K. Ecological implications of cyanobacterial toxins in aquatic food webs // Phycologia. 1996. V. 35. P. 42-50.
30. Codd G.A., Brooks W.P., Priestley I.M., Poon G.K., Bell S.G. Production, detection and quantification of cyanobacterial toxins // Tox. Assess. 1989. V. 4. P. 499-511.
31. Codd G.A., Azevedo S.M.F.O., Bagchi S.., Burch M.D., Carmichael W.W., Kaya K., Utkilen H.C. CYANONET. A global network for cyanobacterial bloom and toxin risk management. Initial situation assessment and recommendations // INt. Hydrol. Progr VI (Unesco, Paris), Tech. Doc. Hydrol. 2005. № 76. 138 p.
32. Cook W.O., Dahlem A.M., Lovell R.A., Hooser S.B., Mahmood N.A., Carmichael W.W. Consistent inhibition of peripheral cholinesterases by neurotoxins from the freshwater cyanobacterium Anabaena flosaquae: studies of ducks, swine, mice and a steer // Environ. Toxicol. Chem. 1989. V. 10. P. 915922.
33. Cook A.C., Morris S., Reese R.A., Irving S.N. Assessment of fitness for purpose of an insect bioassay using the desert locust (Schistocerca gregaria L.) for the detection of paralytic shellfish toxins in shellfish flesh // Toxicon. 2006. V. 48. P. 662-671.
34. Cyanobacteria and cyanotoxins: Information for drinking water systems // EPA USA. 2014. 11 p.
35. de la Cruz A.A., Hiskia A., Kaloudis T., Chernoff N., Hill D., Antoniou M.G., He X., Loftin K., O'Shea K., Zhao C., Pelaez M., Han C., Lynch T.J., Dionysiou D.D. A review on cylindrospermopsin: the global occurrence, detection, toxicity and degradation of a potent cyanotoxin // Environ. Sci. Process. Impacts. 2013. V. 15. P. 1979-2003.
36. Delaney J.M., Wilkins R.M. Toxicity of microcystin-LR, isolated from Microcystis aeruginosa, against various insect species // Toxicon. 1995. V. 33. P. 771-778.
37. DeMott W.R., Zhang Q.X., Carmichael W.W. Effects of toxic cyanobacteria and purified toxins on the survival and feeding of a copepod and three species of Daphnia // Limnol. Oceanogr. 1991. V. 36. P. 1346-1357.
38. Devic E., Li D., Henriksen P., Codd G.A., Marty J.-L., Fournier D. Detection o anatoxin-a(s) using a biosensor with engineered acetylcholinesterases // Appl. Environ Microbiol. 2002. V. 68. P. 4102-4106.
39. Dierstein R., Kaiser I., Weckesser J. Inhibition of prodigiosin formation in Serratia marcescens by extracts of toxic cyanobacteria // Syst. Appl. Microbiol. 1989. V. 12. P. 244-248.
40. Elersek T., Blaha L., Mazur-Marzec H., Schmidt W., Carmeli S. Other cyanobacterial bioactive substances // In: Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis / Eds. J. Meriluoto, L. Spoof and G.A. Codd. John Wiley & Sons, Ltd., 2017. P. 179-195.
41. Fastner J., Heinze R., Humpage A.R., Mischke U., Eaglesham G/K/, Chorus I. Cylindrospermopsin occurrence in two German lakes and preliminary assessment of the toxicity and toxin production of Cylindrospermopsis raciborskii cyanobacteria isolates // Tixicon. 2003. V. 42. P. 313-321.
42. Fawell J.K., James H.A. Toxins from blue-green algae: Toxicologiczl assessment of anatoxin-a and a method for its determination in reservoir water // FWR Report No. FR0434/ DoE 3728, Foundation of Water Research, Marlow, UK. 1994.
43. Ferrao-Filho A.S., Azevedo S.M.F.O., DeMott W.R. Effects of toxic and non-toxic cyanobacteria on the life history of tropical and temperate cladocerans // Freshwater Biol. 2000. V. 43. P. 1-19.
44. Fitzgeorge R.B., Clark C.A., Keevil C.W. Routes of intoxication // Detection methods for cyanobacterial toxins / Eds. G.A.Codd, T.M.Jefferies, C.W.Keevil, E.Potter. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 1994. P. 69-74.
45. Gallacher S., Birkbeck T.H. A tissue culture assay for the direct detection of sodium channel blocking toxins in bacterial culture supernatants // FEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 92. P. 101-108.
46. Gehringer M.M., Kewada V., Coates N., Downing T.G. The use of Lepidium sativum in a plant bioassay system for the detection of microcystin-LR // Toxicon. 2003. V. 41. P. 871-876.
47. Gilbert J.J. Differential effects of Anabaena affinis on Cladocerans and Rotifers: mechanisms and implications // Ecology. 1990. V. 71. P. 1727-1740.
48. Gupta N., Pant S.C., Vijayaraghavan R., Rao P.V.L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice // Toxicology. 2003. V. 188. P. 285-296.
49. Heinze R. A biotest for hepatotoxins using primary rat hepatocytes // Phycologia. 1996, V. 35. P. 89-93.
50. Henriksen P., Carmichael W.W., An J., Moestrup 0. Detection of anatoxin-a(s)-like anticholinesterase in natural blooms and cultures of cyanobacteria/blue-green algae from Danish lakes and in the stomach contents of poisoned birds // Toxicon. 1997. V. 35. P. 901-913.
51. Holmes C.F.B. Liquid chromatography-linked protein phosphatase bioassay; a highly sensitive marine bioscreen for okadaic acid and related diarrhetic shellfish toxins // Toxicon. 1991. V. 29. P. 469-477.
52. Humbert J.-F. Molecular tools for the detection of toxigenic cyanobacteria in natural ecosystems // Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis / Eds. J. Meriluoto, L. Spoof and G.A. Codd. John Wiley & Sons, Ltd., 2017. P. 280-283.
53. Jellet J.F., Marks L.J., Stewart J.E., Dorey M.L., Watson-Wright W., Lawrence J.F. Paralytic shellfish poison (saxitoxin family) bioassays: automated endpoint determination and standardization of the in vitro tissue culture bioassay and comparison with the standard mouse bioassay // Toxicon. 1992. V. 30. P. 1143-1156.
54. Jones G.J., Bourne D.G., Blakeley R.L., Doelle H. Degradation of the cyanobacterial hepatotoxin microcystin by aquatic bacteria // Nat. Toxins. 1994a. V. 2. P. 228-235.
55. Jones G.J., Orr P.T. Release and degradation of microcystin following algicide treatment of a Microcystis aeruginosa bloom in a recreational lake, as determined by HPLC and protein phosphatase inhibition assay // Water Res. 1994b. V. 28. P. 871-876.
56. Kastovsky J., Hauer T., Mares J., Krautova M., Besta T., Komarek J., Desortova B., Hetesa J., Hindakova A., Houk V., Janecek E., Kopp R., Marvan P., Pumann P., Skacelova O., Zapomelova E. A review of the alien and expansive species of freshwater cyanobacteria and algae in the Czech Republic // Biol. Invasions. 2010. V. 12. P. 3599-3625.
57. Kirk K.L., Gilbert J.J. Variation in herbivore response to chemical defenses: Zooplankton foraging on toxic cyanobacteria // Ecology. 1992. V. 73. P. 2208-2218.
58. Kiss T., Vehovszky A., Hiripi L., Kovacs A., Voros L. Membrane effect of toxins isolated from a Cyanobacterium, Cylindropermopsis raciborskii, on identified molluscan neurons // Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2002. V. 131C. P. 167-176.
59. Kiviranta J., Sivonen K., Niemelä S.I. Detection of toxicity of cyanobacteria by Artemia salina bioassay // Environ. Toxicol. Water Qual. 1991. V. 6. P. 423-436.
60. Kiviranta J., Abdel-Hameed A., Sivonen K., Niemela S.I., Carlberg G. Toxicity of Cyanobacteria to mosquito larvae -screening of active compounds // Environ. Toxicol. Water Qual. 1993. V. 8. P. 63-71.
61. Kokocinski M., Dziga D., Spoof L., Stefaniak K., Jurczak T., Mankiewicz-Boczek J., Meriluoto J. First report of the cyanobacterial toxin cylindrospermopsin in the shallow, eutrophic lakes of western Poland // Chemosphere. 2009. V. 4. P. 669-675.
62. Kokocinski M., Mankiewicz-Boczek J., Jurczak T., Spoof L., Meriluoto J., Rejmonczyk E., Hautala H., Vehniäinen M., Pawelczyk J., Soininen J. Aphanizomenon gracile (Nostocales), a cylindrospermopsin-producing cyanobacterium in Polish lakes // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2013. V. 20. P. 5243-5264.
63. Koreivienè J., Kasperovicene J. Alien cyanobacteria Anabaenabergii var. limnetica Coutè et Preisig from Lithuania: Some aspects of taxonomy, ecology and distribution // Limnologica. 2011. V. 41. P. 325-333.
64. Lam A.K.Y., Prepas E.E., Spink D., Hrudey S.E. Chemical control of hepatotoxic phytoplankton blooms: implications for human health // Water Res. 1995. V. 29. P. 1845-1854.
65. Lambert T.W., Boland M.P., Holmes C.F.B., Hrudey S.E. Quantitation of the microcystin hepatotoxins in water at environmentally relevant concentrations with the protein phosphatase bioassay // Environ. Sci. Technol. 1994. V. 28. P. 753-755.
66. Lawton L.A., Campbell D.L., Beattie K.A., Codd G.A. Use of a rapid bioluminescence assay for detecting cyanobacterial microcystin toxicity // Lett. Appl. Microbiol. 1990. V. 11. P. 205207.
67. Lawton L.A., Beattie K.A., Hawser S.P., Campbell D.L., Codd G.A. Evaluation of assay methods for the determination of cyanobacterial hepatotoxicity // In: Detection methods for cyanobacterial toxins. Special Publication / Eds. G.A. Codd, T.M. Jefferies, C.W. Keevil and E. Potter. Cambridge: Society of Chemistry, 1994. No. 149. P. 111-116.
68. Ledreux A., Thomazeau S., Catherine A., Duval C., Yéprémian C., Marie A., Bernard C. Evidence for saxitoxins production by the cyanobacterium Aphanizomenon gracile in a French recreational water body // Harmful Algae. 2010. V. 10. P. 88-97.
69. Li R., Carmichael W.W., Brittain J.E., Eaglesham G.K., Shaw G.R., Mahakhant A., Noparatnaraporn N., Yongmanitchai W., Kaya K., Watanabe M.M. Isolation and identification of the cyanotoxin cylindrospermopsin and deoxycylindrospermopsin from a Thailand strain of Cylindrospermopsis raciborskii (Cyanobacteria) // Toxicon. 2001. V. 39. P. 973-980
70. Loya S., Reshef V., Mizrachi E., Silberstein C., Rachamim Y., Carmeli S., Hizi A. The inhibition of the reverse transcriptase of HIV-1 by the natural sulfoglycolipids from cyanobacteria: contribution of different moieties to their high potency // J. Nat. Prod. 1998. V. 61. P. 891-895.
71. Manti G., Mattei D., Messineo V., Melchiorre S., Bogialli S., Sechi N., Casiddu P., Luglie' A., Di Brizio M., Bruno M. First report of Cylindrospermopsis raciborskii in Italy // Harmful Algae News. 2005. V. 28. P. 8-9.
72. Matveev V., Matveeva L., Jones G.J. Study of the ability of Daphnia carinata King to control phytoplankton and resist cyanobacterial toxicity-implications for biomanipulation in Australia // Aust. J. Mar. Freshw. Res. 1994. V. 45. P. 889-904.
73. Mazur-Marzec H., Kaczkowska M.J., Blaszczyk A., Akcaalan R., Spoof L., Meriluoto J. Diversity of peptides produced by Nodularia spumigena from various geographical regions // Mar. Drugs 2013. V. 11. P. 1-19.
74. McElhiney J., Lawton L.A., Edwards C., Gallacher S. Development of a bioassay employing the desert locust (Schistocerca gregaria) for the detection of saxitoxin and related compounds in cyanobacteria and shellfish // Toxicon. 1998. V. 36. P. 417-420.
75. Méjean A., Paci G., Gautier V., Ploux O. 2014. Biosynthesis of anatoxin-a and analogues (anatoxins) in cyanobacteria // Toxicon. V. 91. P. 15-22.
76. Meriluoto J., Blaha L., Bojadzija G., Bormans M., Brient L., Codd G.A., Drobac D., Faasen E.J., Fastner J., Hiskia A., Ibeling B.W., Kaloudis T., Kokocinski M., Kurmayer R., Pantelic D., Quesada A., Salmaso N., Tokodi N/. Triantis T.M., Visser P.M., Svircev Z. Toxic cyanobacteria and cyanotoxins in European waters - recent progress achieved through CYANOCOST Action and challenges for further research // Adv. Oceanogr. Limnol. 2017. V. 8. P. 161-178.
77. Metcalf J.S., Barakate A., Codd G.A. Inhibition of plant protein synthesis by the cyanobacterial hepatotoxin, cylindrospermopsin // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 235. P. 125-129.
78. Mundt S., Kreitlow S., Nowotny A., Effmert U. Biochemical and pharmacological investigations of selected cyanobacteria // Int. J. Hyg. Environ. Health. 2001. V. 203. P. 327-334.
79. Nandini S., Rao T.R. Somatic and population growth in selected cladoceran and rotifer species offered the cyanobacterium Microcystis aeruginosa as food // Aqua. Ecol. 1998. V. 31. P. 283-298.
80. Ohtani I., Moore R.E., Runnegar M.T.C. Cylindrospermopsin - A potent hepatotoxin from the blue-green alga Cylindrospermopsis raciborskii // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 7941-7942.
81. Onodera H., Oshima Y., Henriksen P., Yasumoto T. Confirmation of anatoxin-a(s), in the cyanobacterium Anabaena lemmermanii, as the cause of bird kills in Danish lakes // Toxicon. 1997. V. 35. P. 1645-1648.
82. Ostensvik O., Skulberg O.M., Underdal B., Hormazabal V. Antibacterial properties of extracts from selected planktonic freshwater cyanobacteria - a comparative study of bacterial bioassays // J. Appl. Microbiol. 1998. V. 84. P. 1117-1124.
83. Pichardo S., Jos A., Zurita J., Salguero M., Camean A.M., Repetto G. Toxic effects produced by microcystins from a natural cyanobacterial bloom and a Microcystis aeruginosa isolated strain on the fish cell lines RTG-2 and PLHC-1 // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2006. V. 51. P. 86-96.
84. Pomati F., Rosetti C., Calamari D., Neilan B.A. Effects of saxitoxin (STX) and veratridine on bacterial Na+-K+ fluxes: a prokaryote-based STX bioassay // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 7371-7376.
85. Puschner B., Hoff B., Tor E.R. Diagnosis of anatoxin-a poisoning in dogs from North America // J. Vet. Diagn. Invest. 2008. V. 20. P. 89-92.
86. Puschner B., Pratt C., Tor E.R. Treatment and diagnosis of dog with fulminant neurological deterioration due to anatoxin-a intoxication // J. Vet. Emerg. Crit. Care. 2010. V. 20. P. 518-522.
87. Quesada A., Moreno E., Carrasco D., Paniagua T., Wormer L., De Hoyos C., Sukenik A. Toxicity of Aphanizomenon ovalisporum (Cyanobacteria) in Spanish water reservoir // Eur. J. Phycol. 2006. V. 41. P. 39-45.
88. Rapala J., Robertson A., Negri A.P., Berg K.A., Tuomi P., Lyra C., Erkomaa K., Lahti K., Hoppu K., Lepistö L. First report of saxitoxin in Finnish lakes and possible associated effects on human health // Environ. Toxicol. 2005. V. 20. P. 331-40.
89. Raymont J.E.G. Plankton and productivity in the oceans. Oxford: Pergamon Press, 1983. 824 p.
90. Rohrlack, T., Christoffersen K., Hansen P.E., Zhang W., Czarnecki O., Henning M., Fastner J., Erhard M., Neilan B.A., Kaebernick M. Isolation, characterization, and quantitative analysis of microviridin J, a new Microcystis metabolite toxic to Daphnia // J. Chem. Ecol. 2003. V. 29. P. 1757-1770.
91. Rohrlack T., Christoffersen K., Kaebernick M., Neilan
B.A. Cyanobacterial protease inhibitor microviridin J causes a lethal molting disruption in Daphnia pulicaria // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 5047-5050.
92. Rothhaupt K.O. The influence of toxic and filamentous blue-green algae on feeding and population growth of the rotifer Brachionus rubens // Int. Revue ges. Hydrobiol. 1991. V. 76. P. 67-72.
93. Rymuszka A. Cytotoxic avtivity of the neurotoxin anatoxin-a on fish leukocytes in vitro and in vivo studies // Acta. Vet. Brno. 2012. V. 81. P. 175-182.
94. Rzymski P., Poniedzialek B. In search of environmental role of cylindrospermopsin: a review on global distribution and ecology of its producers // Water Res. 2014. V. 66. P. 320-337.
95. Sahindokuyucu Kocasari F., Gulle I., Kocasari S., Pekkaya S., Mor F. The occurrence and levels of cyanotoxin nodularin from Nodularia spumigena in the alkaline and salty Lake Burdur, Turkey // J. Limnol. 2015. V. 74. P. 530-536.
96. Saker M.L., Neilan B.A. Varied diazotrophies, morphologies, and toxicities of genetically similar isolates of Cylindrospermopsis raciborskii (Nostocales, Cyanophyceae) from northern Australia // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 1839-1845.
97. Sivonen K. Freshwater cyanobacterial neurotoxins: ecobiology, chemistry and detection // Seafood and freshwater toxins / Ed. L.M. Botana. NY: Marcell Dekker Inc., 2000. P. 567-582.
98. Spoof L., Berg K.A., Rapala J., Lahti K., Lepistö L., Metcalf J.S., Codd G.A., Meriluoto J. First observation of cylindrospermopsin in Anabaena lapponica isolated from the boreal environment (Finland) // Environ. Toxicol. 2006. V. 21. P. 552-560.
99. Stirling D.J., Quilliam M.A. First report of the cyanobacterial toxin cylindrospermopsin in New Zealand // Toxicon. 2001. V. 39. P. 1219-1222.
100. Svircev Z., Obradovic V., Codd G.A., Marjanovic P., Spoof L., Drobac D., Tokodi N., Petkovic A., Nenin T., Simeunovic J., Vazic T., Meriluoto M. Massive fish mortality and Cylindrospermopsis raciborskii bloom in Aleksandrovac lake // Exotoxicol. 2016. V. 25. P. 1352-1363.
101. Swoboda U.K., Dow C.S., Chaivimol J., Smith N., Pound B.P. Alternatives to the mouse bioassay for cyanobacterial toxicity assessment // In: Detection methods for cyanobacteri-al toxins. Special Publication / Eds. G.A. Codd, T.M. Jefferies,
C.W. Keevil and E. Potter. Cambridge: Society of Chemistry, 1994. №149. P. 106-110.
102. Sychrova E., Stepankova T., Novakova K., Blaha L., Giesy J.P., Hilscherova H. Estrogenic activity in extracts and exudates of cyanobacteria and green algae // Environ. Int. 2012. V. 39. P. 134-140.
103. Tencalla F.G., Dietrich D.R., Schlatter C. Toxicity of Microcystis aeruginosa peptide toxin to yearling rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Aquat. Toxicol. 1994. V. 30. P. 215224.
104. Terao K., Ohmori S., Igarashi K., Ohtani I., Watanabe M.F., Harada K.I., Ito E., Watanabe M. Electron microscopic
studies on experimental poisoning in mice induced by cylindrospermopsin isolated from blue-green alga Umezakia natans // Toxicon. 1994. V. 32. P. 833-843.
105. Turell M.J., Middlebrook J.L. Mosquito inoculation - an alternative bioassay for toxins // Toxicon. 1988. V. 26. P. 1089-1094.
106. Vezie C., Benoufella F., Sivonen K., Bertru G., Laplanche A. Detection of toxicity of cyanobacterial strains using Artemia salina and Microtox assays compared with mouse bioassay results // Phycologia. 1996. V. 35. Suppl. 6. P. 198-202.
107. Ward C.J., Beattie K.A., Lee E.Y.C., Codd G.A. Colorimetric protein phosphatase inhibition assay of laboratory strains and natural blooms of cyanobacteria: comparisons with high performance liquid chromatographic analysis for microcystins // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 153. P. 465-473.
108. Wimmer K.M., Strangman W.K., Wright J.L.C. 7-De-oxydesulfo-cylindrospermopsin and 7-deoxy-desulfo-12-ace-tylcylindrospermopsin: two new cylindrospermopsin analogs isolated from a Thai strain of Cylindrospermopsis raciborskii // Harmful Algae. 2014. V. 37. P. 203-206.
109. Yasuno M., Sugaya Y. Toxicities of Microcystis viridis and the isolated hepatotoxic polypeptides on cladocerans // Verh. Int.Verein.Limnol. 1991. V. 24. P. 2622-2626.
Kalinnikova T.B., Gainutdinov M.Kh., Shagidul-lin R.R. Methods for bioassay of toxins produced by cyanobacteria (review).
Cyanobacteria produce broad spectrum of cya-notoxins with different mechanisms of their action. During their blooming cyanobacteria can be potentially harmful for human organism, if present in drinking water, and really harmful for organisms of swimming birds, fish and zooplankton. At present there are no doubts about the necessity to develop bioassay method both for monitoring of known cy-anotoxins and for detection of unidentified cyano-toxins. This article presents the review of modern researches relating to development of bioassay methods for several groups of cyanotoxins (hepatotox-ins, neurotoxins and cytotoxins) using organisms of mice, fish, invertebrates, microorganisms, enzymes and cell cultures.
Keywords: cyanobacteria; cyanotoxins; bioassay methods.
