Научная статья на тему 'Идентификация видов рода lecccinum, образующих плодовые тела в микроэкосистемах прируслового вала Р. Кременка, методом рестрикционного анализа участков рДНК'

Идентификация видов рода lecccinum, образующих плодовые тела в микроэкосистемах прируслового вала Р. Кременка, методом рестрикционного анализа участков рДНК Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
84
34
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Biological Communications
WOS
Scopus
ВАК
RSCI
Область наук
Ключевые слова
8S-ITS2 И IGS1 РДНК / МИКРОЭКОСИСТЕМЫ ПРИРУСЛОВОГО ВАЛА РЕКИ / LECCINUM / ITS1-5 / 8S-ITS2 AND IGS1 RDNA / MICROECOSYSTEMS OF THE RIVERBED BANK

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Иванов Дмитрий Михайлович

В микроэкосистемах поймы р. Кременка (Ленинградская обл., Гатчинский р-н), отличающихся по эдафическим условиям от окружающих лесных и болотных экосистем, на основе анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции участков ITS15,8S -ITS2 и IGS1 рДНК были идентифицированы следующие виды рода Leccinum : L. schistophilum, L. scabrum, L. versipelle, L. holopus и L. variicolor. Причем L. schistophilum, L. scabrum и L. versipelle приурочены к березе в микроэкосистемах на границе между лугом и топким участком поймы, на аллювиальных кварцевых породах, а L. holopus и L. vari icolor — к ели и ольхе в микроэкосистемах топкой осоковой поймы. В пойме р. Кременка идентифицирован вид L. schistophilum, который ранее был обнаружен в экосистемах антропогенного происхождения — по обочинам дорог, обсыпанных известковым щебнем. Также в растительном сообществе с доминированием ольхи серой был идентифицирован L. vari icolor, обычно приуроченный к окраинам верховых болот. Обнаружены плодовые тела, которые не показали гомологии по размеру амплифицированных фрагментов и фрагментов, образующихся после воздействия рестриктазы, с электрофоретическими спектрами девяти видов, встречающихся в Восточно-Европейской части России. Для их идентификации планируется использовать метод установления родства с известными видами по секвенированным последовательностям.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Иванов Дмитрий Михайлович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Identification of the Leccinum genus species forming fruit bodies in the microecosystems of the riverbed bank of the river Kremenka by the method of rDNA sites restriction analysis

The article focuses on the following species of Leccinum genus: L. schistophilum, L. scabrum, L. versipelle, L. holopus and L. variicolor, that have been revealed in microecosystems of floodland of the river Kremenka (Leningrad region, Gatchinsky area), which are different conditions from surrounding wood and marsh ecosystems in terms of soil. The species were identified by carrying out an analysis of restriction fragments lengths polymorphism of rDNA ITS15,8S -ITS2 and IGS1 sites. L. schistophilum, L. scabrum and L. versipelle are related to birch in microecosystems on the border between a meadow and a fenny site of the floodland, on alluvial quartz breeds, L. holopus and L. variicolor are related to a fur-tree and an alder in microecosystems of fenny sedgy fl oodland. In the floodland of the river Kremenka the L. schistophilum, which was earlier found in ecosystems of an anthropogenous origin — on roadsides of roads embanked by limy rubble, is also identified. In addition, in plant community with domination of grey alder L. variicolor, usually related to suburbs of raised bogs, has been identifi ed. Fruit bodies which have not shown homology on the size of amplified fragments and the fragments formed aft er influence of restriction, with the electrophores spectra of nine species in East-European part of Russia are found out. To identify them, it is planned to use a method to reveal their relationship with known species by sequences.

Текст научной работы на тему «Идентификация видов рода lecccinum, образующих плодовые тела в микроэкосистемах прируслового вала Р. Кременка, методом рестрикционного анализа участков рДНК»

2013

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер. 3

Вып. 4

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 582.287.23:575 Д. М. Иванов

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИДОВ РОДА LECCCINUM, ОБРАЗУЮЩИХ ПЛОДОВЫЕ ТЕЛА В МИКРОЭКОСИСТЕМАХ ПРИРУСЛОВОГО ВАЛА Р. КРЕМЕНКА, МЕТОДОМ РЕСТРИКЦИОННОГО АНАЛИЗА УЧАСТКОВ рДНК*

Введение

Было установлено, что род Leccinum S. F. Gray представлен в Восточно-Европейской части России небольшим числом видов (9), образующих, в зависимости от экологических условий местообитания, несколько морфологических форм, различающихся размерами плодового тела, цветом кожицы шляпки и изменением окраски на срезе [1].

В полевые сезоны 2011-2012 гг. было зарегистрировано массовое плодоношение эктомикоризных грибов изучаемого рода Leccinum в микроэкосистемах прируслового вала р. Кременка (Ленинградская обл., Гатчинский р-н), иногда состоящих из нескольких деревьев. Микроэкосистемы ограничены от леса на коренном берегу затопляемыми участками поймы, а от реки лугом, с характерными комплексами видов травянистых растений.

Автором данной статьи были обнаружены плодовые тела представителей рода Leccinum, существенно отличающиеся морфологически от видов окружающих лесных и болотных мезоэкосистем. Нетипичным является также состав древесных пород, с которыми в обнаруженных микроэкосистемах произрастают грибы рода Leccinum: ольха, ель, древовидные и кустарниковые ивы.

В качестве рабочей гипотезы было принято следующее предположение: возможно, что в микроэкосистемах, отличающихся по составу древесных пород и по эдафиче-ским условиям от окружающих мезоэкосистем, характерных для данной территории, происходит изменение видового состава рода Leccinum за счет прорастания спор видов из других регионов Голарктики.

Цель работы — идентифицировать плодовые тела, собранные в микроэкосистемах прируслового вала, методом рестрикционного анализа амплифицированных участков рибосомальной ДНК.

Иванов Дмитрий Михайлович — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Санкт-Петербургский государственный университет; доцент, Санкт-Петербургский государственный университет гражданской авиации; e-mail: [email protected]

* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 10-04-01190-а). © Д. М. Иванов, 2013

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

— составить схему поймы р. Кременка и нанести на нее микроэкосистемы в которых был проведен сбор плодовых тел;

— сравнить эдафические условия в микроэкосистемах прируслового вала с лесными мезоэкосистемами на коренном берегу;

— провести амплификацию области внутренних транскрибируемых спейсеров, включающих ген 5,8S (ITS1-5,8S-ITS2), и межгенного интервала IGS1 рибосомальной ДНК (рДНК) с последующим рестрикционным анализом;

— сравнить размеры фрагментов изученных областей у грибов, собранных в микроэкосистемах прируслового вала реки, с результатами, полученными для видов грибов рода Leccinum, собранных в лесных и болотных сообществах Восточно-Европейской части РФ.

Материалы и методы исследования

Сбор плодовых тел грибов был проведен в пойме р. Кременка (Ленинградская обл., Гатчинский р-н). Массовое плодоношение наблюдалось в периоды 15-26.08.2011 и 2029.08.2012. Географические координаты каждой микроэкосистемы, показанной на плане местности (рис. 1), определялись GPS-навигатором eTrex производства Garmin, точность 15 м (приведены в скобках). По составу древесных пород и почвенным условиям были выделены следующие микроэкосистемы.

I. Две группы берез 11 и 19 шт. Расположены на границе между лугом и топким участком осоковой поймы глубиной 0,5-1,0 м (N 59°04,734', E 30°27,664').

II. Четыре березы и кустарниковые ивы на границе лугового сообщества (N 59°04,751', E 30°27,678').

III. Узкая полоса берез шириной 1,0-3,0 м посреди затопляемой части поймы (N 59°04,781', E 30°27,644'). В подросте кустарниковая ива, ольха и ель.

IV. Сообщество с доминированием ольхи серой и единичными березами (N 59°04,831', E 30°27.693').

V. Густой подрост молодых елей, береза и кустарниковые ивы (N 59°04,813', E 30°27,660').

VI. Березы разного возраста и подрост из ели, рябины, крушины (N 59°04,823', E 30°27,638').

Камеральная обработка плодовых тел и их высушивание проводились согласно методике, описанной в работе [2]. Выделение ДНК проводилось из сухих плодовых тел в лизирующем буфере с протеиназой К. Для амплификации области ITS1-5,8S-ITS2 рДНК использовали пару праймеров, специфичных для базидиальных грибов ITS1F-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA и ITS4B-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG [3]. Межгенный спейсер IGS1 амплифицировали с парой праймеров CNL12-CTGAACGCCTCTAAGTCAG и 5SA-CAGAGTCCTATGGCCGTGGAT [4].

Для расщепления амплифицированных фрагментов использовали рестриктазу HinfI — сайт узнавания — G - ANTC, где N — любой нуклеотид. Методика выделения ДНК, условия проведения полимеразной цепной реакции, рестрикционного анализа и разделения полученных фрагментов в агарозном геле приводятся в работе [3]. В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК бактериофага X, расщепленную энзимом Pst I (Fermentas).

Рис. 1. Расположение поймы р. Кременка на плане местности Условные обозначения: I-VI — номера микроэкосистем, ^ — ель, ^ — сосна, ф — береза, — ольха, — ива, — топкий участок поймы, 9 — родник, Г] — старинные фундаменты. В 1 см — 20 м.

Результаты исследований и их обсуждение

Ранее, при изучении представителей рода Leccinum, сбор материала проводился в экосистемах болот и в разных типах леса, однородных на большом протяжении [2]. При обнаружении массового плодоношения в пойме р. Кременка возникла необходимость использования термина «микроэкосистема» для того, чтобы подчеркнуть ее локальные размеры и пространственную изоляцию.

Район исследования относится к группе низинных моренных ландшафтов с покровом из бескарбонатных валунных суглинков и супесей. Было проведено сравнение эдафических условий произрастания древесных пород в мезоэкосистеме смешанного леса на коренном берегу и микроэкосистемы I (см. рис. 1) прируслового вала. На коренном берегу в смешанном березово-еловом лесу почва дерново-слабоподзолистая. Почва прируслового вала в пойме р. Кременка аллювиально-дерновая. Было проведено определение гранулометрического состава, обменных катионов Са2+ и Mg2+, количества гумуса, гидролитической кислотности.

Трудности изучения базидиальных грибов, участвующих в эктомикоризном симбиозе, связаны с тем, что, за редким исключением они не растут на питательных средах. Поэтому основные методы работы генетиков — скрещивание, наблюдение за потомством, прослеживание признаков, — к сожалению, не применимы. Методы генетического анализа экологических отношений между участниками эктомикоризного симбиоза также затруднены из-за сложности выявления элементарных признаков.

Классификация изучаемого рода с точки зрения классической систематики также встречает ряд ограничений, поскольку таксономические признаки (размеры спор, цистид, базидий, окраска частей плодового тела и ее изменения на срезе) у разных видов перекрываются. Трудности изучения видов рода Leccinum миколог Б. П. Васильков (1956) отметил следующей фразой — "crux et scandalum agaricologicorum" ([5], c. 383).

Поэтому основным методом исследования является анализ ITS1-5,8S-ITS2 и IGS1 рДНК [1]. Организация рДНК для грибов и сайты отжига используемых прай-меров изображены на рис. 2.

ITS IF CNL 12

Транскрипционная единица

Повторяющаяся единица

Рис. 2. Схема организации рДНК базидиальных грибов и сайты отжига праймеров:

18S, 5,8S, 28S и 5S - гены рРНК; ETS — внешний транскрибируемый спейсер; ITS1, ITS2 — внутренние транскрибируемые спейсеры; IGS1, IGS2 — межгенные спейсеры; ITS 1F и ITS 4B; CNL 12 и 5 SA — пары праймеров, используемые для амплификации.

В результате сравнения амплифицированных фрагментов ITS1-5,8S-ITS2 (рис. 3 и 4) и IGS1 рДНК и фрагментов, образующихся после воздействия рестриктазы,

805

М 1 2 3 4 5 6 789 10 11 12 М

Рис. 3. Электрофоретическое разделение амплифицированной области внутренних транскирибируемых спейсеров ITS1-5,8S-ITS2 рДНК:

1 — L. versipelle; 2, 7-10 — L. scabrum; 3, 11, 12 — L. schistophilum; 4 — L. variicolor, 5 — L. holopus ; 6 — L. sp. 1; М — маркер молекулярной массы (п.н.).

Рис. 4. Электрофоретическое разделение амплифицированной области внутренних транскирибируемых спейсеров ITS1-5,8S-ITS2 рДНК:

1, 5-7 — L. variicolor; 2-4 — L. versipelle; 8, 9 — L. holopus; 10, 11 — L. scabrum; 12 — L. schistophi-lum; М — маркер молекулярной массы (п.н.).

с данными, полученными ранее для Восточно-Европейских видов рода Leccinum [1], были идентифицированы следующие виды:

Leccinum versipelle (Fr. et Hok) Snell — подосиновик желто-бурый; Leccinum scabrum (Bull. : Fr.) S. F. Gray — подберезовик обыкновенный; Leccinum schistophilum Bon — подберезовик «щебнелюбивый»; Leccinum variicolor Watling — подберезовик разноцветный; Leccinum holopus (Rostk.) Watling — подберезовик болотный.

Латинские названия таксонов приводятся по работе [6]. Полученные данные обобщены в таблице.

Виды рода Leccinum, идентифицированные в микроэкосистемах прируслового вала

Микроэкосистема Идентифицированные виды Доминирующая порода

I L. schistophilum, L. scabrum, L. versipelle Береза

II L. schistophilum, L. scabrum, »

III L. schistophilum »

IV L. variicolor, L. sp. 2 Ольха

V L. holopus Ель

VI L. variicolor, L. holopus, L. sp. 1 Береза

В микроэкосистемах речной поймы были идентифицированы все виды, свойственные произрастающим древесным породам. Не был обнаружен L. vulpinum Watling, произрастающий совместно с сосной. Также не были обнаружены L.pseudoscabrum (Kal-lenb.) Sutara, произрастающий совместно с грабом, и L. rotundifoliae (Singer) A. H. Sm., Thiers & Watling, приуроченный к соответствующему виду березы.

Однако были обнаружены плодовые тела, которые не показали гомологии по размеру амплифицированных фрагментов (см., например, рис. 3, дорожка 6) и фрагментов, образующихся после воздействия рестриктазы, с электрофоретическими спектрами девяти видов, встречающихся в Восточно-Европейской части России. Для их идентификации планируется использовать метод установления родства с известными видами по секвенированным последовательностям.

Таким образом, в микроэкосистемах прируслового вала р. Кременка было идентифицировано пять видов рода Ьеоотит, а в мезоэкосистемах на коренном берегу встречаются один-два вида. Например, в березово-еловом лесу встречаются Ь. зоаЬтит и Ь. ует$1ре11е, в сосновом лесу — Ьеоотит vulpinum, на верховом болоте с болотной формой сосны — Ь. Но1орш и Ь. уатиооЬт.

Среди идентифицированных видов Ь. воЫв^рНИит, Ь. зоаЬтит и Ь. veтsipelle приурочены к березе в микроэкосистемах I и II на границе между лугом и топким участком поймы, на аллювиальных кварцевых породах, а Ь. НоЬрш и Ь. vaтiiоoloт приурочены к ели и ольхе в микоэкосистемах топкой осоковой поймы.

В пойме р. Кременка, в трех микроэкосистемах, идентифицирован вид Ь. зоЫз^рЫ-Шт, который ранее был обнаружен в экосистемах антропогенного происхождения — по обочинам дорог, обсыпанных известковым щебнем [7]. Также в микроэкосистеме IV с доминированием ольхи серой был идентифицирован Ь. vaтiiоoloт, обычно приуроченный к сосне, растущей по окраинам верховых болот [8].

В растительных сообществах, формирующихся на молодом песчаном аллювии в поймах рек, с участием кустарниковой и древесной растительности, складываются своеобразные условия микоризообразования [9]. Еще в 1955 г. Б. П. Васильков отмечал, что в отношении напочвенных грибов эти сообщества еще очень мало исследованы [9], но и в настоящее время эктомикоризные грибы растительных сообществ на затопляемых территориях являются наименее изученными. Можно предположить, что недостаточный интерес к их исследованию связан с тем, что заросшие кустарником поймы малых рек в хозяйственном отношении не представляют интереса, относятся к «неудобъям» и трудно осваиваемым территориям. Тем не менее это не снимает необходимости изучения микоризообразования в таких сообществах. Прежде всего это актуально в связи со своеобразием эдафических условий и большим количеством микроэкосистем, образующихся в поймах рек, по сравнению с окружающими лесными и болотными экосистемами.

Приуроченность к древесному партнеру была впервые использована для видов Ьеоотит, как таксономический признак, в классификации Р. Уотлинга ШаШ^) [10]. Это оказало большое влияние не только на систематику данного рода, но стало подходом к классификации всех грибов с эктомикотрофным типом питания. В настоящее время общепризнано, что приуроченность к древесному партнеру для грибов, образующих эктотрофную микоризу, является определяющим фактором.

Основными древесными породами на территории Восточно-Европейской части России, вступающими в эктомикоризный симбиоз с представителями изучаемого рода Ьеоотит, являются: береза, осина, сосна, дуб и граб. Ольха, образующая актиноризу с азотфиксирующими бактериями, обычно рассматривается в качестве микотрофной древесной породы только для очень ограниченного круга видов, в состав которых представители рода Ьеоотит не входят. Вопрос о возможности существования видов рода Ьеоотит, образующих микоризу в чистых еловых насаждениях, окончательно не решен. Ива редко рассматривается в качестве микотрофного растения и вопрос о существовании Ьеоотит зр., связанного с древовидными и кустарниковыми ивами остается открытым [11].

Заключение

В пойме р. Кременка на аллювиальных почвах изучены микроэкосистемы, в которых сложились своеобразные условия микоризообразования как по эдафическим условиям, так и по составу доминирующих древесных пород.

В микроэкосистемах прируслового вала р. Кременка было идентифицировано пять видов рода Leccinum, а к мезоэкосистемам на коренном берегу приурочены один-два вида. Также, на основе электрофоретических спектров, были обнаружены плодовые тела, которые пока не удалось сопоставить с известными видами.

Литература

1. Иванов Д. М. Идентификация подберезовиков с аномалиями морфологических признаков и превышением содержания 137Cs в плодовых телах методом рестрикционного анализа участков рДНК // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2013. Вып. 1. С. 90-95.

2. Иванов Д. М., Ефремова М. А. Оценка суммарной бета-активности в плодовых телах грибов рода Leccinum, произрастающих в лесных и болотных экосистемах Ленинградской области // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2012. Вып. 2. С. 55-61.

3. Иванов Д. М. Верификация метода рестрикционного анализа рДНК для изучения геномного полиморфизма представителей порядка Boletales // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2008. Вып. 4. С. 112-120.

4. Honig K., Riefler M., Kottke I. Survey of Paxillus involutus (Batsch) Fr. inoculum and fruitbodies in a nursery by IGS-RFLPs and IGS sequences // Mycorrhiza. 2000. Vol. 9. P. 315-322.

5. Васильков Б. П. Березовик — Krombholzia scabra (Fr.) Karst. — в СССР // Тр. Бот. ин-та АН СССР. Сер. II. 1956. Вып. 10. C. 367-384.

6. Den Bakker H. C., Noordeloos M. E. A revision of European species of Leccinum Gray and notes on extralimital species // Persoonia. 2005. Vol. 18. P. 511-587.

7. Иванов Д. М. Идентификация Leccinum schistophilum по данным рестрикционного анализа участков ядерной рибосомальной ДНК // Иммунопатология. Аллергология. Инфектология. 2009. № 1. С. 9-10.

8. Иванов Д. М. Поиск гиатуса между видами Leccinum holopus и Leccinum variicolor // Иммунопатология. Аллергология. Инфектология. 2010. № 1. С. 37.

9. Васильков Б. П. Очерк географического распространения шляпочных грибов в СССР. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1955. 86 с.

10. Watling R. Boletaceae, Gomphidiaceae, Paxillaceae // British Fungus Flora. Agarics and Boleti 1. Ed-inburg: Royal Botanical Gard, 1970. P. 45-57.

11. Watling R. Macrofungi associated with British willows // Proceedings of the Royal Society of Edinburgh. 1992. 98B. P. 135-147.

Статья поступила в редакцию 13 июня 2013 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.