CC BY
34
2013
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 3
Вып. 4
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 582.287.23:575 Д. М. Иванов
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИДОВ РОДА LECCCINUM, ОБРАЗУЮЩИХ ПЛОДОВЫЕ ТЕЛА В МИКРОЭКОСИСТЕМАХ ПРИРУСЛОВОГО ВАЛА Р. КРЕМЕНКА, МЕТОДОМ РЕСТРИКЦИОННОГО АНАЛИЗА УЧАСТКОВ рДНК*
Введение
Было установлено, что род Leccinum S. F. Gray представлен в Восточно-Европейской части России небольшим числом видов (9), образующих, в зависимости от экологических условий местообитания, несколько морфологических форм, различающихся размерами плодового тела, цветом кожицы шляпки и изменением окраски на срезе [1].
В полевые сезоны 2011-2012 гг. было зарегистрировано массовое плодоношение эктомикоризных грибов изучаемого рода Leccinum в микроэкосистемах прируслового вала р. Кременка (Ленинградская обл., Гатчинский р-н), иногда состоящих из нескольких деревьев. Микроэкосистемы ограничены от леса на коренном берегу затопляемыми участками поймы, а от реки лугом, с характерными комплексами видов травянистых растений.
Автором данной статьи были обнаружены плодовые тела представителей рода Leccinum, существенно отличающиеся морфологически от видов окружающих лесных и болотных мезоэкосистем. Нетипичным является также состав древесных пород, с которыми в обнаруженных микроэкосистемах произрастают грибы рода Leccinum: ольха, ель, древовидные и кустарниковые ивы.
В качестве рабочей гипотезы было принято следующее предположение: возможно, что в микроэкосистемах, отличающихся по составу древесных пород и по эдафиче-ским условиям от окружающих мезоэкосистем, характерных для данной территории, происходит изменение видового состава рода Leccinum за счет прорастания спор видов из других регионов Голарктики.
Цель работы — идентифицировать плодовые тела, собранные в микроэкосистемах прируслового вала, методом рестрикционного анализа амплифицированных участков рибосомальной ДНК.
Иванов Дмитрий Михайлович — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Санкт-Петербургский государственный университет; доцент, Санкт-Петербургский государственный университет гражданской авиации; e-mail: goldenflees@mail.ru
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 10-04-01190-а). © Д. М. Иванов, 2013
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
— составить схему поймы р. Кременка и нанести на нее микроэкосистемы в которых был проведен сбор плодовых тел;
— сравнить эдафические условия в микроэкосистемах прируслового вала с лесными мезоэкосистемами на коренном берегу;
— провести амплификацию области внутренних транскрибируемых спейсеров, включающих ген 5,8S (ITS1-5,8S-ITS2), и межгенного интервала IGS1 рибосомальной ДНК (рДНК) с последующим рестрикционным анализом;
— сравнить размеры фрагментов изученных областей у грибов, собранных в микроэкосистемах прируслового вала реки, с результатами, полученными для видов грибов рода Leccinum, собранных в лесных и болотных сообществах Восточно-Европейской части РФ.
Материалы и методы исследования
Сбор плодовых тел грибов был проведен в пойме р. Кременка (Ленинградская обл., Гатчинский р-н). Массовое плодоношение наблюдалось в периоды 15-26.08.2011 и 2029.08.2012. Географические координаты каждой микроэкосистемы, показанной на плане местности (рис. 1), определялись GPS-навигатором eTrex производства Garmin, точность 15 м (приведены в скобках). По составу древесных пород и почвенным условиям были выделены следующие микроэкосистемы.
I. Две группы берез 11 и 19 шт. Расположены на границе между лугом и топким участком осоковой поймы глубиной 0,5-1,0 м (N 59°04,734', E 30°27,664').
II. Четыре березы и кустарниковые ивы на границе лугового сообщества (N 59°04,751', E 30°27,678').
III. Узкая полоса берез шириной 1,0-3,0 м посреди затопляемой части поймы (N 59°04,781', E 30°27,644'). В подросте кустарниковая ива, ольха и ель.
IV. Сообщество с доминированием ольхи серой и единичными березами (N 59°04,831', E 30°27.693').
V. Густой подрост молодых елей, береза и кустарниковые ивы (N 59°04,813', E 30°27,660').
VI. Березы разного возраста и подрост из ели, рябины, крушины (N 59°04,823', E 30°27,638').
Камеральная обработка плодовых тел и их высушивание проводились согласно методике, описанной в работе [2]. Выделение ДНК проводилось из сухих плодовых тел в лизирующем буфере с протеиназой К. Для амплификации области ITS1-5,8S-ITS2 рДНК использовали пару праймеров, специфичных для базидиальных грибов ITS1F-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA и ITS4B-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG [3]. Межгенный спейсер IGS1 амплифицировали с парой праймеров CNL12-CTGAACGCCTCTAAGTCAG и 5SA-CAGAGTCCTATGGCCGTGGAT [4].
Для расщепления амплифицированных фрагментов использовали рестриктазу HinfI — сайт узнавания — G - ANTC, где N — любой нуклеотид. Методика выделения ДНК, условия проведения полимеразной цепной реакции, рестрикционного анализа и разделения полученных фрагментов в агарозном геле приводятся в работе [3]. В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК бактериофага X, расщепленную энзимом Pst I (Fermentas).
Рис. 1. Расположение поймы р. Кременка на плане местности Условные обозначения: I-VI — номера микроэкосистем, ^ — ель, ^ — сосна, ф — береза, — ольха, — ива, — топкий участок поймы, 9 — родник, Г] — старинные фундаменты. В 1 см — 20 м.
Результаты исследований и их обсуждение
Ранее, при изучении представителей рода Leccinum, сбор материала проводился в экосистемах болот и в разных типах леса, однородных на большом протяжении [2]. При обнаружении массового плодоношения в пойме р. Кременка возникла необходимость использования термина «микроэкосистема» для того, чтобы подчеркнуть ее локальные размеры и пространственную изоляцию.
Район исследования относится к группе низинных моренных ландшафтов с покровом из бескарбонатных валунных суглинков и супесей. Было проведено сравнение эдафических условий произрастания древесных пород в мезоэкосистеме смешанного леса на коренном берегу и микроэкосистемы I (см. рис. 1) прируслового вала. На коренном берегу в смешанном березово-еловом лесу почва дерново-слабоподзолистая. Почва прируслового вала в пойме р. Кременка аллювиально-дерновая. Было проведено определение гранулометрического состава, обменных катионов Са2+ и Mg2+, количества гумуса, гидролитической кислотности.
Трудности изучения базидиальных грибов, участвующих в эктомикоризном симбиозе, связаны с тем, что, за редким исключением они не растут на питательных средах. Поэтому основные методы работы генетиков — скрещивание, наблюдение за потомством, прослеживание признаков, — к сожалению, не применимы. Методы генетического анализа экологических отношений между участниками эктомикоризного симбиоза также затруднены из-за сложности выявления элементарных признаков.
Классификация изучаемого рода с точки зрения классической систематики также встречает ряд ограничений, поскольку таксономические признаки (размеры спор, цистид, базидий, окраска частей плодового тела и ее изменения на срезе) у разных видов перекрываются. Трудности изучения видов рода Leccinum миколог Б. П. Васильков (1956) отметил следующей фразой — "crux et scandalum agaricologicorum" ([5], c. 383).
Поэтому основным методом исследования является анализ ITS1-5,8S-ITS2 и IGS1 рДНК [1]. Организация рДНК для грибов и сайты отжига используемых прай-меров изображены на рис. 2.
ITS IF CNL 12
Транскрипционная единица
Повторяющаяся единица
Рис. 2. Схема организации рДНК базидиальных грибов и сайты отжига праймеров:
18S, 5,8S, 28S и 5S - гены рРНК; ETS — внешний транскрибируемый спейсер; ITS1, ITS2 — внутренние транскрибируемые спейсеры; IGS1, IGS2 — межгенные спейсеры; ITS 1F и ITS 4B; CNL 12 и 5 SA — пары праймеров, используемые для амплификации.
В результате сравнения амплифицированных фрагментов ITS1-5,8S-ITS2 (рис. 3 и 4) и IGS1 рДНК и фрагментов, образующихся после воздействия рестриктазы,
805
М 1 2 3 4 5 6 789 10 11 12 М
Рис. 3. Электрофоретическое разделение амплифицированной области внутренних транскирибируемых спейсеров ITS1-5,8S-ITS2 рДНК:
1 — L. versipelle; 2, 7-10 — L. scabrum; 3, 11, 12 — L. schistophilum; 4 — L. variicolor, 5 — L. holopus ; 6 — L. sp. 1; М — маркер молекулярной массы (п.н.).
Рис. 4. Электрофоретическое разделение амплифицированной области внутренних транскирибируемых спейсеров ITS1-5,8S-ITS2 рДНК:
1, 5-7 — L. variicolor; 2-4 — L. versipelle; 8, 9 — L. holopus; 10, 11 — L. scabrum; 12 — L. schistophi-lum; М — маркер молекулярной массы (п.н.).
с данными, полученными ранее для Восточно-Европейских видов рода Leccinum [1], были идентифицированы следующие виды:
Leccinum versipelle (Fr. et Hok) Snell — подосиновик желто-бурый; Leccinum scabrum (Bull. : Fr.) S. F. Gray — подберезовик обыкновенный; Leccinum schistophilum Bon — подберезовик «щебнелюбивый»; Leccinum variicolor Watling — подберезовик разноцветный; Leccinum holopus (Rostk.) Watling — подберезовик болотный.
Латинские названия таксонов приводятся по работе [6]. Полученные данные обобщены в таблице.
Виды рода Leccinum, идентифицированные в микроэкосистемах прируслового вала
Микроэкосистема Идентифицированные виды Доминирующая порода
I L. schistophilum, L. scabrum, L. versipelle Береза
II L. schistophilum, L. scabrum, »
III L. schistophilum »
IV L. variicolor, L. sp. 2 Ольха
V L. holopus Ель
VI L. variicolor, L. holopus, L. sp. 1 Береза
В микроэкосистемах речной поймы были идентифицированы все виды, свойственные произрастающим древесным породам. Не был обнаружен L. vulpinum Watling, произрастающий совместно с сосной. Также не были обнаружены L.pseudoscabrum (Kal-lenb.) Sutara, произрастающий совместно с грабом, и L. rotundifoliae (Singer) A. H. Sm., Thiers & Watling, приуроченный к соответствующему виду березы.
Однако были обнаружены плодовые тела, которые не показали гомологии по размеру амплифицированных фрагментов (см., например, рис. 3, дорожка 6) и фрагментов, образующихся после воздействия рестриктазы, с электрофоретическими спектрами девяти видов, встречающихся в Восточно-Европейской части России. Для их идентификации планируется использовать метод установления родства с известными видами по секвенированным последовательностям.
Таким образом, в микроэкосистемах прируслового вала р. Кременка было идентифицировано пять видов рода Ьеоотит, а в мезоэкосистемах на коренном берегу встречаются один-два вида. Например, в березово-еловом лесу встречаются Ь. зоаЬтит и Ь. ует$1ре11е, в сосновом лесу — Ьеоотит vulpinum, на верховом болоте с болотной формой сосны — Ь. Но1орш и Ь. уатиооЬт.
Среди идентифицированных видов Ь. воЫв^рНИит, Ь. зоаЬтит и Ь. veтsipelle приурочены к березе в микроэкосистемах I и II на границе между лугом и топким участком поймы, на аллювиальных кварцевых породах, а Ь. НоЬрш и Ь. vaтiiоoloт приурочены к ели и ольхе в микоэкосистемах топкой осоковой поймы.
В пойме р. Кременка, в трех микроэкосистемах, идентифицирован вид Ь. зоЫз^рЫ-Шт, который ранее был обнаружен в экосистемах антропогенного происхождения — по обочинам дорог, обсыпанных известковым щебнем [7]. Также в микроэкосистеме IV с доминированием ольхи серой был идентифицирован Ь. vaтiiоoloт, обычно приуроченный к сосне, растущей по окраинам верховых болот [8].
В растительных сообществах, формирующихся на молодом песчаном аллювии в поймах рек, с участием кустарниковой и древесной растительности, складываются своеобразные условия микоризообразования [9]. Еще в 1955 г. Б. П. Васильков отмечал, что в отношении напочвенных грибов эти сообщества еще очень мало исследованы [9], но и в настоящее время эктомикоризные грибы растительных сообществ на затопляемых территориях являются наименее изученными. Можно предположить, что недостаточный интерес к их исследованию связан с тем, что заросшие кустарником поймы малых рек в хозяйственном отношении не представляют интереса, относятся к «неудобъям» и трудно осваиваемым территориям. Тем не менее это не снимает необходимости изучения микоризообразования в таких сообществах. Прежде всего это актуально в связи со своеобразием эдафических условий и большим количеством микроэкосистем, образующихся в поймах рек, по сравнению с окружающими лесными и болотными экосистемами.
Приуроченность к древесному партнеру была впервые использована для видов Ьеоотит, как таксономический признак, в классификации Р. Уотлинга ШаШ^) [10]. Это оказало большое влияние не только на систематику данного рода, но стало подходом к классификации всех грибов с эктомикотрофным типом питания. В настоящее время общепризнано, что приуроченность к древесному партнеру для грибов, образующих эктотрофную микоризу, является определяющим фактором.
Основными древесными породами на территории Восточно-Европейской части России, вступающими в эктомикоризный симбиоз с представителями изучаемого рода Ьеоотит, являются: береза, осина, сосна, дуб и граб. Ольха, образующая актиноризу с азотфиксирующими бактериями, обычно рассматривается в качестве микотрофной древесной породы только для очень ограниченного круга видов, в состав которых представители рода Ьеоотит не входят. Вопрос о возможности существования видов рода Ьеоотит, образующих микоризу в чистых еловых насаждениях, окончательно не решен. Ива редко рассматривается в качестве микотрофного растения и вопрос о существовании Ьеоотит зр., связанного с древовидными и кустарниковыми ивами остается открытым [11].
Заключение
В пойме р. Кременка на аллювиальных почвах изучены микроэкосистемы, в которых сложились своеобразные условия микоризообразования как по эдафическим условиям, так и по составу доминирующих древесных пород.
В микроэкосистемах прируслового вала р. Кременка было идентифицировано пять видов рода Leccinum, а к мезоэкосистемам на коренном берегу приурочены один-два вида. Также, на основе электрофоретических спектров, были обнаружены плодовые тела, которые пока не удалось сопоставить с известными видами.
Литература
1. Иванов Д. М. Идентификация подберезовиков с аномалиями морфологических признаков и превышением содержания 137Cs в плодовых телах методом рестрикционного анализа участков рДНК // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2013. Вып. 1. С. 90-95.
2. Иванов Д. М., Ефремова М. А. Оценка суммарной бета-активности в плодовых телах грибов рода Leccinum, произрастающих в лесных и болотных экосистемах Ленинградской области // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2012. Вып. 2. С. 55-61.
3. Иванов Д. М. Верификация метода рестрикционного анализа рДНК для изучения геномного полиморфизма представителей порядка Boletales // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2008. Вып. 4. С. 112-120.
4. Honig K., Riefler M., Kottke I. Survey of Paxillus involutus (Batsch) Fr. inoculum and fruitbodies in a nursery by IGS-RFLPs and IGS sequences // Mycorrhiza. 2000. Vol. 9. P. 315-322.
5. Васильков Б. П. Березовик — Krombholzia scabra (Fr.) Karst. — в СССР // Тр. Бот. ин-та АН СССР. Сер. II. 1956. Вып. 10. C. 367-384.
6. Den Bakker H. C., Noordeloos M. E. A revision of European species of Leccinum Gray and notes on extralimital species // Persoonia. 2005. Vol. 18. P. 511-587.
7. Иванов Д. М. Идентификация Leccinum schistophilum по данным рестрикционного анализа участков ядерной рибосомальной ДНК // Иммунопатология. Аллергология. Инфектология. 2009. № 1. С. 9-10.
8. Иванов Д. М. Поиск гиатуса между видами Leccinum holopus и Leccinum variicolor // Иммунопатология. Аллергология. Инфектология. 2010. № 1. С. 37.
9. Васильков Б. П. Очерк географического распространения шляпочных грибов в СССР. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1955. 86 с.
10. Watling R. Boletaceae, Gomphidiaceae, Paxillaceae // British Fungus Flora. Agarics and Boleti 1. Ed-inburg: Royal Botanical Gard, 1970. P. 45-57.
11. Watling R. Macrofungi associated with British willows // Proceedings of the Royal Society of Edinburgh. 1992. 98B. P. 135-147.
Статья поступила в редакцию 13 июня 2013 г.
