CC BY
42
УДК 577.21
Е. В. Романовская, Тхи Фыонг Зунг Нгуен, Г. И. Чихиржина
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ СЕМЕЙСТВА (№1) В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ КРЫС И КЛЕТКАХ ГЕПАТОМЫ ЛИНИИ НТС
Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра биохимии биолого-почвенного факультета
Общепризнано, что процессы регуляции транскрипции реализуются на хроматино-вой матрице. Компонентами хроматина регуляторных областей многих индуцибельных генов являются транскрипционные факторы семейства КБ1. Впервые эти белки были описаны в 1982 г. как факторы, специфически связывающиеся с четырьмя участками ДНК в 5'-области гена лизоцима цыпленка (первоначально — ТООСЛ-связывающий белок) [15], затем были найдены как обязательные компоненты регуляторных систем более 100 генов, как экспрессирующихся на ранних стадиях эмбрионального развития, так и тканеспецифичных, что позволяет отнести их к конститутивным факторам транскрипции
[I]. КБ1 связывается как гомодимер с симметричной консенсусной последовательностью 5'-ТТООСК№№№Ы (К) ОССЛЛ-3' на дуплексе ДНК. Однако позднее выяснилось, что он взаимодействует с любой половиной палиндромной последовательности — только с меньшим сродством, и при этом сохраняется его способность активировать транскрипцию
[II]. Эти факторы существуют в растворе как димеры в отсутствие ДНК-связывающих участков, а их ДНК-связывающий домен не имеет распознаваемой гомологии с другими известными ДНК узнающими доменами [11]. У позвоночных существуют 4 гена, кодирующие белки этого семейства: п:П-а,-Ь, -с, -х [19]. К-концевой ДНК-связывающий и димеризаци-онный домены строго консервативны у всех 4 генов, тогда как С-концевой пролин-богатый домен (может содержать до 25 % остатков пролина) более вариабилен [14]. Молекулярная масса белков находится в пределах 30 кДа (КР1-Х) — 65 кДа (КР1-С) [17].
Тонкие механизмы участия транскрипционных факторов КБ1 в процессах регуляции транскрипции до конца не выяснены. С одной стороны, факторы КБ1 являются классическими компонентами энхансеосомы и участвуют в передаче регуляторного сигнала. Причем влияние КБ1 на транскрипцию может быть как активирующим [10], так и репрессирующим [13]. С другой стороны, факторы транскрипции семейства №1 обладают рядом особенностей, не свойственных другим представителям сайт-специфических белков. Так, необходимо отметить их способность функционировать в качестве как факторов транскрипции, так и факторов репликации геномов некоторых вирусов [14].
Самым интересным свойством, с нашей точки зрения, является слабое связывание факторов КБ1 с ДНК в составе нуклеосомных частиц. Белки №1 обладают в 100-300 раз более низким сродством к нуклеосомной ДНК по сравнению со свободной — независимо от ротационного и трансляционного позиционирования ДНК в частице. Только при введении олигонуклеотидных вставок из пяти адениловых нуклеотидов с обеих сторон от сайта связывания КБ1 в ДНК, что нарушает ее взаимодействие с гистонами, наблюдается
© Е. В. Романовская, Тхи Фыонг Зунг Нгуен, Г. И. Чихиржина, 2009
усиление связывания транскрипционного фактора NF1 с нуклеосомной мишенью [6]. Данные, полученные в последнее время, позволяют предположить, что транскрипционные факторы этого семейства участвуют в ремоделировании нуклеосомы и поддержании специфической предустановленной (“preset”) структуры хроматина в регуляторных областях, которая определяет состояние компетенции гена к транскрипции [1]. Фундаментальная роль транскрипционных факторов NF1 в формировании структуры хроматина проявляется и в вовлечении NF1 во многие опухолевые процессы. Отдельные изоформы факторов контролируют экспрессию гена опухолевого супрессора р53 в молочной железе мыши, генов онкобелков Е6 и Е7 вируса папилломы человека, вызывающего рак шейки матки [4].
В лаборатории химии белка ФНИИ им. А. А. Ухтомского в течение ряда лет проводятся исследования по изучению структурных преобразований нуклеосом в регуляторной области гормон-зависимого гена триптофандиоксигеназы (ген tdo) крысы, сопровождающих переход гена к транскрипционно активному состоянию. Ген tdo крысы экспрессируется преимущественно в печени. В хроматине регуляторной области гена tdo обнаружены три конститутивных участка гиперчувствительности к ДНКазе 1 [5], что свидетельствует о компетентном к транскрипции состоянии хроматина. Известно, что в регуляторной области гена tdo локализованы сайты связывания рецепторов глюкокортикоидных гормонов [8], САССС-связывающего фактора [20] и транскрипционных факторов семейства NF1 [2, 3] (рис. 1). Данные о том, что сайты связывания NF1 совпадают с конститутивными участками гиперчувствительности к ДНКазе1 [2, 3, 5], а также появившиеся в последние годы данные о решающей роли факторов семейства NF1 в формировании открытой («preset») структуры хроматина гена лизоцима цыпленка и промотора вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV) [1] позволили поставить основной задачей нашего исследования детальное изучение взаимодействия NF1 со своими специфическими сайтами в регуляторной области гена tdо в состоянии компетенции к транскрипции.
В качестве модельной системы для изучения роли факторов NF1 в организации хроматина гена tdo предполагается использовать клеточную линию HTC, полученную из гепатомы, индуцированной химическим путем у крыс линии Buffalo. Исходя из предварительных данных, можно предположить, что ген tdo в этих клетках находится в компетент-
-466 +317 +600 +1300 I +2600 I +3200 I
а 7 Eco RI 1 1 Pst I HindIII 1 Pst I 1 HindIII 1 EcoRI
+1 +56 +175 +317
Рис. 1. Рестрикционные карты геномного ЕсоИ-фрагмента гена tdo (а) и ЕсоИ-Р811 — фрагмента
регуляторной области данного гена (б)
Белыми прямоугольниками отмечены гиперчувствительные к ДНКазе I участки в хроматине печени крысы [5]. Черный овал (ОЯ) — сайт взаимодействия глюкокортикоидного рецептора [8], черные прямоугольники (ОТ1) — участки взаимодействия с ДНК транскрипционных факторов семейства ОТ1.
б
ном к транскрипции состоянии. Важной предпосылкой для проведения этих исследований является получение прямых данных о присутствии факторов NF1 в ядрах печени крыс и ядрах клеток гепатомы. В связи с этим задачей данной работы была иммунохимическая идентификация транскрипционных факторов семейства NF1 в частично очищенных экстрактах белков из ядер клеток печени крыс, в экстракте белков из ядер клеток гепатомы крыс, а также определение молекулярных масс идентифицированных белков.
Материалы и методы исследования. В работе использовали печень белых беспородных крыс-самцов (массой 200-250 г) и клетки гепатомы крыс линии HTC. Для иммунодетекции использовали мембрану из поливинилденфлуорида PolyScreen PVDF и хе-милюминисцентный реагент “Plus” (“NEN”, США); поликлональные IgG антитела козы, конъюгированные с пероксидазой хрена, полученные против IgG антител, выделенных из кролика (“Sigma”, США); поликлональные IgG антитела кролика, полученные против наиболее консервативных 20 аминокислот N-концевого домена транскрипционных факторов семейства NF1 (“Santa Cruz Biotechnology”, США). Для определения молекулярной массы использовали стандартные белки, ковалентно связанные с цветными хромофорами “Page Ruler” (“Fermentas”, Латвия). В работе использовали прибор Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Mini-Protean 3 (“Bio-Rad”, США)
Все процедуры по получению ядер и белковых экстрактов, включая центрифугирование, проводились при температуре 0 — +4 °С. Ядра из клеток гепатомы крыс (HTC) выделяли по O’Neill, Turner [16]. Клетки (от 5 х 107 до 1 х 108) собирали центрифугированием при 700 g в течение 10 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере TBS (0,15 M NaCl, 0,1 M трис-HCl, pH 7,5, 3 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2), концентрация составляла 2х107 клеток/мл суспензии. Далее клетки обрабатывали 0,5 % Tween 40 в присутствии 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). PMSF непосредственно перед опытом растворяли в 96 %-ном этаноле. Клеточную суспензию выдерживали на льду в течение 1 ч, слегка помешивая. После этого клеточную суспензию гомогенизировали в плотно притертом стеклянном гомогенизаторе. Суспензию после лизиса клеток центрифугировали при 600 g в течение 10 мин, после чего ресуспендировали в буфере TBS, содержащем 25 % сахарозы. Для получения ядерного осадка супернатант центрифугировали при 700 g в течение 20 мин; ядра из клеток печени получали, как описано в работе [3]. Ядерные белки экстрагировали буфером, содержащим 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 400 мМ NaCl, 3 мМ СаС12, 10 %-ный глицерин, 2 мМ дитиотрейтола, 1 мМ PMSF. Экстракцию проводили в течение 60 мин, после чего суспензию центрифугировали 20 мин при 20000 g. В супернатант добавляли 10 %-ный глицерин и использовали для дальнейших опытов. Частичную очистку ядерных экстрактов из клеток печени осуществляли фракционирванием на DEAE-целлюлозе и гепарин-сефарозе [3].
Реакцию специфического связывания белок-ДНК проводили при комнатной температуре в 30 мкл инкубационной смеси, содержащей 1-3 нг 32Р-ДНК, варьирующее количество неспецифической ДНК фага X, фрагментированной рестриктазой Мsр1, и буфер, содержащий 20 мМ трис-НС1, рН 7,6, 100 мМ №С1, 0,1 % Тритон Х-100, 1 мМ дитиотреи-тола, 10 %-ный глицерин и 5-6 мкг белка. Изучаемые фрагменты ДНК метили по одному из 5'-концов в реакции с Т4-полинуклеотидкиназой в присутствии АТР, меченной у-32Р. После электрофореза в 6 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) меченый фрагмент элюировали из геля буфером, содержащим 0,5 М ацетата аммония, 10 мМ ацетата магния, 1 мМ ЭДТА и 0,1 %-ный додецил-сульфата натрия (SDS), рН 8,0, в течение ночи при 37 °С. Специфические ДНК-белковые комплексы идентифицировали по изменению подвижности фрагмента ДНК в ПААГ (методом «торможения в геле»). Электрофорез проводили
в 6 %-ном ПААГ в 40 мМ Трис-ацетатном буфере, рН 7,6, содержащем 2 мМ ЭДТА. Для приготовления геля использовали буфер для электрофореза, содержащий 5 %-ный глицерин. Разделение комплексов проводили при напряжении 200 В в течение 3-4 ч. Гель высушивали и радиоавтографировали при -70 °С.
Аналитический диск-электрофорез белков в присутствии SDS проводили по Лэм-ли [12] в блоках 12 % ПААГ размером 75 х 100 х 1,5 мм в течение 2-3 ч при напряжении 130 В и силе тока около 30 мА.
Иммуноблоттинг с использованием хемилюминесцентной детекции проводили по рекомендациям фирмы «NEN», (США). Белки после диск-электрофореза переносили с ПААГ на гидрофобную PVDF-мембрану методом электропереноса в резервуаре в буфере для переноса, содержащем 25 мМ трис, 192 мМ глицина, рН 8,3. Электроперенос проводили в течение 16 ч при напряжении 23 В и силе тока 90 мА. После переноса мембрану высушивали в течение 60 мин при 37 °С. Все процедуры по иммунодетекции проводили при комнатной температуре при покачивании. PVDF-мембрану активировали путем инкубации в 96 %-ном этаноле в течение 2 мин с последующей промывкой в дистиллированной воде в течение 1 мин. Блокирование мембраны проводили в буфере BS (20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 137 мМ NaCl, 0,1 % Tween 20, 7 %-ное обезжиренное сухое молоко) в течение 1 ч. Отмывку мембраны проводили в избытке промывочного буфера TBS-T (20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 137 мМ NaCl, 0,1 % Tween 20). После этого мембрану инкубировали в течение 1 ч с первичными антителами к белкам NF1, разведенными в буфере TBS-T, содержащем 1 % BSA, в минимальном объеме буфера. Мембрану тщательно промывали в избытке промывочного буфера и инкубировали с вторичными антителами козы (поликлональные IgG антитела) к IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена, разведенными в буфере TBS-T, содержащим 1 % BSA. Далее промытую мембрану обрабатывали хемилюминисцентным реагентом, представляющим собой смесь из равных количеств Enhanced Luminol Reagent и Oxidizing Reagent в течении 2 мин без покачивания. Регистрацию сигнала проводили с помошью рентгеновской пленки.
Результаты исследования и их обсуждение. Экстракты ядерных белков из клеток печени крыс были последовательно фракционированы на DEAE-целлюлозе и гепарин-сефарозе [3]. Фракция белков, элюируемая с гепарин-сефарозы раствором, содержащим
0,6 M NaCl и обогащенная транскрипционными факторами NF1, использовалась в дальнейшей работе. Связывание частично очищенных белковых экстрактов с фрагментами регуляторной области гена tdo изучали методом торможения электрофоретической подвижности в геле в присутствии конкурентной ДНК. В качестве неспецифического конкурента использовали ДНК фага X, в качестве специфического конкурента — PvuII-фрагмент ДНК, содержащий синтезированную согласованную нуклеотидную последовательность 5'-GATCCTTGGCAGCTTGCCAAG-3’, специфически взаимодействующую с фактором NF1. Нами было показано, что при связывании EcoRI — HindIII-фрагмента регуляторной области гена tdo от -499-го до -292-го нуклеотида с ядерными белками наблюдается образование трех специфических комплексов C-1, C-3 и С-3 (рис. 2, а). При увеличении концентрации специфического конкурента происходит резкое уменьшение содержания комплексов, что свидетельствует о принадлежности изучаемых белков к семейству ядерных факторов NF1. Аналогичные результаты были получены и при связывании с ядерными белками HindIII — TaqI-фрагмента от -292-го до -178-го нуклеотида (рис. 2, б). C помощью компьютерного анализа было показано, что данные фрагменты ДНК содержат последовательности, гомологичные либо классической палиндромной последовательности для NF1 с варьирующей длиной вставки между мотивами узнавания, либо ее половине.
Рис. 2. Связывание ядерных белков печени с меченным 32Р EcoRI - НМШ- (а) и HindIII - TaqI-фрагментами гена tdo (б) в присутствии фрагментированной ДНК фага X как неспецифического конкурента и PvuII-фрагмента ДНК, содержащего синтетический идеальный палиндром для связывания NF1 а: 1 — меченный 32Р фрагмент ДНК; 2 — связывание в присутствии 3 мкг неспецифического конкурента;
3-5 — то же, что и на дорожке 2, но с добавлением 3-, 10- и 15-кратного молярного избытка PvuII-фрагмента ДНК соответственно; б: 1 — меченный фрагмент ДНК, не связанный с белками; 2, 3 — связывание белков с фрагментом гена в присутствии фрагментированной ДНК фага X в количествах 6 и 3 мкг соответственно; 4-6 — то же, что и в варианте 3, но с добавлением немеченного Pvu II-фрагмента ДНК в количествах 3, 5 и 15 нг соответственно; 7-9 — то же, что и в варианте 3, но с добавлением немеченного Hind III-Taq I -фрагмента гена tdo в количествах 3, 5 и 15 нг C-1, C-2 и С-3 — специфические комплексы, F — свободный фрагмент. Электрофорез в 6%-ном полиакриламидном геле.
Для прямого подтверждения данных о том, что обнаруженный авторами сайт-специфический фактор относится к семейству транскрипционных факторов NF1, была проведена иммунохимическая детекция NF1 в частично очищенном экстракте ядерных белков из клеток печени крыс. Также в целях проверки возможности применения клеток гепатомы в исследованиях структуры хроматина регуляторной области гена tdo была проведена иммунохимическая детекция NF1 в экстракте белков из ядер клеток НТС. В качестве положительного контроля использовался коммерческий рекомбинантный NF1-C1 фирмы“Ба^а Cruz Biotechnology”, США. Тотальный гистон печени крыс был выбран в качестве отрицательного контроля. Иммунодетекцию проводили с использованием поликлональных антител к 20 наиболее консервативным аминокислотам N-концевого домена транскрипционных факторов семейства NF1. Выбранный нами иммунохеми-люминисцентный метод предусматривает использование экстремально гидрофобной мембраны из поливинилденфлуорида, обладающей высокой способностью связывать биомолекулы, в частности белки, имеющие молекулярную массу более 30 кДа. Детекция основана на усиленном варианте хемилюминесцентной реакции, в которой пероксидаза хрена (конъюгированная с вторичными антителами) катализирует окисление люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона), сопровождаемое ярким свечением с максимумом при 482 нм. Чувствительность метода составляет 1-10 пкг белка.
После разделения белков в 12 %-ном ПААГ, осуществляли электроперенос на PVDF-мембрану. Для проверки полноты переноса гель окрашивали кумасси G-250. Отсутствие окрашенных полос позволяло считать перенос белков полным. Далее мембрану
М 1 2 3 М 1 2 3 4
Рис. 3. Спектр транскрипционных факторов семейства NF1 в частично очищенном белковом экстракте из ядер печени крыс и в экстракте ядерных белков, полученных из клеток HTC, после иммуноблоттинга а: 1 — набор стандартных белков (Fermentas), 5 мкг; 2 — рекомбинантный NF1-C1, 0,1 мкг (положительный контроль); 3 - частично очищенная фракция ядерных белков, 2 мкг; б: 1 — набор стандартных белков (Fermentas),
5 мкг; 2 - тотальный гистон печени крыс (отрицательный контроль), 5 мкг; 3 — рекомбинантный NF1-C1, 0,1 мкг (положительный контроль); 4 — экстракт ядерных белков, полученный из клеток гепатомы крыс HTC, 0,5 мкг.
М — молекулярная масса, цифрами указаны молекулярные массы белков в кДа. Разделение белковых проб проводили в 12%-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS.
с перенесенными на нее белками анализировали с помощью иммунохемилюминисцент-ного метода.
На рис. 3, а и 3, б представлен результат сканирования и обработки в программе Adobe Photoshop version CS пленок с экспозицией 30 мин, полученный в ходе типичного эксперимента. На рисунке видно, что белки-стандарты хорошо разделились и перенеслись, рекомбинантный NF1-C1 дал мажорную полосу, лежащую в области между 55 и 72 кДа. Тотальный гистон печени крыс в данных условиях не выявляется, что свидетельствует
о специфичности иммунодетекции. В частично очищенной фракции белков из ядер клеток печени (рис. 3, а) и в экстракте белков из ядер клеток НТС (рис. 3, б) выявлены мажорная и минорная полосы, локализованные также в области от 55 до 72 кДа.
Дальнейший анализ полученных результатов был проведен с использованием программы TotalLab, version 2.0. Исходя из молекулярных масс белков стандартов, эта программа позволяет достаточно точно определить молекулярные массы исследуемых белков. Было показано, что при данном разделении зависимость молекулярных масс белков-стандартов от длины пробега является логарифмической.
Исходя из анализа результатов трех независимых экспериментов, молекулярные массы идентифицированных авторами белков составляют 62 и 55 кДа, причем интенсивность полосы 62 кДа больше, чем интенсивность полосы 55 кДа. Молекулярная масса рекомбинантного белка NF1-C1 составляет 63 кДа, что соответствует данным фирмы-производителя. Таким образом, можно сделать вывод о том, что идентифицированный белок из семейства транскрипционных факторов NF1 близок по молекулярной массе рекомбинантному белку NF1-C1. Молекулярная масса различных изоформ транскрипционных факторов NF1 находится в пределах от 30 до 65 кДа [8]. Исходя из данных литературы
[7, 9, 18], можно сделать вывод, что полученное значение молекулярной массы около 62 кДа совпадает со значениями молекулярной массы КБ1-С1 из печени крысы и мозга крысы, полученными другими авторами.
Что представляет собой нижняя полоса (55кДа), пока не ясно. Возможно, что это непроцессированный предшественник (известно, что в печени присутствуют процесси-рованные белки КБ1 массой 62 кДа [14]). Более вероятным представляется, что данная полоса соответствует другой изоформе — продукту гена п/1-а с молекулярной массой 56 кДа.
Таким образом, методом иммуноблоттинга показано, что в частично очищенной фракции ядерных белков из печени крыс и экстракте белков из ядер клеток гепатомы транскрипционные факторы семейства представлены в виде двух электрофоретических фракций. Молекулярные массы идентифицированных транскрипционных факторов семейства в клетках гепатомы крыс и в клетках печени крыс составляют 62 кДа (ма-
жорная полоса) и 55 кДа (минорная полоса), что соответствует литературным данным.
Литература
1. Чихиржина Г. И., Аль-Шехадат Р. И., Чихиржина Е. В. Транскрипционные факторы семейства ядерных белков 1 (NF1). Роль в ремоделировании хроматина // Молек. биол. 2008. Т. 42. С. 388-404.
2. Чихиржина Г. И., Романовская Е. В. Гиперчувствительность к ДНКазе1 5'-фланкирующей области гена триптофаноксигеназы в рекомбинантной ДНК и реконструированном на ней хроматине // Молек. биол. 1993. Т. 27. С.132-142.
3. Чихиржина Г. И., Романовская Е. В., Назарова Н. Ю., Федорова С. А. Взаимодействие регуляторной области гена триптофаноксигеназы с транскрипционными факторами семейства ядерных факторов 1 (NF1) // Цитология. 1999. Т. 41. С. 939-944.
4. Baldwin A., Pirisi L., Creek K. E. NFI-Ski interactions mediate transforming growth factor beta modulation of human papillomavirus type 16 early gene expression // J. Virol. 2004. Vol. 78, P. 3953-3964.
5. Becker P., Renkawitz R., Schutz G. Tissue-specific DNasel hypersensitive sites in the 5’- flanking sequences of the tryptophan oxygenase and the tyrosine aminotransferase genes // J. EMBO. 1984. Vol. 3, P. 2015-2020
6. BlomquistP., Belikov S., Wrange O. Increased nuclear factor 1 binding to its nucleosomal site mediated by sequence-dependent DNA structure // Nucleic Acids Res. 1999. Vol. 27. P. 517-525.
7. Chu H., Fischer H. W., Osborne T. F., Comb J. M. NF-I proteins from brain interact with the proenkephalin cAMP inducible enhancer // Nucleic Acids Research. 1991. Vol. 19. P. 2721-2728.
8. Danesch U., Gloss B., Schmid W. Glucocorticoid induction of the rat tryptophan oxygenase gene is mediated by two widely separated glucocoiticod responsible elements // EMBOJ. 1987. Vol. 6. P. 625-630.
9. Gil G., Smith J. R., Goldstein J. L., Slaughter C. A., Orth K., Brown M. S., Osborne T. F. Multiple genes encode nuclear factor 1-like proteins that bind to the promoter for 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P 8963-8967.
10. Gopalan S. M., Wilczynska K. M., Konik B. S., Bryan L., Kordula T. Nuclear factor-1-X regulates astrocyte-specific expression of the 1-antichymotrypsin and glial fibrillary acidic protein genes // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281. P. 13126-13133.
11. Gronostajski R. M. Roles of the NFI/CTF gene family in transcription and development // Gene. 2000. Vol. 249. P. 31-45.
12. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.
13. Laniel M. A., Poirier G. G., Guerin S. L. Nuclear factor 1 interferes with Sp1 binding through a composite element on the rat poly (ADP-ribose) polymerase promoter to modulate its activity in vitro // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 23. P. 20766-20773.
14. Mermod N., O’Neill E. A., Kelly T. J., Tjian R. The proline-rich transcriptional activator of CTF/NF-I is distinct from the replication and DNA binding domain // Cell. 1989. Vol. 58. P. 741-753.
15. Nowock J., Sippel A. E. Specific protein-DNA interaction at four sites flanking the chicken lysozyme gene // Cell. 1982. Vol. 30. P 607-615.
16. O'Neill L. P., Turner M. B. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP // Methods 2003. Vol. 31. P. 76-82.
17. OsadaS., ImagawaM., Nishihara T. Organization of gene structure and expression of nuclear factor
1 family in rat // DNA Seq. 2005. Vol. 16. P. 151-155.
18. Paonessa G., Gounari F., FrankR., Cortese R. Purification of a NF1-like DNA-binding protein from rat liver and cloning of the corresponding cDNA // EMBO J. 1988. Vol. 7(10). P. 3115-3123.
19. RuppR., Kruse U., Multhaup G., Gobel U., Beyreuther K., SippelA. Chicken NFI/TGGCA proteins are encoded by at least three independent genes: NFI-A, NFI-B and NFI-C with homologues in mammalian genomes// Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18. P. 2607-2616.
20. Schule R, MullerM, Otsuka-Murakami H, Renkawitz R. Cooperativity of the glucocorticoid receptor and the CACCC-box binding factor // Nature. 1988. Vol. 332(6159). P. 87-90.
