CC BY
23Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 19 (58). 2006. № 4. С. 111-116.
УДК 579.843+579.222
ИДЕНТИФИКАЦИЯ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЧЕРНОГО И АЗОВСКОГО МОРЕЙ
Кацев А. М., Макемсон Дж.
Светящиеся бактерии интенсивно изучаются во всем мире, так как представляют собой не только интересный природный феномен, но и основу для большого количества биолюминесцентных методов анализа, которые широко используются на практике. Совсем недавно эти бактерии послужили основой для открытия нового явления общебиологического значения: quorum sensing, химического языка бактерий [1]. Этот генетический механизм, открытый впервые у морских светящихся бактерий V. fischeri и V. harveyi, позднее был обнаружен среди многих других видов грамотрицательных и грамположительных бактерий, как регулятор проявления многочисленных свойств, включая патогенные.
Несмотря на значительный прогресс в изучении физиологии, биохимии и генетики светящихся бактерий, многие вопросы их экологии и биологии люминесценции остаются не ясными. В этой связи, светящиеся бактерии Черного и Азовского морей являются практически не изученными объектами, которые в силу особенностей данных акваторий (низкая соленость, значительные перепады температур и др.) представляют большой интерес.
Целью работы было идентификация и изучение особенностей светящихся бактерий, выделяемых из Черного и Азовского морей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы 23 штамма светящихся бактерий, выделенных из Черного и Азовского морей на территории Крыма.
Выделение штаммов светящихся бактерий проводили из прибрежной морской фауны и образцов морской воды после концентрирования.
Для выращивания и очистки бактерий использовали среду, содержащую пептон - 5 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 30, K2HPO4*7H2O - 15 г/л, (NH4)2HPO4 -0,5 г/л, MgSO4 - 0,1 г/л, CaCo3 - 0,2 г/л, глицерин - 3 мл/л, а также другие твердые и жидкие питательные среды, содержащие 1-3% NaCl. Температурный режим варьировали от 4 до 370С и подбирали экспериментально. Анализ биолюминесценции проводили визуально в темной комнате после 5 - 15 мин адаптации глаз и количественно, с помощью биолюминометра БЛМ 8801 (СКТБ
«Наука», Красноярск). Бактерии хранили в анаэробных условиях (под вазелиновым маслом в столбиках агара), а также при -200С с криоконсервантами.
Идентификацию выделенных штаммов светящихся бактерий проводили в соответствии с существующими рекомендациями по идентификации бактерий семейства Vibrionacea и рекомендациями по быстрой идентификации фотобактерий [2, 3]. При этом оценивали: морфологические, тинкториальные свойства бактерий; характеристики их роста и биолюминесценции при различных температурах; ферментацию сахаров; накопление клетками ß-полиоксибутирата, а также ферментативные свойства.
Биохимическую идентификацию проводили путем определения типа кинетики люциферазной реакции. Для этого бактерии культивировали в колбах в режиме постоянного перемешивания в течение суток. После чего их разрушали ультразвуковой дезинтеграцией (UD-11 "Techpan", Польша) и/или осмотическим лизисом, с последующим выделением белковых фракций, содержащих люциферазу. Для выделения и очистки фермента использовали осаждение сульфатом аммония и ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе (Reanal, Венгрия) [4, 5]. Кинетику люциферазной реакции изучали с использованием трех альдегидов: деканаля (Aldrich, Germany), додеканаля и тетрадеканаля (Fluka, Switzerland). Для этого регистрировали изменения биолюминесценции во времени (люминометр БЛМ-8801 с самописцем), в системе: 20 мкл препарата люциферазы (разведения подбирались экспериментально), 20 мкл 0,001 - 0,01% водно-спиртовой эмульсии альдегида. Инициирование реакции проводили быстрым введением (через дозатор А-2) 0,5 мл 10-5 М фотовосстановленного ФМНН2, содержащего 10-3 М ЭДТА. По полученным графическим зависимостям определяли время полузатухания биолюминесценции (ii/2), которое использовали для сравнения кинетики люциферазных реакций, выделенных штаммов [6].
Фенотипирование выделенных штаммов проводили с использованием системы BIOLOG (Biolog, USA): планшеты Biolog GN2, идентификационной система Microstation ID system, программа MicroLog System [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Первые опыты по выделению светящихся бактерий из воды Черного моря показали, что свободноживущих форм содержится крайне мало. Как в летнее, так и в зимнее время, не удалось получить ни одного светящегося изолята. Последующий анализ некоторых обитателей прибрежной зоны Черного моря (рыбы, мидии и тп), а также посевы с кожных покровов Черноморского катрана дали возможность выделить сапрофитные формы светящиеся бактерии, а затем и получить их в чистом виде. Всего было выделено 14 изолятов, таблица 1.
При проведении исследований на Азовском море в летний период (г. Щелкино, 2001 г), когда вода в море прогревалась до 30 - 350С, светящиеся бактерии обнаруживались повсеместно, как в виде свободноживущих форм в воде, так и в виде сапрофитных. Всего было получено 9 изолятов.
Для идентификации выделенных штаммов светящихся бактерий, прежде всего, оценивали их температурные оптимумы роста, способность расти при различных
концентрациях хлорида натрия, наличие желтого пигмента (характерного только для V. fischeri и V. logei). На следующем этапе изучали ферментацию бактериями различных сахаров с образованием кислот (ряды Гиса), оксидазную и каталазную активности. Эти исследования выявили аномально высокие температуры роста (370С и выше) и биолюминесценции (35 - 370С) для большинства бактерий, выделенных из Азовского моря. По наличию пигмента, оксидазной активности и оптимальным температурам роста, все выделенные штаммы были разделены на рода Vibrio (14 изолятов) и Photobacterium (9 изолятов) [4].
Таблица 1.
Светящиеся бактерии, выделенные на территории Крыма.
Светящиеся бактерии V. fischeri V. logei V. harveyi P. phosphoreum P. leiognathi Vibrio sp.
Количество
выделенных штаммов: Черное море (14) • Вода • Фауна Азовское море (9) • Вода • Фауна 0 4 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 3 0 0 0 0 3 3 0 2 1 2
Температуры роста и люминесценции, 0С 20- 30 15- 20 25- 30 18- 25 28- 35 28- 35
Тип ферментативной кинетики с Быстрый Средний Медленный Средний Быстрый Медлен ный
додеканалем
Другой подход заключался в изучении кинетики люциферазной реакции с различными альдегидами. Люцифераза - фермент, катализирующий реакцию биолюминесценции, в ходе которой, восстановленный флавинмононуклеотид и альдегидов (с длиной цепи 10 - 16 углеродных атомов) окисляются кислородом. Многочисленные исследования с использованием додеканаля показали, что для рода Photobacterium и вида Vibrio fischeri характерен быстрый тип люциферазной кинетики с константами более 0,6 с-1, а для остальных светящихся представителей рода Vibrio - медленный, с константами менее 0,05 с-1 [7].
Изучение ферментативной кинетики выделенных штаммов проводилось с использованием трех разных альдегидов тетрадеканаля, додеканаля и деканаля. Реакции с тетрадеканалем позволила отличить вид P. phosphoreum от других видов этого рода и вида V. fischeri (для которых характерен быстрый тип люциферазной кинетики). Реакция с додеканалем позволила разделить штаммы с быстрыми и медленными кинетическими характеристиками и выделить особую группу с промежуточными значениями т1/2, в которую вошли все Черноморские штаммы P. Phosphoreum. Обычно не используемая в систематике реакция люциферазы с
деканалем в нашем случае позволила отделить вид Photobacterium \eiognathi от всех других видов [4].
Совмещение этих двух подходов дало возможность провести предварительное определение видовой принадлежности большинства выделенных штаммов, представленное в таблице 1.
Рис. 1. Кластерный анализ фенотипов выделенных штаммов светящихся бактерий в сравнении с существующими кластерами.
Для окончательного установления вида было проведено фенотипирование 14 выделенных штаммов с использованием планшетов Biolog GN2 (США), включающих в себя 96 субстратов-источников углерода и предназначенных для идентификации грамотрицательных бактерий. Полученные результаты обрабатывались с помощью программы MicroLog System путем сравнения с базой данных из 500 видов грамотрицательных бактерий и последующего кластерного анализа результатов, рис.1 (на рисунке выделенные штаммы, обозначены, шрифтом Times New Roman, без сокращений).
Проведенные исследования в целом подтвердили предварительную идентификацию выделенных светящихся бактерий и выявили группу, достоверно отличающуюся от всех известных видов. В неё вошли пять штаммов P.leiognathi, выделенных из Азовского моря (вода, моллюски, рыбы) и обладающих аномально высокими температурными оптимумами. Остальные штаммы с быстрой кинетикой люциферазной реакции имели фенотип сходный с известными видами P. leiognathi,
P. phosphoreum и Vibrio fischeri, а штаммы с медленной кинетикой были фенотипически похожи на виды V. harveyi and V. vulnificus.
44
0,8 1.6 2,4 3,2
NaCl, %
Рис. 2. Количество субстратов Biolog, употребляемых бактериям при различном содержании NaCl в среде. 1 - Vibrio. sp W3; 2 - Vibrio. sp Mol; 3 -Vibrio. sp F8.
Сравнение роста и потребления субстратов (Biolog) выделенными штаммами при различном содержании соли в среде показало, что максимальные значения этих характеристик наблюдались при пониженной солености (1,5 - 2%). Количество потребляемых субстратов возрастало на 8 - 10 единиц, рис. 2. Для максимальной люминесценции бактериям необходима концентрация NaCl 2,5 - 3%.
ВЫВОДЫ
1. Из Черного и Азовского морей выделены и идентифицированы 23 штамма светящихся бактерий. Из них: из Черного моря - 14 штаммов, из Азовского - 9 штаммов.
2. С использованием планшетов Biolog GN и кластерного анализа установлено, что группа бактерий, идентифицированная, как P. leiognathi, достоверно отличается от всех известных кластеров грамотрицательных бактерий. Эти же бактерии обладали высокими температурными оптимумами, не характерными для светящихся бактерий.
3. Обнаружено, что метаболическая активность светящихся бактерий (рост и потребление субстратов) выше при низких концентрациях соли (1,5-2,0%), в то время как биолюминесценция максимальна при 2,5 - 3,0% хлорида натрия.
Список литературы
1. Michiko E. Taga and Bonnie L. Bassler. Chemical communication among bacteria //PNAS. - 2003. -V. 100, suppl. 2. - P. 14549-14554.
2. Определитель бактерий Берджи. Т. 1 / Под ред. Дж.. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, С. Уильямса. -М.: Мир, 1997. - 432 с.
3. Светящиеся бактерии / Гительзон И. И., Родичева Э. К., Медведева С. Е. и др. - Новосибирск: Наука, 1984.- 279 с.
4. Малыгина В. Ю., Кацев А. М. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей // Экология моря. - 2003. - Т. В. 64. - C. 18- 23.
5. Кацев А. М. Некоторые характеристики Черноморских светящихся бактерий и их прикладное значение // Прикладн биохимия и микробиология. - 2002. - №2 - C. 189-192.
6. Воробьева Т. И., Заворуев В. В., Межевикин В. В., Примакова Г. А. Кинетические свойства люцифераз и таксономия светящихся бактерий // Микробиология. - 1982. - Т. 51, вып.3. - С. 420423.
7. Makemson, J. C., N. R. Fulayfil, W. Landry, L. M. V. Ert, C. F. Wimpee, E. A.Widder, and J. F. Case. Shewanella woodyi sp. nov., an exclusively respiratory luminous bacterium isolated from the Alboran Sea // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1997. - V.47. - P. 1034 - 1039.
Поступила в редакцию 13.12.2006 г.
