CC BY
14
DOI: 10.17650/2313-805X-2023-10-2-117-125
C«D]
Н.Е. Арноцкая, Т.И. Кушнир, И.А. Кудрявцев, А.А. Митрофанов, А.Х. Бекяшев, В.Е. Шевченко
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115522 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Валерий Евгеньевич Шевченко vshev2015@yandex.ru
Ключевые слова: глиобластома, протеом, спинномозговая жидкость, масс-спектрометрия
Для цитирования: Арноцкая Н.Е., Кушнир Т.И., Кудрявцев И.А. и др. Идентификация предиктивных маркеров в спинномозговой жидкости больных глиобластомой. Успехи молекулярной онкологии 2023;10(2):117-25. DOI: 10.17650/2313-805Х-2023-10-2-117-125
m сч о сч
сч
Идентификация предиктивных маркеров в спинномозговой жидкости больных §
_I
глиобластомой
о и Z
о
ОС <
о ж.
ю
Введение. Глиобластома (ГБ) пока неизлечима, несмотря на достижения в терапии других злокачественных солид- Щ ных опухолей. Тактика лечения ГБ основывается исключительно на гистопатологических признаках, томографиче-
а
<
ской визуализации опухоли и ее геномном анализе (соматические мутации в генах изоцитратдегидрогеназы, статус метилирования промотора гена 06-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза). Для адаптации лечения к самой последней эволюции опухоли молекулярная информация должна поступать регулярно на протяжении всего курса терапии. Однако опухолевая ткань часто недоступна для диагностики при прогрессировании заболевания. В связи с этим актуальной становится разработка менее инвазивных методов, например анализа протеома биологических жидкостей пациентов. Особый интерес представляет спинномозговая жидкость (СМЖ) - важный источник биомаркеров заболевания для мониторинга наличия и прогрессирования заболевания.
Цель исследования - идентификация протеомных предиктивных биомаркеров в СМЖ больных ГБ. Материалы и методы. В ходе исследования были использованы образцы СМЖ пациентов, протеомная масс-спектрометрия высокого разрешения, современные биохимические методы и биоинформатические технологии. Результаты. Впервые проведен анализ протеомов образцов СМЖ больных ГБ, полученных до и спустя 7 дней после удаления первичной опухоли. Идентифицированы потенциальные биомаркеры ГБ. После их валидации с использованием открытых баз данных отобраны 11 протеомных предиктивных маркеров ГБ (S100A9, S100A8, PLA2G15, PPIB, LTBP2, VIM, LAMBI, STC1, NRP1, COL6A1, HSPA5) и проведена оценка их роли в молекулярных механизмах глио- i магенеза.
Заключение. Предложенная панель протеомных предиктивных биомаркеров СМЖ больных ГБ может в дальнейшем О использоваться при разработке тест-систем для оценки эффективности терапии и раннего выявления рецидивов заболевания.
О
а.
в;
£
Ж.
и >
Identification of predictive markers in the cerebrospinal fluid of patients with glioblastoma
N.E. Arnotskaya, T.I. Kushnir, I.A. Kudryavtsev, A.A. Mitrofanov, A.Kh. Bekyashev, V.E. Shevchenko
N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522, Russia
Contacts: Valery Evgenievich Shevchenko vshev2015@yandex.ru
Introduction. Glioblastoma (GB) is not yet curable despite recent advances in the treatment of other malignant solid tumors. The management of GB is based solely on histopathological features, imaging of the tumor and its genomic analysis (somatic mutations in the isocitrate dehydrogenase genes, methylation status of the O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene promoter). To adapt the treatment to the most recent tumor evolution, molecular information should be received regularly throughout the course of therapy. However, tumor tissue is often not available for diagnosis as the disease progresses. In this regard, the development of less invasive methods, such as analysis of the proteome of biological fluids of patients, is of particular interest. Cerebrospinal fluid (CSF) is an important source disease biomark-ers to monitor the presence and progression of the disease. Aim. To identify proteomic predictive biomarkers in the CSF of patients with GB.
m сч о сч
сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
Materials and methods. During the study, samples of patients' CSF samples, high-resolution proteomic mass spectrometry, modern biochemical methods and bioinformatic technologies were used.
Results. For the first time, the analysis of proteomes of CSF samples of patients with GB obtained before and 7 days after the removal of the primary tumor was carried out. Potential biomarkers of GB have been identified. After their validation using open databases, 11 proteomic predictive markers of GB (S100A9, S100A8, PLA2G15, PPIB, LTBP2, VIM, LAMB1, STC1, NRP1, COL6A1, HSPA5) were selected and their role in the molecular mechanisms of gliomagenesis was assessed. Conclusion. The proposed panel of proteomic predictive CSF biomarkers in GB patients can be further used in the development of test systems for assessing the effectiveness of therapy and early detection of disease relapses.
Keywords: glioblastoma, proteome, cerebrospinal fluid, mass spectrometry
For citation: Arnotskaya N.E., Kushnir T.I., Kudryavtsev I.A. et al. Identification of predictive markers in the cerebrospinal fluid of patients with glioblastoma. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2023; 10(2): 117-25. (In Russ.). DOI: 10.17650/2313-805X-2023-10-2-117-125
О Ж.
to
< >
a
<
о
a. те
£
О
ж.
и >
ВВЕДЕНИЕ
Наиболее распространенная и агрессивная первичная опухоль головного мозга глиобластома (ГБ) пока неизлечима, несмотря на достижения в терапии других злокачественных солидных опухолей. Общая выживаемость пациентов с этой патологией остается на уровне 15—20 мес [1]. Диагностика ГБ и последующая тактика ее лечения долгое время основывались исключительно на гистопатологических признаках. Полногеномный анализ глиом выявил знаковые соматические мутации в генах изоцитратдегидрогеназы (ГОН) [2], идентифицировал транскрипционно и эпигенетически определенные подмножества глиом [3] и пролил свет на их мутационный ландшафт [4]. Тем не менее статус метилирования промотора гена MGMT (06-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза) остается основным параметром, определяющим тактику лечения больных глиомами, и предиктором их выживаемости [5]. Однако метилирование ДНК MGMT может быть прогностическим биомаркером для ответа на лечение только у пациентов с ГБ классического подтипа [6].
Терапия ГБ начинается с нейрохирургической резекции опухоли с последующими лучевой терапией и введением темозоломида [6]. Несмотря на этот режим, данная опухоль практически всегда рецидивирует, что связано с различными механизмами резистентности к терапии [7]. Для того чтобы адаптировать лечение к самой последней эволюции опухоли, молекулярная информация должна поступать регулярно на протяжении всего курса терапии. Однако опухолевая ткань часто недоступна для диагностики при прогрес-сировании ГБ, так как повторные операции трудновыполнимы, сопряжены с риском и часто не приносят пользы больному с точки зрения выживаемости по сравнению с удалением первичной опухоли [8].
В связи с вышесказанным необходимо разработать менее инвазивные методы, например анализ протеома биологических жидкостей пациентов. Однако идентификация белковых маркеров часто затрудняется использованием антител, которые позволяют одновременно обнаруживать только ограниченное количество белков. Протеомная масс-спектрометрия (МС) стала мощной технологией, преодолевшей эти ограничения.
Данный метод позволяет идентифицировать и количественно определять тысячи белков в однократном эксперименте [9]. Протеомная МС уже использовалась при открытии предиктивных биомаркеров некоторых онкологических заболеваний, таких как гепато-целлюлярная карцинома [10] и рак яичников [11].
Особый интерес представляют проксимальные жидкости, такие как спинномозговая жидкость (СМЖ) и кистозная жидкость, являющиеся важным источником биомаркеров заболевания для мониторинга наличия и прогрессирования заболевания. Спинномозговая жидкость — внеклеточная жидкость, циркулирующая в подпаутинном (субарахноидальном) пространстве головного и спинного мозга, желудочках и цистернах головного мозга. Она транспортирует биологические вещества, удаляет отходы и токсины, выделяемые мозгом. Исследование СМЖ имеет большое значение в диагностике многих неврологических заболеваний воспалительной и инфекционной природы, а также ряда опухолевых процессов.
В настоящем исследовании впервые проведен анализ протеомов образцов СМЖ больных ГБ, полученных до и после удаления первичной опухоли. Статистически значимые карты дифференциально экспрессиро-ванных белков (ДЭБ) использовались для идентификации потенциальных предиктивных биомаркеров заболевания и оценки их роли в молекулярных механизмах глиомагенеза. После их валидации с использованием открытых баз данных были отобраны 11 про-теомных маркеров СМЖ, которые, по нашему мнению, могут применяться для оценки эффективности терапии ГБ и раннего выявления рецидивов заболевания.
Цель исследования — методом протеомной МС высокого разрешения провести картирование протеома СМЖ больных ГБ для идентификации потенциальных предиктивных маркеров заболевания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение клинических образцов. Образцы СМЖ больных ГБ получали в отделении нейрохирургии Научно-исследовательского института клинической онкологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина»
Минздрава России. Проводилась люмбальная пункция до удаления первичной опухоли и спустя 7 дней после операции. Клинические данные пациентов, участвовавших в исследовании, представлены в табл. 1.
Приготовление образцов спинномозговой жидкости для масс-спектрометрии. Спинномозговую жидкость центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 10 мин, аликвотировали и хранили при температуре —80 °C. Две объединенные аликвоты СМЖ до (СМЖдо) и после (СМЖ ) хирургического вмешательства готови-
v после7 r J г
ли из 9 образцов СМЖ, взятых у больных ГБ до и после операции: первая содержала 950 мкг, вторая — 975 мкг белка соответственно. Спинномозговую жидкость подвергали ультрафильтрации для удаления низкомолекулярных соединений ранее описанным методом [12].
Таблица 1. Клинические данные больных глиобластомой (ГБ), участвовавших в исследовании
Table 1. Clinical data of patients with glioblastoma (GB) participating in the study
Пациент Клинический диагноз Clinical diagnosis Пол Sex Возраст
Patient Age
1 ГБ левой височной доли головного мозга GB of the left temporal lobe of the brain М M 58
2 ГБ левой теменно-затылочной области головного мозга GB of the left parieto-occipital region of the brain Ж F 65
3 ГБ правой височной доли головного мозга GB of the right temporal lobe of the brain М M 78
4 ГБ правой теменно-затылочной области головного мозга GB of the right parietal-occipital region of the brain М M 57
5 ГБ правой затылочной доли головного мозга GB of the right occipital lobe of the brain М M 58
6 ГБ левой лобной доли головного мозга с кровоизлиянием GB of the left frontal lobe of the brain with hemorrhage Ж F 63
7 ГБ правой лобной доли головного мозга GB of the right frontal lobe of the brain Ж F 57
8 Анапластическая астроцитома правой лобной доли головного мозга Anaplastic astrocytoma of the right frontal lobe of the brain Ж F 34
9 ГБ правой лобной доли головного мозга GB of the right frontal lobe of the brain М M 68
После трипсинолиза объединенных образцов СМЖ [12] их упаривали при +30 °С в центрифужном концентраторе Labconco CentriVap (США) и использовали для предварительного фракционирования триптических пептидов.
Фракционирование продуктов трипсинолиза биообразцов. Продукты трипсинолиза образцов СМЖ (100 мкг) растворяли в 50 мкл 0,1 % муравьиной кислоты и фракционировали на колонке Zorbax 300 Extend-C18 (2,1 х 500 мм; 3,5 мкм, Agilent, США) на модульном хроматографе для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent, США), оборудованном коллектором фракций и ультрафиолетовым (УФ) детектором. Объем введенной пробы составлял 20 мкл, температура колонки — 25 °C; детектирование проводили по УФ-поглощению при длине волны 214, 254 и 280 нм. Подвижная фаза состояла из фаз A (20 мМ NH4OH, рН 10) и B (20 % фазы A плюс 80 % ацетонитрила). Колонку уравновешивали фазой А в течение 30 мин перед вводом образца. Градиент подвижной фазы при скорости потока 300 мкл/мин устанавливали следующим образом: а) от 0 до 5 мин — 0 % фазы B; б) от 5 до 35 мин — от 0 до 35 % фазы B; в) от 35 до 45 мин — от 35 до 100 % фазы B; г) от 45 до 60 мин — 100 % фазы B; д) от 60 до 70 мин - от 100 до 0 % фазы B. Всего было собрано 12 фракций от 0 до 50 мин с интервалами 1,5 и 3 мин. Фракции упаривали досуха при 30 °С на центрифужном концентраторе Labconco CentriVap (Labconco, США) и повторно разбавляли 100 мкл 0,1 % муравьиной кислоты для МС-анализа.
Масс-спектрометрический анализ. Анализ трипти-ческих пептидов проводили с использованием нано-ВЭЖХ-Dionex Ultimate 3000 и масс-спектрометра LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific Inc., США) с источником ионизации NanoSpray [12]. Масс-спектро-метрические данные обрабатывали с помощью программ MaxQuant 1.6.17.0 (Biochemistry Computational Systems, Biochemistry Max Planck, Martinsried, Германия) и Perseus 1.6.0.7 (Max Planck Institute of Biochemistry, Германия).
Биоинформатический анализ. Биоинформатиче-ский анализ проводили c использованием программы DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery; https://david.ncifcrf.gov), а также открытой базы данных PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed). Информацию по экспрессии матричной РНК (мРНК) и белков в опухолевой и нормальной тканях получали из баз «Атлас ракового генома» (The Cancer Genome Atlas, TCGA), Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) и International Cancer Proteogenome Consortium (ICPC). Анализ данных для группы мРНК в базе TCGA с учетом субтипов ГБ выполняли с помощью программы Glioblastoma BioDiscovery Portal (GBM-BioDP) (https://gbm-biodp.nci.nih.gov/ #genes). Корреляцию между экспрессией генов и их клинической значимостью анализировали с использованием UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/index.html).
m сч о сч
сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
о ж
ю ш и
Z <
>
а
<
о m
а.
в;
£ m
о ж.
U >
m сч о сч
сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю ш и
Z <
>
а
<
о
а. те
о ж.
и >
РЕЗУЛЬТАТЫ
Картирование протеома спинномозговой жидкости больных глиобластомой до и после хирургического вмешательства. Для идентификации потенциальных пре-диктивных маркеров ГБ в настоящей работе впервые выполнен сравнительный протеомный анализ объединенных образцов СМЖ и СМЖ 9 больных ГБ
г до после
(см. табл. 1), полученных до и после хирургического удаления первичной опухоли. Мы использовали labelfree количественный метод ВЭЖХ с масс-спектроме-трическим детектированием (нано-ВЭЖХ-МС/МС) для панорамного картирования протеомов 2 типов образцов (в триплетах) без предварительного снижения уровней высокопредставленных белков.
Протеомный анализ триптических пептидов 2 образцов СМЖ с использованием программы MaxQuant позволил идентифицировать в общей сложности 911 белков путем сопоставления тандемных (МС/ МС) масс-спектров с пептидными последовательностями в базе данных UniProtKB_human с ложным уровнем обнаружения (false discovery rate, FDR) 1 % для тройных повторов 2 видов образцов. В ходе обработки данных с помощью программы Perseus было распознано следующее количество белков: образец 01 (СМЖдо) — 691 белок по 5176 пептидам (2605 уникальных пептидов); образец 02 (СМЖпосле) — 837 белков по 5411 пептидам (2787 уникальных пептидов). Из них 69 % протенинов идентифицировали по совпадению 2 и более пептидов и 31 % — по совпадению 1 пептида. Процент сиквенс-по-крытия исследуемых белков изменялся от 0,2 до 97,4 %. Коэффициент корреляции Пирсона между образцами СМЖ и СМЖ варьировал от 0,81 до 0,90.
после до
Дифференциально экспрессированными оказались 266 протеинов; они присутствовали в обоих образцах СМЖ и имели статистически значимые изменения экспрессии в СМЖ по сравнению с СМЖ (p <0,05)
до после
c кратностью изменения >2 или <0,5. Экспрессия 128 белков была выше, а 138 белков — ниже в СМЖ
до
по сравнению с СМЖ . Увеличение экспрессии бо-
после
лее чем на порядок наблюдали у 28 ДЭБ, включая HSP90AA1, LTF, GOLPH2, CCDC42, ATL2, ARFIP1 и MERP1. Одновременно снижение экспрессии более чем на порядок отмечали для 31 ДЭБ, включая GPR37, VCAN, F10, SHISA5, MRC1L1, ATP1A3 и TGOLN2.
Результаты биоинформатического анализа. Данные протеомного картирования ДЭБ СМЖ до и после удаления первичной опухоли подвергали сравнительному биоинформатическому анализу. Каждый из 266 ДЭБ классифицировали по клеточной локализации с использованием открытых баз данных, указанных выше. Если один белок был обнаружен более чем в одном клеточном компартменте, он также учитывался. Большую часть ДЭБ составляли сигнальные протеины (63,1 %). Белки СМЖ в основном были локализованы во внеклеточной области (49,4 %), межклеточном пространстве (13 %), экзосомах (43,9 %), лизосомах (32,4 %) и плазматической мембране (37,5 %).
Классификация белков СМЖ по биологическим процессам показала, что большинство протеинов вовлечены в сигнальную трансдукцию (28,1 %), клеточную коммуникацию (27,3 %), рост клеток и их развитие (16,1 %), метаболизм белков (15 %) и общий метаболизм (12,7 %).
Основная часть белков СМЖ выполняла молекулярные функции, проявляя активность клеточных адгезивных молекул (7,9 %), внеклеточных матрикс-ных компонентов (6,7 %), рецепторную (6 %) и каталитическую (4,9 %).
Идентификация потенциальных предиктивных маркеров глиобластомы. Проводили сравнительный анализ
Таблица 2. Изменение экспрессии потенциальных предиктивных маркеров спинномозговой жидкости (СМЖ) после хирургического удаления первичной глиобластомы (p <0,05)
Table 2. Changes in the expression ofpotential predictive cerebrospinal fluid (CSF) markers after surgical removal of the primary glioblastoma (p <0.05)
Ген Gene Белок Protein СМЖ / до/ СМЖ после
S100A9 Протеин S100-A9 Protein S100-A9 13,7
PLA2G15 Группа XV фосфолипаза A2 Group XV phospholipase A2 6,2
PPIB Пептидил-пролил-цис-транс- изомераза B Peptidyl-prolylcis-trans isomerase B 5,8
LTBP2 Бета-связывающий белок 2 латентного трансформирующего фактора роста Latent-transforming growth factor beta-binding protein 2 4,2
VIM Виментин Vimentin 3,1
LAMB1 Субъединица ламинина бета-1 Laminin subunit beta-1 2,6
STC1 Станниокальцин-1 Stanniocalcin-1 2,6
S100A8 Протеин S100-A8 Protein S100-A8 2,2
NRP1 Нейропилин-1 Neuropilin-1 2,2
COL6A1 Цепь коллагена альфа-1 (VI) Collagen alpha-1 (VI) chain 1,8
HSPA5 Белок 78 кДа, регулируемый глюкозой 78 kDa glucose-regulated protein 1,5
Примечание. СМЖо — образцы СМЖ, взятые до операции; СМЖ — образцы СМЖ, взятые после операции.
после 1 ' ' 11
Note. CSF,. — CSF samples taken before surgery; CSF „ — CSF
before r J os' after
samples taken after surgery.
протеомных карт СМЖ больных ГБ, полученных до удаления первичной опухоли и спустя 7 дней после операции. Повышенное внимание уделяли 128 ДЭБ, экспрессия которых снижалась после хирургического вмешательства. Дополнительную фильтрацию канди-датных протеинов осуществляли с учетом их участия в патогенезе ГБ или других злокачественных новообразований (PubMed), уровней этих белков и экспрессии их мРНК в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью головного мозга, взятой в районе первичной опухоли (базы TCGA, CPTAC, ICPC), а также клинической значимости. В результате были отобраны 11 кандидатных маркеров, включая 9 ДЭБ и COL6A1, HSPA5, данные по которым представлены в табл. 2. Проведенный анализ показал, что уровни 3 белков из этого списка (S100A9, PLA2G15, PPIB) в СМЖ больных ГБ после удаления опухоли снижались более чем в 5 раз.
Для оценки клинической значимости панели генов, кодирующих группу потенциальных предиктив-ных маркеров ГБ (S100A9, PLA2G15, PPIB, LTBP2, VIM, LAMBI, STC1, S100A8, NRP1, COL6A1, HSPA5), с помощью программы GBM-BioDP строили кривые Каплана—Майера для 4 субтипов ГБ (классического, мезенхимального, пронейрального и нейрального) на основе мультигенного прогностического индекса отношения рисков (ОР) (отношения риска события в определенный момент времени (t) в одной и другой группах) (рис. 1). Показатель относится к методам оценки выживаемости и оценивается при проведении регрессионного анализа. Отношение рисков связано с вероятностью того, что событие, не произошедшее к определенному моменту времени, случится в следующий интервал времени. Вероятность того, что событие в одной группе наступит раньше, чем в другой, может быть рассчитана на основании показателя ОР по формуле:
р = ОР/(1 + ОР).
Согласно данным, представленным на рис. 1, для всех субтипов ГБ наблюдаются статистически значимые значения HR c диапазоном изменения величин от 1,84 до 8,38, что указывает на достоверное увеличение показателей общей выживаемости больных ГБ при снижении мультигенного параметра.
ОБСУЖДЕНИЕ
На протяжении последних лет СМЖ активно изучается как перспективный источник биомаркеров глиом [13]. Протеомный анализ ликвора дал много полезной информации о потенциальных маркерах этих заболеваний, однако, к сожалению, большинство из них оказались низкоспецифичными и не нашли применения в клинической практике [14]. Описанная ситуация оправдывает необходимость продолжения исследований в данном направлении и поиска причин отрица-
тельного результата. Анализ литературы показал, в частности, что во всех более ранних работах в качестве контроля использовались образцы ликвора от больных неонкологическими патологиями, а вектор исследований в основном был направлен на идентификацию диагностических биомаркеров глиом.
В данном исследовании впервые выполнен сравнительный протеомный анализ СМЖ больных ГБ до и после хирургического удаления первичной опухоли. Такой подход позволяет более точно обнаруживать ДЭБ, имеющие отношение к опухолевому процессу, и формировать панель предиктивных маркеров. Полученные результаты указывают на значительные изменения в протеомном составе СМЖ пациентов спустя 7 дней после оперативного вмешательства, что подтверждается довольно большим количеством ДЭБ. Из 911 идентифицированных протеинов 14 % снижали экспрессию, а 15 % — повышали (p <0,05) более чем в 2 раза. Важно отметить, что внеклеточные белки составляли основную часть протеома СМЖ человека. Большая часть ДЭБ (55,4 %) участвовала в сигнальной трансдукции и клеточной коммуникации.
При идентификации потенциальных предиктив-ных маркеров основное внимание уделялось ДЭБ, уровни которых снижались после удаления первичной опухоли. В процессе отбора кандидатных белков проводили их многоступенчатую фильтрацию с применением открытых баз данных. Во-первых, оставили группу белков, уровни которых были значительно повышены в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью головного мозга (базы CPTAC и ICPC). Во-вторых, из полученного списка отобрали только белки с увеличенной экспрессией их мРНК в опухолевой ткани по отношению к норме (база TCGA). В-третьих, исключили протеины, для мРНК которых кривые Каплана—Майера статистически значимо не показывали увеличение показателей общей выживаемости больных ГБ. В результате получили список из 11 потенциальных предиктивных маркеров ГБ (S100A9, PLA2G15, PPIB, LTBP2, VIM, LAMB1, STC1, S100A8, NRP1, COL6A1, HSPA5).
Мультигенный анализ клинической значимости полученной тест-системы, по данным TCGA (AgilentG4502A_07_1 /2; 497 больных ГБ), выполнили с помощью программы GBM-BioDP с использованием модели пропорциональных интенсивностей Кокса. Согласно данным, представленным на рис. 1, снижение в опухоли экспрессии мРНК, отвечающих перечисленным выше белкам, приводит к увеличению показателей общей выживаемости пациентов с ГБ. Наибольший эффект наблюдался у больных с проней-ральным и нейральным субтипами ГБ.
Согласно данным, представленным в табл. 2, при удалении первичной опухоли уровни белков S100A8 и S100A9 в СМЖ больных ГБ снижались в 2,2 и 13,7 раза соответственно. Экспрессия S100A8/A9 значительно увеличена в мезенхимальном субтипе ГБ и в подгруппе
m сч о сч
сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о
а.
в;
£
о ж.
и >
m сч о сч
сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
-Ниже медианы / Below the median
100 -
80 .
60
о
и -О
^ "Й ь Р
ü 01 ш £
40
20 .
Логарифмическое значение величины p: 0,002 / Logrank p-value: 0.002 Прогностический индекс отношения рисков: 3,27; p = 0,003 / Predictive index hazard ratio: 3.27; p = 0.003
500 1000 1500 2000 Выживаемость, дни / Survival, days
-Выше медианы / Above the median
б
100 ■
Я ? 80 ■
60
40
и -о
^ "Й
i- 9 ^ ^
о „
о. <у
<и ¡с
со ^
20
Логарифмическое значение величины p: 0,037 / Logrank p-value: 0.037 Прогностический индекс отношения рисков: 1,84; p = 0,037 / Predictive index hazard ratio: 1.84; p = 0.037
500 1000 1500 2000
Выживаемость, дни / Survival, days
to ш U
z <
>
a
<
о
a. те
о ж.
100
80
60
o y
и -о
^ "Й i— о
^ r; о.
<u ¡c
40
20
Логарифмическое значение величины
p: 0 / Logrank p-value: 0 Прогностический индекс отношения рисков: 2,66; p = 0,002 / Predictive index hazard ratio: 2.66; p = 0.002
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Выживаемость, дни / Survival, days
1 I .0
0 о
u Qj
1 £
Ш
& u
I ^ -Ü ^
^ "Й i— о
^ r;
о „
o.
<u ¡c
СП
100 80 60 40 20 0
"-L Логарифмическое V
значение
величины p: 0 /
Logrank p-value: 0 i—,
Прогностический индекс
отношения рисков: 8,38;
p = 0 / Predictive index hazard \ 1
ratio: 8.38; p = 0 :i
200 400 600
Выживаемость, дни / Survival, days
800
Анализ выживаемости 497больных с классическим (а), мезенхимальным (б), пронейральным (в) и нейральным (г) субтипами глиобластомы на основе мультигенного прогностического индекса отношения рисков с использованием данных по матричным РНК потенциальных предиктивных маркеров из базы «Атласракового генома» (https://gbm-biodp.nci.nih.gov/#genes)
Survival analysis of 497patients with with classical (a), mesenchemal (б), pronural (в), and neural (г) subtypes of glioblastoma based on the multigenic prognostic index Hazard ratio using matrix RNA data ofpotential predictive markers from The Cancer Genome Atlas Database (https://gbm-biodp.nci.nih. gov/#genes)
U >
дикого типа IDH1, более агрессивном и с плохим прогнозом [15]. Концентрации S100A8/9 повышены в сыворотке крови больных ГБ, но только уровни S100A8 коррелировали с выживаемостью пациентов [15]. S100A8 /А9 высоко экспрессируются в опухолевых стволовых клетках и стимулируют миграцию и инвазию клеток глиомы [15].
Гипоксия идентифицирована как новый регулятор экспрессии S100A8/A9. В отличие от S100A8, уровни S100A9 и фактора, индуцируемого гипоксией, 1-a (hypo-xia-induced factor-1a, HIF-1a) заметно коррелировали со временем до рецидива [16].
LYPLA3. Этот белок кодируется геном PLA2G15, участвует в метаболизме липидов, обладает кальций-независимой активностью, опосредует внутри- и внеклеточную передачу сигналов и влияет на различные онкогенные процессы, включая миграцию клеток, инвазию, пролиферацию и ангиогенез [17]. J.E. Jang и соавт. обнаружили, что NFATC3-PLA2G15 FT (транскрипт слияния) регулирует клеточную пролиферацию в качестве гена-драйвера в клеточных линиях колорек-
тального рака, однако функциональные механизмы этого процесса пока не раскрыты [17].
PPIB. Данный белок регулирует свойства глиаль-ных клеток, ускоряя в них превращение транс-кон-формации в цис-конформацию протеинов, таких как GFAP и NDRG2, что приводит к изменению активности глиальных клеток [18]. В базах данных TCGA, Lembrandt и Severance отмечено увеличение экспрессии PPIB в зависимости от степени злокачественности глиомы. Клетки U87 и TS15—88 имели высокий уровень PPIB, коррелирующий с пролиферацией клеток ГБ. Также этот маркер регулирует рост глиомасфер через процесс убиквитинирования с помощью лигазы E3 [18].
LTBP2. Этот протеин является членом суперсемейства белков внеклеточного матрикса фибриллин / LTBP [19], играет большую роль в клеточной адгезии [20] и может косвенно модулировать активность трансформирующего фактора роста в (transforming growth factor-в, TGF-в), высвобождая LTBP1 из микрофибрилл. Участие LTBP2 в патогенезе злокачественных
а
0
0
0
0
в
г
0
0
0
опухолей остается неясным. Предложены молекулярные механизмы, объясняющие роль этого маркера как в развитии опухоли, так и в подавлении ее роста [19]. Показано, что экспрессия LTBP2 повышается в тканях и клеточных линиях рака желудка и связана с глубиной инвазии опухоли и стадией метастазирова-ния. Кроме того, снижение экспрессии LTBP2 в клетках рака желудка эффективно подавляет их пролиферацию, миграцию, инвазию и эпителиально-мезенхи-мальный переход, супрессирует активность GSH и GPX4, приводя к ферроптозу [21].
Виментин. В настоящее время виментин (VIM) рассматривается как маркер высокоагрессивных и метастатических форм почти всех видов рака. Более высокая экспрессия VIM связана с прогрессированием ГБ и снижением показателей выживаемости у пациентов. Активация этого белка наблюдалась в классическом и мезенхи-мальном подтипах ГБ, а переходы от классической к мезенхимальной ГБ коррелировали с более высокой экспрессией VIM и повышенной пролиферацией и миграцией клеток опухоли [22]. Подавление экспрессии VIM снижало инвазию и миграцию опухолевых клеток, действуя как регулятор AXL рецептора тирозинкиназы [23].
Гипоксия вызывает изменения в локализации сети промежуточных филаментов VIM [24], а экспрессия HIF-1a положительно коррелирует с уровнями маркеров эпителиально-мезенхимального перехода (LOX и VIM) в клетках ГБ [25].
LAMB1. Этот белок участвует во многих биологических процессах, включая клеточную адгезию, диф-ференцировку, миграцию, передачу сигналов и мета-стазирование [26]. LAMB1 высоко экспрессирован в глиомах высокой степени злокачественности, что предполагает его участие в прогрессировании опухолевого процесса [27]. Этот белок взаимодействует с интегринами на поверхности опухолевых клеток [28], способствуя их адгезии и миграции. Кроме того, LAMB1 влияет на экспрессию факторов роста и промоторов инвазии, таких как фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF), TGF-ß и матриксная металлопротеиназа 2 (MMP-2), что усиливает процессы ангиогенеза и инвазии [27].
STC1. Этот гликопротеин связан с ангиогенезом, клеточной пролиферацией, инвазией, метастазирова-нием, апоптозом и воспалением [29, 30]. Повышенная экспрессия STC1, наблюдаемая при ГБ, способствует прогрессированию заболеваний [30]. Кроме того, экспрессия STC1 увеличивается в условиях гипоксии, а HIF1-a активирует STC1 в опухолевых клетках [31, 32]. Концентрация этого гликопротеина в СМЖ при ГБ выше, чем при глиоме низкой степени злокачественности [32]. Сообщается, что STC1 активирует сигнальный каскад PI3K (phosphoinositide-3-kinase, фосфои-нозитид-3-киназа)/АЙ и JNK [33].
NRP1. Этот белок высоко экспрессируется в клетках ГБ [34], и его повышенная экспрессия связана с плохим прогнозом у пациентов [35]. NRP1 регулиру-
ет ангиогенез и действует как корецептор для TGF-P, фактора роста тромбоцитов (platelet-derived growth factor) и нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) [34]. GDNF увеличивает экспрессию мРНК и белка NRP1 и способствует прогрессированию ГБ [34]. Сообщается, что субпопуляция клеток NRP1+ демонстрирует повышенную экспрессию маркеров плюри-потентности и высокие способности клеток к миграции и самообновлению. Помимо этого, NRP1 является прямой мишенью HIF-1a, повышающего экспрессию E-кадгерина, MMP-2 и VIM в условиях гипоксии [36].
COL6A1. Этот белок участвует в миграции и инвазии опухолевых клеток [37, 38], а его экспрессия в глиоме значительно выше, чем в окружающих нормальных тканях [38]. COL6A1 связан с ангиогенезом в условиях гипоксической микросреды через VEGF и сигнальный путь PI3K/Akt [37, 38]. Под контролем P4HA1 в условиях гипоксии COL6A1 повышает экспрессию CD31 и дифференцировку опухолевых стволовых клеток в эндотелиальные клетки в опытах in vitro и in vivo. Предполагается, что сигнальный путь PH4A1/COL6A1 является адаптивным ответом на гипоксическую микросреду [37].
HSPA5. Данный белок индуцирует окислительный стресс, гипоксию [39] и способствует агрессивному росту и радиорезистентности ГБ. HSPA5 может активировать онкогенные пути, участвуя в регуляции пролиферации, апоптоза и подвижности опухолевых клеток [40]. По сравнению с первичными глиомами этот белок высоко экспрессирован в рецидивирующих глиомах и, как полагают, является потенциальным предиктивным маркером [39]. Таргетирование HSPA5 подавляет самообновление и радиорезистентность опухолевых стволовых клеток (особенно мезенхималь-ного подтипа) in vitro и in vivo, что сопровождается подавлением путей STAT3, ядерного фактора каппа-би (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-kB) и C/EBPp [40].
На основе полученных результатов можно сделать вывод о том, что СМЖ является уникальным биологическим объектом для открытия протеомных маркеров ГБ. Удаление первичной опухоли приводит к изменению протеомного ландшафта СМЖ больных ГБ, что может успешно использоваться для идентификации потенциальных предиктивных маркеров заболевания, играющих важную роль в глиомагенезе. Био-информатический комплексный анализ протеомных карт СМЖ, полученных на разных этапах терапии ГБ, представляет новые возможности для оценки эффективности терапии и предсказания рецидива заболевания. Открытые протеомные и геномные базы облегчают отбор и валидацию потенциальных биомаркеров ГБ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Спинномозговая жидкость — уникальный источник биомаркеров ГБ для мониторинга наличия и про-
m сч о сч
сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о
а.
в;
£
о ж.
и >
m сч о сч
сч
>-
и о
-J
о и z о
ОС <
грессирования заболевания. В настоящем исследовании впервые проведено картирование протеома СМЖ больных ГБ до и после хирургического удаления первичной опухоли. В целом идентифицированы 911 протеинов, 266 из которых являлись ДЭБ. Полученные результаты указывают на значительные изменения в протеомном составе СМЖ больных ГБ после оперативного вмешательства, что может успешно использоваться для иден-
тификации потенциальных предиктивных маркеров. В результате комплексного биоинформатического анализа ДЭБ с использованием открытых баз данных предложена основа для создания тест-системы из 11 потенциальных предиктивных маркеров ГБ (S100A9, PLA2G15, PPIB, LTBP2, VIM, LAMB1, STC1, S100A8, NRP1, COL6A1, HSPA5) для оценки эффективности терапии и предсказания рецидива заболевания.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
о ж
ю
< >
а
<
о m
а. те
m
о ж.
и >
1. Stupp R., Mason W.P., van den Bent M.J. et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.
N Engl J Med 2005;352:987-96. DOI: 10.1056/NEJMo a043330
2. Yan H., Parsons D.W., Jin G. et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. N Engl J Med 2009;360(8):765-73. DOI: 10.1056/ nejmo a0808710
3. Sturm D., Witt H., Hovestadt V. et al. Hotspot mutations in H3F3A and IDH1 define distinct epigenetic and biological subgroups
of glioblastoma. Cancer Cell 2012;22(4):425-37. DOI: 10.1016/ j.ccr.2012.08.024
4. Brennan C.W., Verhaak R.G.W., McKenna A. et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell 2013;155(2):462-77. DOI: 10.1016/j.cell.2013.09.034
5. Wick A., Kessler T., Platten M. et al. Superiority of temozolomide over radiotherapy for elderly patients with RTK II methylation class, MGMT promoter methylated malignant astrocytoma. Neurooncol 2020;22(8):1162-72. DOI: 10.1093/neuonc/noaa033
6. Weller M., van den Bent M., Preusser M. et al. EANO guidelines on the diagnosis and treatment of diffuse gliomas of adulthood. Nat Rev Clin Oncol 2021;18(3):170-86. DOI: 10.1038/s4157 1-020-00447-z
7. Serensen M.D., Fosmark S., Hellwege S. et al. Chemoresistance and chemotherapy targeting stem-like cells in malignant glioma. Adv Exp Med Biol 2015;853:111-38. DOI: 10.1007/978-3-31916537-0
8. Sastry R.A., Shankar G.M., Gerstner E.R. et al. The impact of surgery on survival after progression of glioblastoma: a retrospective cohort analysis of a contemporary patient population.
J Clin Neurosci 2018;53:41-7. DOI: 10.1016/j. jocn.2018.04.004
9. Aebersold R., Mann M. Mass-spectrometric exploration
of proteome structure and function. Nature 2016;537(7620):347-55. DOI: 10.1038/natur e19949
10. Jiang Y., Sun A., Zhao Y. et al. Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma. Nature 2019;567(7747):257-61. DOI: 10.1038/s4158 6-019- 0987-8
11. Coscia F., Lengyel E., Duraiswamy J. et al. Multi-level proteomics identifies CT45 as a chemosensitivity mediator and immunotherapy target in ovarian cancer. Cell 2014;175(1):159-70. DOI: 10.1016/ j.cell.2018.08.065
12. Bryukhovetskiy A., Shevchenko V., Kovalev S. et al. To the novel paradigm of proteome-based cell therapy of tumors: through comparative proteome mapping of tumor stem cells and tissuespecific stem cells of humans. Cell Transplant 2014;23(Suppl. 1):151-70. DOI: 10.3727/096368914X684907
13. Shen F., Zhang Y., Yao Y. et al. Proteomic analysis of cerebrospinal fluid: toward the identification of biomarkers for gliomas. Neurosurg Rev 2014;37(3):367-80. DOI: 10.1007/s10143-014-0539-5
14. Schmid D., Warnken U., Latzer P. et al. Diagnostic biomarkers from proteomic characterization of cerebrospinal fluid in patients with brain malignancies. J Neurochem 2021;158(2):522-38. DOI: 10.1111/jnc.15350
15. Wang H., Mao X., Ye L. et al. The role of the S100 protein family in glioma. J Cancer 2022;13(10):3022-30. DOI: 10.7150/jca.73365
16. Grebhardt S., Veltkamp C., Strobel P. et al. Hypoxia and HIF-1 increase S100A8 and S100A9 expression in prostate cancer. Int J Cancer 2012;131(12):2785-94. DOI: 10.1002/ijc.27591
17. Jang J.E., Kim H.P., Han S.W. et al. NFATC3-PLA2G15 fusion transcript identified by RNA sequencing promotes tumor invasion and proliferation in colorectal cancer cell lines. Cancer Res Treat 2019;51(1):391—401. DOI: 10.4143/crt.2018.103
18. Oh Y., Lee E.H., Kang S.G. PPIB is overexpressed in glioblastoma and regulates tumor growth by inducing self-ubiquitination
by E3 ligase, Smurf2. Brain Tumor Res Treat 2022;10:S255. DOI: 10.14791/btrt.2022.10.F-1443
19. Zhao J., Liu X., Cong K. et al. The prognostic significance
of LTBP2 for malignant tumors: Evidence based on 11 observational studies. Medicine 2022;101(17):e29207. DOI: 10.1097/MD. 0000000000029207
20. Wang J., Liang W.J., Min G.T. et al. LTBP2 promotes the migration and invasion of gastric cancer cells and predicts poor outcome
of patients with gastric cancer. Int J Oncol 2018;52(6):1886-98. DOI: 10.3892/ijo.2018.4356
21. Wang T.A., Zhou Z., Wang C. et al. LTBP2 knockdown promotes ferroptosis in gastric cancer cells through p62-keap1-Nrf2 pathway. BioMed Res Int 2022;2022:1-15. DOI: 10.1155/2022/6532253
22. Li Q., Aishwarya S., Li J.P. et al. Gene expression profiling
of glioblastoma to recognize potential biomarker candidates. Front Genet 2022;13:832742. DOI: 10.3389/fgene.2022.832742
23. Lin H., Hong Y., Huang B. et al. Vimentin overexpressions induced by cell hypoxia promote vasculogenic mimicry by renal cell carcinoma cells. BioMed Res Int 2019;2019:1-13.
DOI: 10.1155/2019/7259691
24. Liu T., Guevara O.E., Warburton R.R. et al. Regulation of vimentin intermediate filaments in endothelial cells by hypoxia. Am J Physiol 2010;299(2):363-73. DOI: 10.1152/ajpcell.00057.2010
25. Srivastava C., Irshad K., Dikshit B. et al. FAT1 modulates EMT and stemness genes expression in hypoxic glioblastoma. Int J Cancer 2018;142(4):805-12. DOI: 10.1002/ijc.31092
26. Li Y., Deng G., Qi Y. et al. Bioinformatic profiling of prognosis-related genes in malignant glioma microenvironment. Med Sci Monit 2020;26:e924054-1. DOI: 10.12659/MSM.924054
27. Chen T.Y., Liu Y., Chen L. et al. Identification of the potential biomarkers in patients with glioma: a weighted gene co-expression network analysis. Carcinogenesis 2020;41(6):743-50.
DOI: 10.1093/carcin/bgz194
28. Virga J., Bognar L., Hortobagyi T. et al. Prognostic role of the expression of invasion-related molecules in glioblastoma. J Neurol Surg A: Cent Eur Neurosurg 2017;78(1):12-9.
DOI: 10.1055/s-0036-1584920
29. Zhang F., Wang X., Bai Y. et al. Development and validation of a hypoxia-related signature for predicting survival outcomes in patients with bladder cancer. Front Genet 2021;12:670384. DOI: 10.3389/fgene.2021.670384
30. Xiong Y., Wang Q. STC1 regulates glioblastoma migration and invasion via the TGF P/SMAD4 signaling pathway. Mol Med Rep 2019;20(4):3055-64. DOI: 10.3892/mmr.2019.10579
31. Yeung H.Y., Lai K.P., Chan H.Y. et al. Hypoxia-inducible factor-1- upregulation in the hypoxic tumor microenvironment. PO
СЧ О СЧ
СЧ
>
mediated activation of stanniocalcin-1 in human cancer cells. Cell Death Dis 2021;12(4):394. DOI: 10.1038/s41419-021-
Endocrinology 2005;146(11):4951—60. DOI: 10.1210/en.2005-0365 03682-z
32. Sakata J., Sasayama T., Tanaka K. et al. MicroRNA regulating 37. Han X., Wang Q, Fang S. et al. P4HA1 Regulates CD31 via stanniocalcin-1 is a metastasis and dissemination promoting factor COL6A1 in the Transition of Glioblastoma Stem-Like Cells in glioblastoma. J Neurooncol 2019;142:241-51. DOI: 10.1007/ to Tumor Endothelioid Cells. Front Oncol 2022;12:836511. s11060-019-03113-2 DOI: 10.3389/fonc.2022.836511
33. Ma X., Gu L., Li H. et al. Hypoxia-induced overexpression 38. Lin H., Yang Y., Hou C. et al. Identification of COL6A1 <J of stanniocalcin-1 is associated with the metastasis of early stage as the key gene associated with antivascular endothelial growth 2 clear cell renal cell carcinoma. J Transl Med 2015;13(1):1—14. factor therapy in glioblastoma multiforme. Genet Test Mol
DOI: 10.1186/s12967-015-0421-4 Biomarkers 2021;25(5):334—45. DOI: 10.1089/gtmb. z
34. Sun S., Lei Y., Li Q. et al. Neuropilin-1 is a glial cell line-derived 2020.0279 О neurotrophic factor receptor in glioblastoma. Oncotarget 39. Wen X., Chen X., Chen X. Increased expression of GRP78 ^ 2017;8(43):74019—35. DOI: 10.18632/oncotarget.18630 correlates with adverse outcome in recurrent glioblastoma
35. Liu Y., Liu Y., Gao Y. et al. H19-and hsa-miR-338- multiforme patients. Turk Neurosurgery 2020;30(1):11—6. 3p-mediated NRP1 expression is an independent predictor DOI: 10.5137/1019-5149.jtn.21840-17.4 ш of poor prognosis in glioblastoma. PloS One 2021;16(11):e0260103. 40. Chen Z., Wang H., Zhang Z. et al. Cell surface GRP78 regulates ^ DOI: 10.1371/journal.pone.0260103 BACE2 via lysosome-dependent manner to maintain mesenchymal
36. Fu R., Du W., Ding Z. et al. HIF-1a promoted vasculogenic phenotype of glioma stem cells. J Exp Clin Cancer Res mimicry formation in lung adenocarcinoma through NRP1 2021;40(1):1 — 17. DOI: 10.1186/s13046-020-01807-4
i/1 ш U
z <
Вклад авторов Q
H.Е. Арноцкая: получение масс-спектрометрических данных, редактирование статьи; Т.И. Кушнир: статистический анализ данных;
И.А. Кудрявцев: подготовка образцов для анализа; —
А.А. Митрофанов: обзор публикаций по теме статьи; S
A.Х. Бекяшев: научное редактирование статьи; ^
B.Е. Шевченко: разработка дизайна исследования, анализ полученных данных, написание текста статьи. ^ Autrors' contributions О N.E. Arnotskaya: obtaining mass spectrometric data, editing editing. ^ T.I. Kushnir: statistical data analysis; О
I.A. Kudryavtsev: preparation of samples for analysis;
A.A. Mitrofanov: review of publications on the topic of the article; О
A.Kh. Bekyashev: scientific editing; ^
V.E. Shevchenko: developing the research design, analysis of the received data, article writing. ОС
ORCID авторов / ORCID of authors аг
Н.Е. Арноцкая / N.E. Arnotskaya: https://orcid.org/0000-0002-0154-8604 ^
Т.И. Кушнир / T.I. Kushnir: https://orcid.org/0000-0001-9626-6847 О
И.А. Кудрявцев / I.A. Kudryavtsev: https://orcid.org/0000-0001-7588-1066 2
А.А. Митрофанов / A.A. Mitrofanov: https://orcid.org/0000-0002-4125-7342 S
A.Х. Бекяшев / A.Kh. Bekyashev: https://orcid.org/0000-0002-4160-9598 ><
B.Е. Шевченко / V.E. Shevchenko: https://orcid.org/0000-0002-0401-9900 с
U
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Финансируется в рамках госбюджетной темы № 2021-76. Funding. It is funded under the state budget theme No. 2021-76.
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики
Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.
Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Compliance with patient rights and principles of bioethics
The protocol of the study was approved by the local ethics committee of the N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia.
All patients gave written informed consent to participate in the study
Статья поступила: 19.04.2023. Принята к публикации: 29.05.2023. Article submitted: 19.04.2023. Accepted for publication: 29.05.2023.
