ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ НА СЕКРЕТОМ КЛЕТОК МУЛЬТИФОРМНОЙ ГЛИОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

сч О сч

>-

и о

-J

о

и

DOI: 10.17650/2313-805X-2021 -8-1 -32-40

С~)1

О

<

О

о.

о;

>

о ж.

и >

Влияние гипоксии на секретом клеток мультиформной глиобластомы человека

о Т.И. Кушнир, Н.Е. Арноцкая, И.А. Кудрявцев, А.А. Митрофанов, А.Х. Бекяшев, В.Е. Шевченко tc

< ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия,

Э 115478 Москва, Каширское шоссе, 24 о

LU -J

Контакты: Валерий Евгеньевич Шевченко vshev2015@yandex.ru

z

trt Введение. Мультиформная глиобластома (МГБ) развивается на фоне гипоксической микросреды, играющей

У важную роль в патогенезе заболевания и тесно связанной с ростом и развитием опухоли и плохим прогнозом.

z Гипоксия (ГС) повышает резистентность опухолевых клеток (ОК) к лучевой терапии и химиотерапии, способ-

> ствует появлению агрессивного фенотипа ОК, приводящего к рецидиву заболевания. Молекулярные механиз-

мы действия ГС на секретом клеток МГБ, участвующий в формировании микроокружения опухоли, остается не изученным. В настоящее время также не установлены маркеры агрессивного гипоксического фенотипа опухолевых клеток.

Цель исследования - изучение молекулярных механизмов действия гипоксии на секретом клеток U251 МГБ. Материалы и методы: протеомная масс-спектрометрия высокого разрешения, клеточные технологии. Результаты. В секретомах двух типов клеток МГБ (контроля и опыта) в целом идентифицированы 1432 белка. После действия гипоксии зарегистрированы статистически значимые изменения в экспрессии 390 белков. Повышение экспрессии более чем на два порядка наблюдали у 11 протеинов. Идентифицированы внутриклеточные сигнальные пути, ответственные за действие гипоксии на клетки U251 МГБ.

Заключение. Гипоксия оказывала заметное влияние на протеомный состав секретома клеток МГБ. В качестве потенциальных маркеров гипоксического фенотипа МГБ предложены 5 гиперэкспрессированных белков секретома: S100A6, HEY1, ZIP3, S100A4, ZEB2, для которых ранее доказано участие в патогенезе мультиформной глиобластомы.

Ключевые слова: мультиформная глиобластома, гипоксия, протеом, секретом, прогностические маркеры, масс-спектрометрия

Для цитирования: Кушнир Т. И., Арноцкая Н.Е., Кудрявцев И. А., Митрофанов А.А., Бекяшев А.Х., Шевченко В.Е. Влияние гипоксии на секретом клеток мультиформной глиобластомы человека. Успехи молекулярной онкологии 2021;8(1):32-40. DOI: 10.17650/2313-805X-2021-8-1-32-40.

The effect of hypoxia on the secretome of human glioblastoma multiforme cells

T.I. Kushnir, N.E. Arnotskaya, I.A. Kudryavtsev, A.A. Mitrofanov, A.K. Bekyashev, V.E. Shevchenko

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia

Contacts: Valeriy Evgenievich Shevchenko vshev2015@yandex.ru

Background. Glioblastoma multiforme (GBM) develops in the hypoxic microenvironment, which plays an important role in the pathogenesis of the disease and is closely associated with tumor growth, development and poor prognosis. Hypoxia increases the resistance of tumor cells (TC) to radiation therapy and chemotherapy, promotes the appearance of an aggressive TC phenotype, leading to the disease recurrence. The molecular mechanism of hypoxic action on the secretome of GBM cells, which is involved in the formation of the tumor microenvironment, remains unclear. Also, markers of the aggressive hypoxia-associated phenotype of tumor cells have not been established. The purpose of research - to study the molecular mechanisms of the hypoxia-associated effect on the secretome of the U251 GBM cells.

Materials and method. High resolution proteomic mass spectrometry, cell technologies.

Results. A total of 1432 proteins were identified in the secretomes of two types of GBM cells (control and experiment). After the action of hypoxia, statistically significant changes in the expression of 390 proteins were registered. 11 proteins showed increase in expression over two orders of magnitude. The intracellular signaling pathways which are responsible for the hypoxia-associated effects on the U251 GMB cells have been identified.

Conclusions. Hypoxia significantly affected the proteomic composition of the GBM cells secretóme. Five overexpressed secretóme proteins, S100A6, HEY1, ZIP3, S100A4, ZEB2, have been proposed as potential markers of the hypoxia-associated phenotype of GBM, for which participation in the pathogenesis of glioblastoma multiforme has been previously showed.

Key words: glioblastoma multiforme, hypoxia, proteome, secretome, prognostic markers, mass spectrometry

For citation: Kushnir T.I., Arnotskaya N.E., Kudryavtsev I.A., Mitrofanov A.A., Bekyashev A.K., Shevchenko V.E. The effect of hypoxia on the secretome of human glioblastoma multiforme cells. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2021;8(1):32-40. (In Russ.). DOI: 10.17650/2313-805X-2021-8-1-32-40.

ВВЕДЕНИЕ

Мультиформная глиобластома (МГБ), или астро-цитома IV степени злокачественности, — наиболее распространенная, инвазивная, первичная, глиальная опухоль головного мозга человека. МГБ развивается на фоне сильной гипоксии (ГС) (pO2 = 0,5—2,5 %), играющей важную роль в патогенезе заболевания [1, 2]. ГС — результат высокой пролиферативной и метаболической активности злокачественных клеток [3]. Ранее показано, что прогрессирование опухоли обусловлено гипоксической передачей сигналов [4]. Инвазия опухоли одна из основных причин смерти больных МГБ. Низкая оксигенация опухоли модулирует взаимодействие стромальных клеток в микроокружении опухоли, способствует выживанию и распространению ОК в здоровую паренхиму головного мозга. ГС приводит к снижению чувствительности клеток МГБ к облучению и цитотоксической активности многих видов химиотерапии [1, 5].

Поскольку в глиомах часто присутствуют участки с различными степенями злокачественности в опухоли, важное значение приобретает изучение особенностей, закономерностей и механизмов образования агрессивного фенотипа клеток МГБ в условиях ГС. Актуальной становится идентификация молекулярных детерминант фенотипической трансформации линий клеток МГБ человека при действии ГС.

В настоящее время считается, что не только про-теом ОК, но и их секретом имеет важное значение, представляя собой микросреду опухоли, играющую ключевую роль в формировании злокачественного фенотипа, а также в процессах ангиогенеза и инвазии. Изучение в опытах in vitro секретома линий клеток МГБ даст возможность оценить глубину изменений их фенотипа под влиянием фактора клональной селекции — ГС, чтобы использовать эти данные в клинической онкологии.

В данной работе мы исследовали эффект ГС на секретом линии клеток U251 МГБ человека, культивируемых в условиях нормоксии (НС) и низкой оксиге-нации (1 % O2). ГС существенно влияла на секретом опухолевых клеток. В частности, ее действие повышало более чем на два порядка уровни 11 белков секре-тома, для которых участие в канцерогенезе отмечено во многих исследованиях. Эти гиперэкспрессированные белки могут являться потенциальными маркерами ги-

поксического фенотипа (ГФ) клеток МГБ и использоваться для его обнаружения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение секретома клеток U-251 МГБ. Клетки линии U-251 культивировали при температуре +37 °C в увлажненной атмосфере с 5 % СО2 в среде DMEM/ F12 (Gibco, Life Technologies, Россия) с низким содержанием глюкозы, глутамином, добавлением 10 % бычьего сывороточного альбумина, пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) в общем объеме 15 мл в пластиковых флаконах для культур клеток (75 см2) (Corning Costar, США).

При достижении 70 % монослоя (после 48 ч роста) клетки двукратно осторожно отмывали бессывороточной средой, затем культивировали в бессывороточной среде в течение 24 ч при температуре +37 °С в различных условиях:

1) контрольный образец клеток инкубировали при

20 % содержании О2 (в нормоксических условиях);

2) опытный образец клеток инкубировали при 1 %

содержании О2 (в гипоксических условиях).

Контрольные и опытные клетки выращивали в трех

экземплярах, независимо обрабатывали и анализировали. После инкубации отбирали кондиционированную среду (КС) (по 45 мл), центрифугировали на оборудовании Biosan LMC-3000 (Biosan, Латвия) при 1500 об/мин 10 мин для удаления интактных клеток и клеточного дебриса. Супернатант пропускали через 0,22 мкм фильтр и хранили при —80 °C для дальнейшего использования. Число мертвых клеток оценивали окрашиванием культуры клеток трипановым синим, а их относительное количество — по соотношению уровней лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (показателя гибели клеток): КС(ГС)/КС(НС).

Подготовка образцов для масс-спектрометрии. Се-кретомы опухолевых клеток подвергали ультрафильтрации для удаления низкомолекулярных соединений описанным методом [6]. После ферментативного расщепления (трипсинолиза) образцы концентрировали при +30 °С в центрифужном концентраторе Labconco CentriVap (Labconco, США) для полного удаления бикарбоната аммония.

Продукты трипсинолиза секретомов ОК (100 мкг) растворяли в 50 мкл фазы A (20 мМ NH4OH, рН 10) и фракционировали на колонке Zorbax 300 Extend-C18

сч о сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж.

ю

< >

а

<

о m

а.

в;

£ m

о ж.

и >

сч О сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж.

ю

< >

а

<

о m

а. те

> m

О

ж.

U >

(2,1 х 500 мм; 3,5 мкм) (Agilent, США) на высокоэффективном жидкостном хроматографе (ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent, США), оборудованном коллектором фракций и УФ-детектором. Объем введенной пробы составлял 20 мкл, температура колонки — 25 °C, детектирование по УФ-поглощению при длине волны 214, 254, 280 нм. Подвижная фаза состояла из двух фаз: А (20 мМ NH4OH, рН 10) и Б (20 % фазы A плюс 80 % ацетонитрила). Колонку уравновешивали фазой А в течение 30 мин перед вводом образца. Для фазы Б градиент подвижной фазы был установлен следующим образом (при скорости потока 300 мкл/мин): а) от 0 до 5 мин: 0 %; б) от 5 до 35 мин — 0—35 %; в) от 35 до 45 мин - 35-100 %; г) от 45 до 60 мин - 100 %; д) от 60 до 70 мин — 100-0 %. Всего были собраны 24 фракции от 0 до 50 мин с интервалами 1,5 и 3 мин. Фракции упаривали досуха при 30 °С в центрифужном испарителе CentriVap (Labconco, США) и повторно разбавляли 100 мкл 0,1 % муравьиной кислоты для масс-спект-рометрического анализа.

Масс-спектрометрический анализ. Анализ пептидов, образованных после трипсинолиза белков секре-тома ОК, проводили с использованием нано-ВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 (Dionex, США) и масс-спектрометра LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, Inc., США) с источником ионизации NanoSpray (Thermo Fisher Scientific, Inc., США) [6]. Для обработки масс-спектрометрических данных использовали программное обеспечение MaxQuant (v1.6.1.0; Biochemistry Computational Systems, Biochemistry Max Planck, Martinsried, Германия). Таблицу полученных белков обрабатывали в программе Perseus v1.5.1.6 для аннотирования и удаления белков-контаминантов и ложно-положительных идентификаций, а также для определения статистической значимости различий в уровнях белков, полученных методом label-free (без метки). Значимыми считали различия при уровне достоверности p < 0,05 для парного t-критерия Стьюдента.

Аннотирование биологических, молекулярных функций и сигнальных путей проводили с помощью открытых баз данных PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed), PANTHER (www.pantherdb.org), GeneOntology (www.geneontology.org/), Swiss-Prot (www.uniprot.org/ uniprot), KEGG (www.genome.jp / kegg / ), DAVID (david.ncifcrf.gov/home. jsp). Анализ данных The Cancer Genome Atlas (TCGA) (200 больных МГБ) выполняли с помощью программы GBM-BioDP с использованием модели пропорциональных интенсивностей Кокса.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При получении высококачественного секретома ОК предварительно изучался эффект ГС на выживаемость линии клеток U251 МГБ. Перед проведением опыта количество мертвых клеток в контрольном и опытном образцах составляло ~3 %. После инкубации ОК в нормоксических условиях в течение 24 ч число мертвых клеток увеличилось до ~5 %, под дейст-

вием ГС - до ~8 %. Соотношение уровней ЛДГ(ГС)/ ЛДГ(НС) составило 1,3.

Мы использовали метод label-free для количественного нано-ВЭЖХ - МС/ МС (тандемная масс-спектрометрия) анализа секретомов линии клеток U251 МГБ человека в условиях НС и ГС (1 % O2) в течение 24 ч. Анализом триптических пептидов по их 11 059 спектрам МС /МС с помощью программного пакета MaxQuant были просеквенированы 1342 протеина по 3000 (2469 уникальным) пептидам при сравнении с данными базы SwissProt_human и ложным уровнем обнаружения (a false discovery rate) 1 % для тройных повторов двух видов образцов. Из них 1133 белка идентифицировали по 2748 (2225 уникальным) пептидам в секретомах контрольных клеток U251 и 1025 белков - по 2614 (2098 уникальным) пептидам в секретомах клеток U251 после действия ГС. Для всех линий клеток ~32 % белков идентифицировали по 2 и более пептидам. Диапазон молекулярных масс протеинов изменялся от 0,96 до 2993 кДа, из них 524 имели молекулярный вес до 30 кДа, 568 - от 30 до 100 кДа, 206 - от 100 до 300 кДа, 26 - от 300 до 500 кДа, 18 -выше 500 кДа. Процент покрытия анализируемых белков варьировался от 0,2 до 100 %, из них: 1153 белка -с покрытием до 20 %, 155 - от 20 до 40 %, 21 - от 40 до 60 % и 13 - от 60 до 100 %. Коэффициент корреляции Пирсона для данных по образцам клеток U251 до и после действия ГС изменялся от 0,904 до 0,952.

Идентифицированные протеины показали достаточно высокий процент перекрытия для двух клеточных популяций. Восемьсот шестнадцать из 1342 (61 %) протеинов детектировались во всех клеточных секре-томах, 317 протеинов - только в секретоме клеток U251, культивируемых в условиях НС, и 209 протеинов были уникальными для секретома клеток U251 после действия ГС.

Статистически значимые изменения в экспрессии (p < 0,05) после действия ГС зарегистрировали для 390 белков. Триста сорок один протеин был дифференциально экспрессированным белком (ДЭБ) и изменял экспрессию более чем в 2 раза, 151 - увеличивал, а 190 - уменьшали. Повышение экспрессии более чем на два порядка наблюдали у 11 протеинов.

Динамический диапазон (определяемый порогом чувствительности масс-спектрометра и линейной зависимостью его сигнала от концентрации анализируемого объекта) для идентифицированных белков составляет 6 порядков (от 4,1 • 108 до 363), что позволяет выявить низкокопийные белки (протеины с низкими уровнями концентрации в секретоме), такие как ко-филин-2, MIF (Macrophage migration inhibitory factor) и др. Также идентифицированы специфические маркеры мезенхимального субтипа (CD44, интегрин ß-1) МГБ.

Для лучшего понимания биологических процессов и путей, включенных в гипоксия-индуцированные отклики, мы провели развернутый биоинформатиче-ский анализ данных картирования белков секретомов

4,3 %

2,5 % 1,4 %

4,7 %

28,8 %

5,0 %

6,6 %

9,4 %

10,7 %

клеточные процессы / cellular process

метаболические процессы / metabolic process организация клеточных компонентов, биогенез / organization of cellular components, biogenesis локализация / localization процессы, связанные с многоклеточной

28,1 %

организацией / multicellular organismal process процессы развития / developmental process рост / growth ответы на стимулы / response to stimulus иммунные процессы / immune system process биологическая адгезия / biological adhesion

Рис. 1. Биологические процессы с участием дифференциально экспрес-сированных белков секретома клеток U251 мультиформной глиобла-стомы, культивируемых в условиях гипоксии и нормоксии Fig. 1. Biological processes involving the secretome differentially expressed proteins of the U251 glioblastoma multiforme cells cultured at hypoxia and normoxia

1,7 %

0,6 % 0,4 %

1,8 %

6,3 %

13,4 %

39,9 %

35,4 %

каталитическая активность / catalytic activity связывающая активность / binding activity I структурно-молекулярная активность / structural molecule activity транспортная активность / transporter activity

рецепторная активность/ receptor activity

трансляционная регуляторная активность / translation regulator activity молекулярная сигнальная трансдукция / molecular transducer activity регуляторная активность / regulator activity

Рис. 2. Молекулярные функции дифференциально экспрессированных белков секретома клеток U251 мультиформной глиобластомы, культивируемых в условиях гипоксии и нормоксии

Fig. 2. Differentially expressed proteins molecularfunctions of the secretome of the U251 glioblastoma multiforme cells cultured at hypoxia and normoxia

двух типов клеток с использованием KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) и биологических процессов GO (Gene Ontology). В дальнейшем включали в анализ каждой из групп сравнения только ДЭБ.

Каждый идентифицированный белок, удовлетворяющий вышеназванным требованиям, классифицировался в соответствии с его биологической ролью в клетке, молекулярной функцией и функциональным классом. Основная часть ДЭБ участвовала в метаболических (G0:0008152) (28,1 %) и клеточных (G0:0009987) (28,8 %) процессах, а также в процессах организации клеточных компонентов, биогенезе (G0:0071840) (10,7 %) и локализации (G0:0051179) (9,4 %) (рис. 1).

Большая часть ДЭБ проявляла каталитическую (G0:0003824) (39,9 %), связывающую (G0:0005488) (35,4 %), структурно-молекулярную (G0:0005198) (13,4 %), транспортную (G0:0005215) (6,3 %) активность (рис. 2). Основная часть ДЭБ представлена нуклеопро-теидами (PC00171) (11,9 %), гидролазами (PC00121) (10,9 %), модуляторами энзимов (PC00095) (9,5 %), рецепторами (PC00197) (7,5 %), сигнальными молекулами (PC00207) (6,5 %).

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ выживаемости линии клеток U251 МГБ при ГС и НС в течение 24 ч показал, что ГС в этих условиях оказывала достаточно слабый эффект. Число мертвых клеток в опыте не превышало 8 %, а в контроле — 5 %, что в целом не мешало получению высококачественного секретома опухолевых клеток и не сказывалось заметно на его качественном и количественном составе. Особенно это касалось ДЭБ, экспрессия которых менялась более чем в 2 раза. Несомненно, что небольшая часть белков секретома связана с гибелью клеток. Тем не менее ГС оказывала значительное влияние на внутриклеточные процессы, что находило свое отражение в протеомном составе секретома линии клеток U251 МГБ.

Нами обнаружено достаточно большое количество ДЭБ, 16 % идентифицированных протеинов были уникальными для ОК после ее действия. Происходили изменения с участием 77 % ДЭБ в клеточных, метаболических процессах, а также в процессах организации клеточных компонентов и биогенезе. Большая часть ДЭБ (89 %) проявляла каталитическую, связывающую и структурно-молекулярную активность. Появление в секретоме 13,4 % ДЭБ со структурно-молекулярной активностью можно объяснить тем, что основную часть этих протеинов составляли два высокоэкспрес-сированных коллагена (COL5A2 и COL1A2), участвующие в построении внеклеточного матрикса. Оба белка вырабатываются и секретируются клетками U251 МГБ. После действия ГС отмечали значительное обогащение сигнальных путей в клетках U251 МГБ, связанных с клеточным дыханием, инвазией, протеа-сомной активностью, презентацией антигенов (табл. 1).

сч о сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о m

а.

в;

£ m

о ж.

и >

сч о сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю ш и

Z <

>

а

<

Таблица 1. Анализ обогащения сигнальных путей после действия гипоксии на линию клеток U251 мультиформной глиобластомы Table 1. Enrichment analysis of signaling pathways after exposure to hypoxia on the U251 glioblastoma multiforme cells

Сигнальный каскад Signal cascade Дифференциально экспрессированный ген Differentially expressed gene P*

Гликолиз / глюконеогенез Glycolysis/gluconeogenesis AKR1A1; ALDH2; ALDOC; GAPDH; LDHA; LDHAL6B; PGAM1; PGM1; TPI1 2,5Е-4

Фокальная адгезия Focal adhesion ACTN1; COL1A1; COL1A2; COL5A2; COL6A1; FLNA; FLNC; FN1; ITGB5; LAMC1; MYL12A; MYL12B; MYL9; PTK2; RAP1A; RAP1B 5,0Е-4

Регуляция актинового цитоскелета Regulation of the actin cytoskeleton ACTN1; APC; ARPC2; BAIAP2; CFL1; CFL2; CHRM3; F2; FGF7; FN1; ITGB5; MYL12A; MYL12B; MYL9; PTK2; TMSB4X 1,0Е-3

Протеасомы Proteasomes PSMAl; PSMA3; PSMA5; PSMA6; PSMB4; PSMC5; PSME1 1,9Е-3

Процессирование и презентация антигена Antigen processing and presentation CIITA; HLA-DPB1; HLA-DRB1; HSP90AB1; HSPA1L; HSPA5; HSPA8; KIR2DL3; PSME1 2,2Е-3

Взаимодействие внеклеточного матрикса с рецептором Interaction of the extracellular matrix with the receptor COL1A1; COL1A2; COL5A2; COL5A2; COL5A2; DAG1; FN1; HMMR; ITGB5; LAMC1 2,4Е-3

*Модифицированное точное p-значение критерия Фишера для анализа обогащения генов c диапазоном значений от 0 до 1. Точное p-значение Фишера, равное 0, представляет собой идеальное обогащение. Обычно значение p равно или меньше 0,05, чтобы считаться сильно обогащенным в категориях аннотаций.

*Modified exact p-value of the Fisher criterion for gene enrichment analysis with a range of values from 0 to 1. Exact p-value of the Fisher criterion of 0 represents ideal enrichment. Usually p-value is equal to or less than 0.05 to be considered highly enriched in annotation categories.

О

О

о

те

> m

о ж.

U >

Таблица 2. Дифференциально экспрессированные белки секретома, уровни которых увеличились на 2 порядка при действии гипоксии на клетки U251 мультиформной глиобластомы

Table 2. The levels of secretome differentially expressed proteins which increased over 2 orders of magnitude under the action of hypoxia on the U251 glioblastoma multiforme cells

Индекс гена Название белка Моллекулярный вес, кДа Гипоксия/нормоксия

Gene index Molecular weight, kDa Hypoxia/normoxia

^ш

S100A6 S100 кальций-связывающий белок A6 S100 calcium-binding protein A6 9,б810 509

HEY1 HESR белок-1, связанный с YRPW-мотивом HESR protein-1 associated with the YRPW motif 32,б380 293

ZIP3 Транспортер цинка ZIP3 Zinc-regulated transporter 3 11,2050 271

BAG6 Белок, богатый пролином BAG6 Large proline-rich protein BAG6 21,2240 221

ATP11A Фосфолипид-транспортирующие аденозинтрифосфатазы 11A Adenosine triphosphatases phospholipid transporting 11A 10,5700 203

S100A4 S100 кальций-связывающий белок A4 S100 calcium-binding protein A4 11,7280 1б9

BAZ2B Бром-домен, ассоциированный с доменом «цинкового пальца» 2B Bromodomain adjacent to zinc finger domain protein 2B 240,4б00 159

ZNF350 Белок «цинковый палец» 350 Zinc finger protein 350 б0,0110 152

PSMA1 Протеасомная субъединица альфа-1 Proteasome subunit alpha type-1 2б,5050 145

SORCS3 VPS10-доменный рецептор SorCS3 VPS10 domain-containing receptor SorCS3 135,7800 113

ZEB2 E-box-связывающий белок гомеобокс 2 «цинкового пальца» Zinc finger E-box binding homeobox 2 б,4847 90

В целом зарегистрированы изменения в 45 сигнальных каскадах.

ГС повышала экспрессию 151 ДЭБ и более чем на два порядка 11 белков (табл. 2), для которых участие в канцерогенезе отмечено во многих исследованиях. Согласно литературным источникам, BAG6, ATP11A, BAZ2B, ZNF350, PSMA1, SORCS3 участвуют в патогенезе ряда злокачественных новообразований (табл. 3). Для составления табл. 3 использовалась база данных The Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) с включенным в нее патологическим атласом с данными по опухолевым заболеваниям с повышенной экспрессией интересующих нас белков.

Роль перечисленных 6 белков в патогенезе МГБ и процессах, связанных с ГС, на текущий момент не известна. Впервые полученные нами данные о гиперэкспрессии секретируемых белков BAG6, ATP11A, BAZ2B, ZNF350, PSMA1, SORCS3 при действии ГС на клетки линии U251 МГБ могут быть полезны и ис-

Таблица 3. Злокачественные новообразования, в патогенезе которых участвует ряд дифференциально экспрессированных белков Table 3. Malignant neoplasms in the pathogenesis of which a number of differentially expressed proteins are involved

Индекс гена Gene index Злокачественное новообразование

BAG6 Рак щитовидной железы, головы и шеи, яичка, предстательной железы, молочной железы, яичников, толстой кишки, карциноид, меланома Cancer of the thyroid gland, head and neck, testicle, prostate, breast, ovary, colon, carcinoid, melanoma

ATP11A Рак щитовидной железы, поджелудочной железы, головы и шеи, мочевого пузыря, яичка, толстой кишки, меланома, карциноид Cancer of the thyroid gland, pancreas, head and neck, bladder, testicle, colon, melanoma, carcinoid

BAZ2B Рак щитовидной железы, легких, печени, поджелудочной железы, головы и шеи, почки, мочевого пузыря, яичка, предстательной железы, эндометрия, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, лимфома Cancer of the thyroid gland, lungs, liver, pancreas, head and neck, kidney, bladder, testicle, prostate, endometrium, breast, cervix, colon, lymphoma

ZNF350 Рак головы и шеи, предстательной железы, шейки матки Cancer of the head and neck, prostate, cervix

PSMA1 Гепатоцеллюлярная карцинома, рак мочевого пузыря, желудка, шейки матки, яичка, щитовидной железы, меланома Hepatocellular carcinoma, cancer of the bladder, stomach, cervix, testicle, thyroid gland, melanoma

SORCS3 Рак почки Kidney cancer

пользованы в других исследованиях для поиска потенциальных терапевтических мишеней и маркеров ГФ МГБ.

При поиске потенциальных маркеров ГФ МГБ основное внимание уделялось 5 гиперэкспрессирован-ным белкам: S100A6, HEY1, ZIP3, S100A4, ZEB2, для которых доказано участие в патогенезе МГБ. Согласно базам данных по изучению протеома человека (Human Proteome Project), протеомному составу лик-вора и экзосомам (ExoCarta), все эти белки могут анализироваться в биологических жидкостях больных МГБ, потенциально использоваться для детектирования ГФ МГБ и прослеживания эффективности терапии заболевания.

Для оценки роли генов, кодирующих группу ДЭБ (S100A6, HEY1, ZIP3, S100A4, ZEB2), в выживаемости больных МГБ были построены кривые Каплана — Мейера для 4 различных субтипов МГБ на основе мультигенного прогностического индекса отношения рисков — отношения риска события в определенный момент времени t в одной и другой группах (рис. 3). Показатель относится к методам оценки выживаемости и оценивается при проведении регрессионного анализа. Отношение рисков связано с вероятностью того, что событие, не произошедшее к определенному моменту времени, случится в следующий интервал времени. Вероятность того, что событие в одной группе наступит раньше, чем в другой, может быть рассчитана на основании показателя HR по формуле р = HR/(1 + HR).

Анализ данных TCGA (200 больных МГБ), выполненный c помощью программы GBM-BioDP с использованием модели пропорциональных интенсивностей Кокса, показал, что снижение в опухоли экспрессии группы матричных рибонуклеиновых кислот (мРНК), отвечающих перечисленным выше белкам, приводит к увеличению выживаемости пациентов с МГБ. Наибольший эффект наблюдался для больных с проней-ральным и нейральным субтипами МГБ.

Наиболее изученным белком этой группы является S100A4. Как видно из табл. 2, уровень S100A4 в се-кретоме возрастал в 169 раз после действия ГС на клетки U251. Повышенная экспрессия S100A4 в опухолевой ткани наблюдалась при многих онкозаболеваниях [7]. S100A4 является прогностическим показателем выживаемости пациентов с глиомой и может использоваться в качестве маркера при МГБ [7]. S100A4 связан с мезен-химальным фенотипом МГБ и играет важную роль в пронейрально-мезенхимальном переходе (ПМП) [8]. Мезенхимальный субтип МГБ характеризуется наибольшей инвазивностью и резистентностью к терапии [9]. Нами показано, что уровень экспрессии S100A4 положительно ассоциировался с маркерами мезенхималь-ного субтипа глиобластомы CD44 и FN1 (в условиях ГС экспрессия увеличивалась в 6,8 и 1,22 раза соответственно). Как полагают, S100A4 действует через систему MMP/TIMP (матриксные металлопротеина-зы / ингибиторы металлопротеиназ) при индукции

сч о сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж

ю ш и

Z <

>

а

<

о

а.

в;

£

о ж.

и >

сч О сч

>-

и о

-J

о и z о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о m

а. те

> m

О

ж.

U >

И 100

с

о о 80

60

го о

1 à--û

U -О

° s

I -о I- о

5 Ü

О. си

Ш гС Cû f—

40

20

Логарифмическое значение величины р: 0,195 / Logrankp-val: 0,195 Прогностический индекс отношения рисков: 1,58; р = 0,014 / Prognostic index hazard ratio: 2.17; p = 0.014

— ниже медианы / below median

— выше медианы / above median

>5 й 100

t I я -

Я <3 80

60

0

Ш О 1

-û S I-

и «О

° S

I -Q I- О

5 ü

О. Си

Ш гС

CÛ г—

40

20

Логарифмическое значение величины р: 0,336 / Logrank p-val: 0.336 Прогностический индекс отношения рисков: 1,31; р = 0,333 / Prognostic index hazard ratio: 1.31; p = 0.333

ниже медианы / below median выше медианы / above median

т-г

0 500 1000 1500 2000

Выживаемость, дни / Survival, days

т-т-т-г-1—

0 500 1000 1500 2000

Выживаемость, дни / Survival, days

й 100

с

Я о

80

60

Ш О 1

-û S

I-

и «О о <з X «о I- о

S ü

О. CL

Ф гС

CÛ г—

40

20

Логарифмическое значение величины р: 0,014 / Logrank p-val: 0.014 Прогностический индекс отношения рисков: 2,17; р = 0,014 / Prognostic index hazard ratio: 2.17; р = 0.014

— ниже медианы / below median

— выше медианы / above median

—I-1-1-1-1-1-г

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Выживаемость, дни / Survival, days

й 100

о о 80

u Ol

к и

60

Ш о

1 ь -û s

I- ^

и «О о о X «о I- о § Ü О. си Ф ¡С CÛ г—

40

20

— ниже медианы / below median

— выше медианы / above median

Логарифмическое

значение величины р: 0,115 / Logrank p-val: 0.115 Прогностический индекс отношения рисков: 2,14; р = 0,121 / Prognostic index hazard ratio: 1.31; р = 0.121

-i-1-

0 200 400 600

Выживаемость, дни / Survival, days

800

Рис. 3. Анализ выживаемости 200больных с классическим (а), мезенхемальным (б), пронейральным (в) и нейральным (г) субтипами мультиформной глиобластомы на основе мультигенного прогностического индекса отношения рисков с использованием данных по матричным рибонуклеиновым кислотам из базы «Атласа ракового генома»

Fig. 3. Survival analysis of200patients with with classical (a), mesenchemal (б), pronural (в), and neural (г) subtypes of glioblastoma multiforme based on the multigenic prognostic index Hazard ratio using matrix ribonucleic acids data from The cancer genome atlas database

инвазии и ангиогенеза. S100A4 сверхэкспрессирован в инвазивных клеточных линиях глиомы одновременно со снижением экспрессии TIMP2 (0,51 раза при ГС). Это указывает на тесную связь S100A4 с системой MMP (MMP19 - в 3,57 раза выше в условиях ГС) при инициации инвазии.

Ранее показано, что экспрессия белка S100A4 контролируется сигнальным путем Wnt/p-катенин [7]. Нами установлена прямая связь S100A4 с WNT/p-кате-нин каскадом (увеличение экспрессии CTNNB1 при ГС в 6,1 раза) и Р53/статмин сигнальным каскадом (увеличение экспрессии STMN1 в 2,45 и STMN2 в 53,22 раза). S100A4 является прямой мишенью р-катенин/TCF (transcription factor) и считается маркером ПМП, которому способствует его повышенная экспрессия [8].

Таким образом, в патогенезе МГБ S100A4 играет важную роль: является маркером мезенхимального субтипа опухолевых клеток и способствует метастази-рованию опухоли, участвует в регуляции клеточного цикла, клеточной пролиферации, подвижности, инвазии и инициирует процесс ангиогенеза.

Как показано в табл. 2, уровень белка S100A6 в се-кретоме ОК возрастал в 509 раз после действия ГС на клетки U251. При ряде новообразований S100A6

сверхэкспрессирован [7, 10] и считается диагностическим маркером или прогностическим фактором при раке поджелудочной железы, желудка, предстательной железы, меланоме и гепатоцеллюлярной карциноме [11].

Белок S100A6 взаимодействует с CacyBP/SIP (компонентом убиквитинлигазы) и таким образом может регулировать деградацию р-катенина. S100A6 ингиби-рует CacyBP/SIP, стимулируя клеточную пролиферацию и миграцию, опухолегенез и ПМП посредством ингибирования деградации р-катенина [11].

Можно сделать вывод о том, что S100A6 играет важную роль в патогенезе глиобластомы, участвуя в регуляции нескольких клеточных функций, таких как пролиферация, апоптоз клеток и инвазия.

Согласно данным табл. 2, уровень белка HEY1 в се-кретоме ОК возрастал в 293 раза после действия ГС на клетки U251. HEY1 участвует в патогенезе МГБ, ингиби-руя транскрипцию пронейральных транскрипционных факторов MASH1, MATH3, нейрогенина. Измененная активность сигнального пути NOTCH играет существенную роль в формировании опухолей головного мозга, увеличивая экспрессию HEY1 [12]. Повышенная активность фактора транскрипции E2F также увеличивает экспрессию HEY1 и усиливает пролиферацию

б

а

0

в

г

0

0

0

клеток [12]. Сигнальный путь TGF-P/SMAD регулирует экспрессию HEY1 через канонический NOTCH или независимым от NOTCH способом. При активации TGF-pi инициирование HEY1 происходит через связывание SMAD 3/SMAD 4 с промоторами HEY1 в положениях повторов связующих элементов SMAD [13]. Как и в случае с каскадом NOTCH, сигнальный каскад TGF-P/SMAD часто активируется в опухолях и способствует их прогрессированию [13]. ВМР9-белок активирует SMAD 1/5/8 и непосредственно стимулирует экспрессию HEY1 через неканонический путь передачи сигналов NOTCH [13].

Таким образом, HEY1 играет значительную роль в пролиферации и инвазии клеток МГБ.

Экспрессия ZEB2 увеличилась в 90 раз (см. табл. 2). Уровень ZEB2 положительно коррелирует с прогрессией и прогнозом многих видов рака, включая рак молочной железы, почек, поджелудочной железы и яичников. ZEB2 является хорошо известным активатором ПМП. Показано, что в клеточных линиях глиомы, как ZEB1, так и ZEB2, способствуют пролиферации и инвазии опухолевых клеток [14]. Многие молекулы, в том числе ZEB2, N-кадгерин, TWIST и SNAIL, активируют ПМП, тогда как E-кадгерин ингибирует процесс ПМП. ZEB1 может подавлять транскрипцию E-кадгерина и, следовательно, способствовать ПМП. Сигнальный путь ZEB регулирует пролиферацию, миграцию, инвазию, апоптоз клеток и обусловливает хеморезистентность глиобластомы [14].

Как видно из табл. 2, уровень белка ZIP3 в секре-томе ОК увеличивался в 271 раз после действия ГС

на клетки МГБ. Ген ZIP3 активно взаимодействует с несколькими генами, играющими важную роль в росте клеток и ангиогенезе, такими как MMP-9, VEGF-A, PDGF-A, IL-6, IL-8и IGFBP-2. Они опосредуют эффект ZIP3 на опухолевый рост и метастазирование глиомы и обратно коррелируют с выживаемостью пациентов. Экспрессия ZIP3 достоверно коррелирует со всеми этими генами, указывая на то, что ZIP3 может участвовать во множестве сигнальных путей и потенциально регулировать прогрессию опухолевого процесса [15].

Полученные нами данные о действии ГС на экспрессию белков S100A6, HEY1, ZIP3, S100A4, ZEB2, по нашему мнению, указывают на то, что они могут являться потенциальными прогностическими маркерами ГФ ОК. Присутствие этих протеинов в экзосомах открывает возможность использования метода жидкой биопсии для оценки эффективности терапии МГБ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом протеомной масс-спектрометрии высокого разрешения изучены молекулярные механизмы действия ГС на секретом линии клеток U251 МГБ человека. После действия ГС зарегистрированы статистически значимые изменения в экспрессии 390 белков. Показано значительное влияние ГС на сигнальные пути ОК, связанные с клеточным дыханием, инвазией, протеасомной активностью, презентацией антигенов. В качестве потенциальных прогностических маркеров ГФ МГБ предложен набор из пяти геперэкспрессиро-ванных белков секретома.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Evans S.M., Judy K.D., Dunphy I. et al. Hypoxia is important in the biology and aggression of human glial brain tumors. Clin Cancer Res 2004;10:8177-84. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-04-1081.

2. Cooper L.A.D., Gutman D.A., Chisolm C. et al. The tumor microenvironment strongly impacts master transcriptional regulators and gene expression class of glioblastoma. Am J Pathol 2012;180:2108-19.

DOI: 10.1016/j.ajpath.2012.01.040.

3. Masson N., Ratcliffe P.J. Hypoxia signaling pathways in cancer metabolism: the importance of co-selecting interconnected physiological pathways. Cancer Metab 2014;2(1):3.

DOI: 10.1186/2049-3002-2-3.

4. Schito L., Semenza G.L. Hypoxia-inducible factors: master regulators of cancer progression. Trends Cancer 2016;2:758-70.

DOI: 10.1016/j.trecan.2016.10.016.

5. Finger E.C., Giaccia A.J. Hypoxia, inflammation, and the tumor microenvironment in metastatic disease. Cancer Metastasis Rev 2010;29:285-93. DOI: 10.1007/s10555-010-9224-5.

6. Shevchenko V., Arnotskaya N., Kushnir T. et al. Transforming growth factor-p mimics the key proteome properties

of CD133-differentiated and CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Int Rev Neurobiol 2020;151: 220-42. DOI: 10.1016/bs.irn.2020.03.007.

7. Tesarova P., Kalousova M., Zima T., Tesar V. HMGB1, S100 proteins and other RAGE ligands in cancer — markers, mediators and putative therapeutic targets. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 2016;160:1-10. DOI: 10.5507/bp.2016.003.

8. Fei F., Qu J., Zhang M., Li Y., Zhang S. S100A4 in cancer progression and metastasis: A systematic review. Oncotarget 2017;8:73219-39.

DOI: 10.18632/oncotarget.18016.

9. Dao Trong P., Rosch S., Mairbaurl H.

et al. Identification of a prognostic hypo-xia-associated gene set in IDH-mutant glioma. Int J Mol Sci 2018;19:2903. DOI: 10.3390/ijms19102903. 10. Yu N.M., Ahn J.Y., Choi E.J. et al.

Detection of differentially expressed genes in glioblastoma by suppression subtractive

hybridization. J Korean Neurosurg Soc 2005;37:443-8.

11. Lesniak W., Slomnicki L.P., Filipek A. S100A6 — new facts and features. Biochem Biophys Res Commun 2009;4:1087-92. DOI: 10.1016/j.bbrc.2009.10.150.

12. Hulleman E., Quarto M., Vernell R. et al. A role for the transcription factor HEY1 in glioblastoma. J Cell Mol Med 2009;1:136-46.

DOI: 10.1111/j.1582-4934.2008.00307.x.

13. Liu Z., Sanders A.J., Liang G. et al. Hey factors at the crossroad of tumorigenesis and clinical therapeutic modulation

of hey for anticancer treatment. Mol

Cancer Ther 2017;16:775-87.

DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-16-0576.

14. Chen P., Liu H., Hou A. et al. Prognostic significance of zinc

finger E-Box-binding homeobox family in glioblastoma. Med Sci Monit 2018;24:1145-51. DOI: 10.12659/MSM.905902.

15. Lin Y., Chen Y., Wang Y. et al. ZIP4

is a novel molecular marker for glioma. Neuro-Oncology 2013;15:1008-16. DOI: 10.1093/neuonc/not042.

сч О СЧ

>-

(J

о

—I

о и z о

ОС <

о ж

to

< >

а

<

о m

а.

в;

£ m

о ж.

и >

о

CM

Вклад авторов

^ Т.И. Кушнир: получение данных, анализ полученных данных;

H.Е. Арноцкая: подготовка образцов для анализа, статистический анализ; И.А. Кудрявцев: получение секретома клеток мультиформной глиобластомы;

A.А. Митрофанов: обзор публикаций по теме статьи; гН А.Х. Бекяшев: редактирование черновика рукописи;

B.Е. Шевченко: разработка дизайна исследования, написание текста статьи. U Authors' contributions

® T.I. Kushnir: obtaining data, analysis;

О N.E. Arnotskaya: preparation of samples for analysis, statistical analysis;

I.A. Kudryavtsev: obtaining a secretome of glioblastoma multiforme cells; О A.A. Mitrofanov: reviewing of publications of the article's theme;

ОС A.K. Bekyashev: analysis of the article, correction of the manuscript; V.E. Shevchenko: developing the research design, article editing.

13

JJ ORCID авторов / ORCID of authors

Т.И. Кушнир/T.I. Kushnir: https://orcid.org/0000-0001-9626-6847 Н.Е. Арноцкая/N.E. Arnotskaya: https://orcid.org/0000-0002-0154-8604 И.А. Кудрявцев/I.A. Kudryavtsev: https://orcid.org/0000-0001-7588-1066 ^ А.А. Митрофанов/ A.A. Mitrofanov: https://orcid.org/0000-0002-4125-7342 00 А.Х. Бекяшев/ A.K. Bekyashev: https://orcid.org/0000-0002-4160-9598 В.Е. Шевченко/V.E. Shevchenko: https://orcid.org/0000-0002-0401-9900

Z

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

О Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. <

Финансирование. Финансируется в рамках госбюджетной темы № 2021-76. _ Funding. It is funded under the state budget theme No. 2021-76.

О Ж

Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов. О Compliance with patient rights and principles of bioethics

This article does not describe any research involving humans or animals as subjects.

a. те

>

О

ж.

и >

Статья поступила: 27.01.2021. Принята к публикации: 09.03.2021. Article submitted: 27.01.2021. Accepted for publication: 09.03.2021.