CC BY
22
УДК 616.981.955:616-078
Н.А.Осина, М.С.Мошкова, Д.В.Уткин, О.Ю.Ляшова, А.Н.Куличенко
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОДВИДОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Разработана методика идентификации подвидов Francisella tularensis с помощью двухэтапной мультиплексной ПЦР. В качестве ДНК-мишени выбрана область дифференциации RD1, на основе которой подобраны три пары праймеров. Для каждого подвида туляремийного микроба характерно образование фрагментов ДНК определенного размера.
Ключевые слова: Francisella tularensis, идентификация микроорганизмов, мультиплексная ПЦР.
Туляремия - зоонозная природно-очаговая особо опасная инфекция, возбудитель которой Francisel-la tularensis относится к числу возможных агентов биотерроризма. Патогенность штаммов туляремий-ного микроба зависит от того, к какому подвиду они относятся: nearctica, holarctica или mediasiatica. Поэтому на этапе идентификации изолятов возбудителя туляремии особое значение приобретают методы внутривидовой дифференциации F. tularensis.
Цель данной работы - разработать методический прием, позволяющий идентифицировать подвиды F. tularensis с помощью мультиплексной ПЦР.
Известно, что для подвидов туляремийного микроба характерна высокая гомогенность генетического материала - до 90 % [2-4]. Однако M.Broek-huijsen et al. [1] в ходе изучения генома ряда штаммов F. tularensis с помощью метода ДНК-микроматриц показали наличие у возбудителя туляремии восьми областей дифференциации RD (от англ. - region of difference), которые отличаются у производных F. tularensis nearctica и F. tularensis holarctica. Нуклеотидная последовательность RD1 области имеет делеции размером: 68 п.н. у F. tularensis mediasiatica, 598 п.н. у F. tularensis holarctica биоваров Ery± и 389 п.н. у F. tularensis holarctica биовара japonica, тогда как у F. tularensis nearctica делеции отсутствуют. Все это послужило основанием для выбора авторами данного участка в качестве ДНК-мишени для разработки подвидоспецифичных праймеров.
При оценке эффективности предложенных M.Broekhuijsen et al. праймеров нами было установ-
F. tularensis подвид nearctica F. tularensis
подвид holarctica биовар japonica F. tularensis
подвид holarctica биовар Ery F. tularensis подвид mediasiatica
лено, что несмотря на высокую специфичность ПЦР, чувствительность реакции составила не более 1-105 м.к./мл, а воспроизводимость - 70 %. Отрицательным моментом является амплификация участков размером более 1000 п.н.
С учетом непригодности данного варианта ПЦР-анализа для практического применения, нами на основании имеющихся в GenBank последовательностей RD1 участка (AF 469615, AF 469616, AF 469617, AF 469618) с помощью компьютерной программы Vector NTI 9.0.0 подобраны подвидоспецифичные олигонуклеотидные затравки и разработана двухэтапная методика ПЦР. Предлагаемые праймеры Ftjf-Ftjr и Ftef-Fter обеспечивают дифференцирование туляремийного микроба на подвиды near^^a и holarctica на основании различий в длине амплифицируемых фрагментов: у F. tularensis подвид nearctica - 326 п.н., у F. tularensis подвид holarctica биовары Ery± - 200 п.н., у F. tularensis подвид holarctica биовар japonica - 389 п.н. В ПЦР с ДНК штаммов подвида mediasiatica может наблюдаться образование фрагментов размером 326 и/или 389 п.н. С другой парой праймеров Ftmf-Ftmr в ПЦР со штаммами F. tularensis подвидов holarctica и nearctica образуется фрагмент размером 210 п.н, с F. tularensis подвид mediasiatica - 143 п.н.
Для определения диагностической ценности разработанных ПЦР-систем было исследовано 15 штаммов туляремийного микроба и 72 штамма гетерогенных микроорганизмов. В ходе ряда экспериментов установлено^ что чувствительность реакции составляет 1-10 м.к./мл, специфичность -100 % (размеры амплифицируемых фрагментов ДНК строго соответствовали подвидам исследуемых штаммов F. tularensis), воспроизводимость результатов - 100 %.
На основании полученных результатов разработан алгоритм идентификации подвидов туляре-мийного микроба путем двухэтапной ПЦР, представленный в таблице.
Таким образом, нами разработана методика идентификации подвидов туляремийного микроба на основании анализа RD1 области F. tularensis с помощью двухэтапной мультиплексной ПЦР.
Работа выполнена в рамках НИР по гранту РФФИ (ОФИ) 06-04-08152.
Идентификация подвидов туляремийного микроба
Pезyльтaты П^,
размеры фрагментов
Идентификация подвида I этап II этап
туляремийного микроба Праймеры Праймеры
Ftmf-Ftmr, Ftjf-Ftjr и Ftef-Fter,
п.н. п.н.
210 326
210 389
210 200
143 326/389
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41, N 7. - P. 2924-2931. -2. Johansson A., Ibrahim A., Goransson I. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 38. - P. 4180-4185. - 3. Puente-Re-dondo de la V.A., Blanco del N.G., Gutierrez-Martin C.B. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 38. - P. 10161022. - 4. Sjostedt A.B. // D.J.Brenner (ed.), Bergey’s manual of systematic bacteriology. - N.Y.: Springer-Verlag, 2003. -P. 200-210.
N.A.Ossina, M.S.Moshkova, D.V.Utkin, O.Yu.Lyashova, A.N.Kulichenko
Identification of Francisella tularensis Subspecies Using the Multiplex Polymerase Chain Reaction
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ”, Saratov
A procedure was elaborated to identify Francisella tularensis subspecies using the two-step multiplex PCR method. The RD1 differentiation domain was chosen as the DNA target with three primer pairs based on it. The formation of definite sizes of DNA fragments was characteristic of each tularemia pathogen subspecies.
Key words: Francisella tularensis, identification of microorganisms, multiplex PCR.
Поступила 05.02.07.
УДК 616.982.27-039
К.А.Ротов, В.В.Алексеев, Е.А.Снатенков, Н.П.Храпова, С.Н.Тихонов, В.И.Каплиев,
Ю.Ю.Целентис, Н.А.Чупрына
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ЛЕГОЧНОЙ ФОРМЫ ОСТРОГО МЕЛИОИДОЗА ЛИПОСОМАЛЬНЫМ ЦЕФАЗОЛИНОМ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Представлены данные по получению липосомального цефазолина, оценены его физико-химические свойства. При сравнительном изучении эффективности лечения легочной формы мелиоидоза цефазолином в свободной и липосомальной формах установлено, что иммобилизация антибиотика в липосомы позволила снизить ЕДз0 препарата в 2,7 раза.
Ключевые слова: мелиоидоз, цефазолин, липосомальная форма, лечение.
Мелиоидоз относится к бактериальным особо опасным инфекциям, протекающим в различных клинических формах (от молниеносной до латентной). Возбудитель мелиоидоза назван в числе вероятных агентов, которые могут быть применены в качестве биологического оружия [1]. Летальность от молниеносной формы мелиоидоза, даже при проведении интенсивного лечения, достигает 50-75 %, а антимикробная терапия нередко дает временный эффект, заболевание часто принимает рецидивирующий характер [4].
По тяжести клинического течения и летальности мелиоидоз занимает одно из первых мест среди особо опасных инфекций. Вместе с тем проблема экстренной профилактики и лечения мелиоидоза разработана недостаточно. Учитывая то, что в настоящее время практически нет средств специфической профилактики мелиоидоза, а набор эффективных препаратов, используемых для лечения ограничен, актуальность терапии данного заболевания не вызывает сомнений.
Одним из перспективных путей решения данной проблемы является использование липосом -носителей антибиотиков. Включение антимикробных препаратов в липосомы позволяет в ряде случаев пролонгировать их действие, обеспечить нетрадиционные пути доставки этих веществ в различные органы и ткани макроорганизма, повысить селективность их действия и снизить токсичность [5, 6].
Цель работы - изучение эффективности лечения легочной формы мелиоидоза липосомальным цефазолином в эксперименте.
Иммобилизацию цефазолина в липосомы производили методом выпаривания и обращения фаз [8]. Липосомальная мембрана состояла из хроматографически чистых лецитина (Харьковский завод бактерийных препаратов) и холестерина («Serva», Германия) в молярном соотношении 7:3. Для оценки включения в липосомы антибиотика холестерин растворяли в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) в конечной концентрации 150 ед/мл. Отделение невключившихся антибиотиков проводили после центрифугирования при 20000 об/мин в течение 1 ч на центрифуге Ja-21 «Beckman» (США). Количество невключившегося внутрь липосом препарата определяли микробиологическим методом [3]. Степень окисления липидов устанавливали по перекисному индексу Клейна [7]. Заражающая ас-пирационная доза Burkcholderia pseudomallei 100 -34 LD50 (101 м.к.). Лекарственный препарат в дозах 16, 8, 4, 2 мг для свободного цефазолина и 12, 6, 3,
1,5 мг для липосомального антибиотика вводили внутрибрюшинно 32 аутбредным белым мышам обоих полов массой 18-20 г (по 4 животных в группе) на следующие сутки от момента заражения 3 сут подряд, а затем - с интервалом 48 ч в течение 15 сут. Об эффективности лечения судили по проценту выживших и средней продолжительности жизни опытных животных, ED50 препарата (оценивали по методу Кербера) [2], по патоморфологической картине при аутопсии, результатам бактериологического исследования органов. Результат лечения липосомальным антибиотиком сравнивали с эффективностью лечения животных, получавших
