CC BY
88
УДК 577.217.34
Идентификация нового РНК-белкового контакта в комплексе рибосомного белка S7 с 3'-концевым фрагментом 16S рРНК Escherichia coli
А. В. Головин1, Г. А. Хайруллина1, Б. Крааль3, А. М. Копылов2*
1Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73
2Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3
3Химический институт Лейденского университета, Лейден, 2300RA, Нидерланды *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 02.07.2012
РЕФЕРАТ Самосборка 30S малой субчастицы прокариотических рибосом in vitro из рРНК и 20 белков происходит иерархически и начинается взаимодействием 16S рРНК с тремя ключевыми белками: S4, S8 и S7. Эти же белки регулируют трансляцию своих оперонов, узнавая мРНК, поэтому изучение РНК-белковых взаимодействий в бинарных комплексах важно для понимания биогенеза рибосом. В представленной работе идентифицирован необычный рРНК-белковый контакт в бинарном комплексе рекомбинантного рибосомного белка S7 со своим участком связывания на фрагменте 16S рРНК Escherichia coli (236 нуклеотидов). Методом УФ-индуцируемых РНК-белковых сшивок показано, что белок S7 сшивается с нуклеотидом U1321 16S рРНК. Проведена аннотация опубликованных рРНК-белковых сшивок белка S7 в составе 30S субчастицы E. coli в растворе и данных рентгеноструктурного анализа 30S субчастицы. Сшивка, обнаруженная в бинарном комплексе, отличается от сшивок в целой субчастице в растворе, а также от контактов в структуре субчастицы в кристалле. По-видимому, структура бинарного рРНК-белкового комплекса, образующегося в начале сборки малой субчастицы, подвергается перегруппировке в процессе формирования целой субчастицы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА рибосома, самосборка, рибосомный белок S7, УФ-индуцируемая сшивка.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ РСА - рентгеноструктурный анализ; РНП - рибонуклеопротеид; EcoS7, TthS7, BstS7 - белки S7 E. coli, T. thermophilus и B. stearothermophilus соответственно; Eco16S, Tth16S и Bst16S -фрагменты D3LH 16S рРНК E. rnli, T. thermophilus и B. stearothermophilus соответственно; Tth30S и Eco30S -малые субчастицы рибосом T. thermophilus и E. coli соответственно.
ВВЕДЕНИЕ
Самосборка бактериальных рибосом in vitro описана довольно подробно [1-5]. Известна феноменология событий, которые приводят к формированию отдельных субчастиц рибосом, однако детальный анализ взаимодействия рРНК и белков только начинается.
При образовании прокариотических 70S рибосом происходит раздельная сборка двух субчастиц: 30S малой и 50S большой. Малая субчастица рибосом Escherichia coli состоит из 16S рРНК длиной 1542 нуклеотида и 20 разных белков среднего размера. Определяющую роль в самосборке 30S субчастицы играют белки, которые первыми связываются с 16S рРНК (S4, S7, S8, S15), что приводит к формированию так называемого «структурного остова» малой
субчастицы [6, 7]. Очередная волна интереса к процессу сборки рибосом была вызвана расшифровкой структуры малой субчастицы термофильных и ме-зофильных рибосом при помощи рентгеноструктурного анализа (РСА) [8-10]. Появилась возможность описать последовательность событий при самосборке в конкретных структурных терминах [3, 4, 11]. Кроме того, потенциальная возможность вмешаться в процесс биогенеза рибосом может стимулировать создание принципиально новых мощных антибактериальных агентов.
В отличие от 50S субчастицы, экспериментальное изучение самосборки 30S субчастицы облегчается ярко выраженным дискретным характером ее структуры: она состоит из четырех доменов (рис. 1) [8, 9].
Рис. 1. Структура 30S малой субчастицы рибосом T. thermophilus по данным РСА (PDB 1FJF [8]). Обозначения доменов: 5' - 5'-концевой, С - центральный, 3'M - основной З'-концевой и 3'm - минорный З'-кон-цевой. Белки изображены темно-синими, оранжевыми и красными лентами, 16S рРНК - светло-синей, голубой, желтой и розовой лентами. Наверху в крупном масштабе показана структура комплекса белка S7 с фрагментом 16S рРНК (Eco16S), экстрагированная in silico
Три РНП-домена способны собираться независимо [12-17]. Для основного З'-концевого домена найден минимальный фрагмент 16S рРНК E. coli длиной 236 нуклеотидов (D3LH, Eco16S), способный специфически связываться с ключевым участником сборки субчастицы - белком S7 [18].
Настоящая работа посвящена изучению рРНК-белковых контактов в бинарном комплексе рекомбинантного рибосомного (р-) белка S7 с участком связывания на фрагменте 16S рРНК E. coli с использованием УФ-индуцированных РНК-белковых сшивок. Идентифицирован необычный рРНК-белковый
контакт - белок S7 сшивается с нуклеотидом U1321. Проведена аннотация опубликованных ранее рРНК-белковых сшивок белка S7 в 30S субчастице в растворе и данных РСА для кристалла малой субчастицы. Обнаруженная нами новая рРНК-белковая сшивка в бинарном комплексе не совпадает с аннотированными сшивками в целой субчастице. Можно предположить, что структура бинарного рРНК-белкового комплекса, образующегося на начальных этапах сборки малой субчастицы рибосом, должна подвергаться перестройке при образовании целой субчастицы.
экспериментальная часть
В работе были использованы полинуклеотидкина-за фага Т4 (PNK) и буфер для PNK («New England Biolabs», США), обратная транскриптаза вируса мие-лобластоза птиц (RT-AMV), ДНК-полимераза Taq, ингибитор РНКаз, протеиназа К, нуклеозидтрифосфа-ты и их дидезоксипроизводные («Roche», Германия), [у_32Р]АТР («Amersham», Германия), бычий сывороточный альбумин (BSA, MBI, «Fermentas», Литва), нитроцеллюлозные фильтры 0.45 мкм («Millipore HA», США; «Schleicher & Schuell» BA85, Германия), Ni-NTA-агароза («QIAGEN», Германия), фенилме-тилсульфонилфторид (PMSF, «Merck», Германия). Плазмида рFD3LH любезно предоставлена Л. Браки-Жингра (Монреальский университет, Канада).
Буфер А: 50 мM Трис-HCl (рН 9.5), 1.5 мM MgCl2, 20 мM (NH4)2SO4, 1 hM дитиотреитол (DTT), 0.005% NP-40, 5% диметилсульфоксид (DMSO), 1 мМ бетаин. Буфер Б: 40 mM Трис-HCl (рН 7.9), 12 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM спермидин. Буфер В: 0.3 М NaАс (рН 5.2), 1 мМ EDTА, 0.2% фенол. Буфер Г: 50 mM Hepes-KOH (pH 7.0), 100 mM KCl. Буфер Д: 50 mM Трис-HCl (рН 8.5), 10 mM MgCl2, 60 mM KCl, 10 mM DTT, 0.5 mM dNTP. Буфер Е: 20 мМ Трис-Ас (рН 7.8), 7 мМ МgAc2, 300 mM NH4Cl, 0.2% BSА.
Выделение рекомбинантных белков S7 E. coli (EcoS7) и S7 Thermus thermophilus (TthS7) из суперпродуцентов E. coli
EcoS7 выделяли из суперпродуцента E. сoli по протоколам фирмы «QIAGEN» как кратко описано ранее [19]. Клетки собирали центрифугированием, суспендировали в 50 mM Трис-HCl (pH 8.0), содержащем 500 mM NaCl и лизоцим. После инкубации добавляли глицерин до 10%, меркаптоэтанол до 5 mM, PMSF до 0.5 mM и Тритон X-100 до 1%. После обработки ультразвуком тельца включения растворяли в буфере, содержащем 8 М мочевину, наносили на Ni-NTA-агарозу и после промывки концентрацию мочевины в элюенте понижали до нуля. Белок элюировали градиентом раствора имидазола 0-0.5 М в буфере 50 mM Трис-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 1 mM меркаптоэта-
нол, 5% глицерин, 0.5 mM PMSF. Белок переводили диализом в буфер 20 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.2 mM DTT, 5% глицерин, 0.5 mM PMSF и хранили при -70°С. Перед комплексообразованием белок переводили в буфер 20 мМ Трис-HCl (pH 7.6), 4 мМ MgAc2, 400 мМ NH4Cl, 0.2 мМ EDTA, 4 мМ меркап-тоэтанол. Белок TthS7 выделяли таким же образом [19, 20].
Амплификация ДНК с помощью ПЦР
Фрагмент матричной ДНК амплифицировали с плазмиды рFD3LH, которая содержала кДНК минимального фрагмента 16S рРНК под контролем промотора фага Т7. ПЦР проводили в 50-400 мкл буфера А, содержащего 200 mM dNTP, 20 пмоль праймеров, от 50 до 500 нг рFD3LH, 2-5 ед. акт. ДНК-полимеразы Taq. 5'-Концевой праймер AGGGATCCTAATACGACTCACTATAGGG соответствует промоторной последовательности РНК-полимеразы фага Т7 и комплементарен векторной последовательности; 3'-концевой праймер GTAAGCTTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACC комплементарен фрагменту G1370 -U1393 Eco16S (некомплементарная последовательность подчеркнута). Праймеры синтезированы фирмой «MWG-Biotech AG», Германия. ПЦР проводили в термоциклере («BioRad», США) в следующих условиях: предварительная инкубация - 95°С, 2 мин; цикл - 95°С, 45 с; 60°С, 30 с; 72°С, 30-60 с. После 25 циклов дополнительно инкубировали при 72°С в течение 4 мин. ДНК очищали электрофорезом в 1-2% агарозном геле, экстракцией тремя объемами (по массе геля) 6 М Nal (560С, 5 мин) с последующей очисткой при помощи PCR Purification Kit («Roche», Германия).
Транскрипция фрагмента 16S рРНК (Eco16S) in vitro Транскрипцию Eco16S проводили на ПЦР-копии матричной ДНК, содержащей промотор РНК-полимеразы фага Т7, в 100 мкл раствора следующего состава: 2.5 mM NTP, 1000 ед. акт. РНК-полимеразы фага Т7, 60 ед. акт. ингибитора РНКаз, 1 мкг/мл пиро-фосфатазы, 4 мкг матрицы ДНК, в буфере Б при 370С в течение 4 ч. После транскрипции раствор подвергали фенольной депротеинизации с последующей экстракцией хлороформом и осаждением этанолом. РНК очищали в 8% ПААГ с 7 М мочевиной и элюировали диффузией из геля в буфере В. После элюции РНК обрабатывали фенолом, хлороформом и осаждали этанолом. Осадок РНК растворяли в 50 мкл воды, целостность РНК проверяли электрофорезом в 8% ПААГ с 7 М мочевиной. Концентрацию РНК определяли по поглощению при 260 нм: 1 мг РНК - 22 о.е.
Получение комплексов EcoS7-Eco16S иTthS7-Eco16S
Комплексообразование проводили в 200 мкл буфера Е. РНК и белок ренатурировали раздельно при 37°С в течение 30 мин, смешивали и прогревали (37°С, 30 мин). Степень образования комплексов определяли сорбцией на нитроцеллюлозных мембранах при скорости фильтрации 0.5 мл/мин, титруя постоянное количество меченной 32Р РНК возрастающим количеством белка [19]. Радиоактивность фильтров определяли в 10 мл воды по Черенкову на счетчике Tracor Analytic (Франция). Кажущуюся константу диссоциации (aKd) рассчитывали с помощью программы XMGRACE, GNU (http://plasma-gate.weizmann. ac.il/Grace/), используя следующее уравнение:
а ■■
где Р0 - концентрация белка S7, R0 - фиксированная концентрация Eco16S, Кй* (аКй) - кажущаяся константа диссоциации, а - доля связанной в комплексе Eco16S.
УФ-индуцированная ковалентная РНК-белковая сшивка в комплексах EcoS7-Eco16S и TthS7-Есо168
Комплексообразование проводили в 200 мкл буфера Е при концентрации РНК 150 нМ и 10-кратном мольном избытке белка. Белок ренатурировали при 37°С, смешивали с РНК и прогревали при 37°С в течение 30 мин. Комплекс в течение 10 мин облучали УФ-светом при 260 нм («Stratolmker», США, мощность 2400 мкВ) во льду с источником, удаленным на 15 см. Интенсивность облучения контролировали уридинометрией.
Получение меченных 32Р по 5'-концу олигодезоксирибонуклеотидных праймеров
Меченый праймер (З'-концевой праймер для ПЦР) для обратной транскрипции получали кинирова-нием РПК в присутствии [у-32Р]АТР. РПК-буфер (10 мкл), содержащий 20 пмоль праймера, 3 мкл [у_32Р]АТР (0.4 МБк/мкл), 10 ед. акт. РПК, инкубировали при 370С в течение 1 ч. Реакцию останавливали добавлением 90 мкл 0.3 М ПаАс (рН 5.2) с последующей фенольной депротеинизацией и экстракцией хлороформом. Праймер осаждали этанолом и растворяли в 40 мкл воды.
Картирование нуклеотида Eco16S, сшитого с белком S7, в комплексах EcoS7-Eco16S и TthS7-Eco16S
После облучения комплекс обрабатывали протеи-назой К для удаления белка S7. Нуклеотид Eco16S,
сшитый с белком S7, картировали при помощи обратной транскрипции, используя меченный по 5'-концу праймер. Гибридизацию праймера с РНК проводили в 4.5 мкл буфера Г, содержащего 2-5 пмоль РНК и 0.5 пмоль праймера. РНК денатурировали при 950С в течение 1 мин с последующим медленным охлаждением до 42.50С. Обратную транскрипцию проводили в 8.5 мкл буфера Д, содержащего 2.2 ед. акт. RT-AMV при той же температуре в течение 1 ч. В контроль-
А
Рис. 2. Корреляция данных РСА 30S субчастицы E. coli в кристалле и данных по сшивкам этой субчастицы в растворе. А — Структура комплекса EcoS7—Eco16S, экстрагированная in silico из Eco30S. Голубая лента -Eco16S, синяя лента — белок S7. Рамками обозначены РНК-белковые сшивки: 1 — U1240—Met115; 2 — C1378— Lys75; 3 — Ш321—белок S7 в бинарном комплексе, данная работа (таблица). Б — Увеличенное изображение рРНК-белковых контактов рис. 2А
ном секвенировании добавляли 70-400 мкМ одного из ddNTP. Образцы анализировали в 8% ПААГ, содержащем 7 М мочевину.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известная на настоящий момент пространственная структура 30S малой субчастицы рибосом получена как для термофильных бактерий T. thermophilus (Tth30S) методом РСА [8, 9], так и для E. coli [10]. Биохимических данных, описывающих сборку 30S субчастицы T. thermophilus в растворе, не существует, установлена только возможность доменной сборки [14, 15, 17]. Основная масса биохимических данных по самосборке рибосом получена на рибосомах E. coli. В связи с этим безусловный интерес представляет анализ корреляции биохимических данных, полученных для Eco30S в растворе, и данных РСА для Eco30S и Tth30S.
РНК-белковые сшивки широко использовались для изучения контактов в 30S субчастице бактериальных рибосом в растворе. Описано несколько сшивок 16S рРНК и белка S7 в составе 30S субчастицы E. coli (таблица). Две такие характерные сшивки идентифицированы достоверно - это U1240-Met115 и C1378-Lys75, что хорошо коррелирует с данными РСА кристаллов (таблица, рис. 2). Поэтому в настоящей работе мы использовали УФ-индуцируемое сшивание для идентификации возможных рРНК-белковых контактов в бинарном комплексе фрагмента Eco16S с белком S7. Ранее было показано, что комплекс белка S7 с целой 16S рРНК при УФ-облучении образует сшивку [32], однако, сшиваемые остатки не были установлены.
[Р], нМ [Р], нМ
Рис. 3. Изотермы связывания для комплексов EcoS7—Eco16S (Л) и TthS7—Eco16S (Б). аКё = 21.5 ± 1.9 и 35.8 ± 9.3 нМ соответственно. Исходная концентрация Eco16S — 20 нМ, [Р] — концентрация белка, Rь — доля связанной с белком Eco16S
Анализ корреляции данных РСА 30S субчастицы рибосом E. coli и данных по сшивкам 16S рРНК—белок S7 в 30S субчастице в растворе
№ Сшивка с 16S рРНК Сшивка с белком S7 Расстояние в Eco30S, Â Реагент Размер реагента, Ссылка
1.1 A1238-U1240 S7 3.0 АФИ 8.6 [21]
1.2 A1238-U1240 S7 3.0 ИТ 5 [22]
1.3* U1240 M115** 2.7 ИТ 5 [23-25]
1.4 U1240*** S7 2.7 УФ 0 [26]
1.5 16S рРНК М115** 2.7 УФ 0 [27]
2.1 A1377-C1378 S7 3.8 ИТ 5 [22]
2.2 C137B K75 3.8 ИТ 5 [25]
Примечания. Нумерация в первом столбце: первая цифра обозначает номер контакта - 1 (1238-1240) или 2 (1377-1378), вторая цифра - порядковый номер сшивки: 1-5 для первого контакта, 1-2 для второго. АФИ -метил-л-азидофенилацетимидат; ИТ - 2-иминотиолан.
*Аналогичная сшивка идентифицирована в малой субчастице Bacillus stearothermophilus (Met115 Bst7) [24, 27]. **В работах [23-25, 27] Met115 обозначается как Met114 (ошибка в секвенировании белка EcoS7 [28], пропущен R91 [29]).
***До 1979 г. использовали ошибочную нумерацию 16S рРНК [30] (U1239 вместо U1240).
Данные, не включенные в таблицу. А) 30S субчастица E. coli. 1. Идентифицирована сшивка С1265 16S рРНК с белком S7 [30]. C1265 находится на расстоянии 35 Ä от ближайшего аминокислотного остатка белка S7 в Eco30S. 2. Идентифицированы сшивки 278-280, 1139-1144, 1155-1158, 1531-1542 16S рРНК с белком S7 [31]. Минимальное расстояние между районом 1531-1542 16S рРНК и белком S7 в Eco30S составляет 11 Ä. Б) 30S субчастица B. stearothermophilus: идентифицирована сшивка 16S рРНК с Lys8 белка S7 [27].
Как показала Браки-Жингра и соавт. [18] белок EcoS7 способен связываться с небольшим фрагментом 16S рРНК (236 нуклеотидов, D3LH, Eco16S) -узловым элементом структуры основного З'-концево-го домена 16S рРНК. Комплекс EcoS7 и Eco16S авторы получали с использованием EcoS7, выделенного стандартным методом из суммарного белка рибосом [33]. Кажущаяся константа диссоциации комплекса (aKd) такого белка была довольно высокой - 620 ± 80 нМ [18]. В дальнейшем использовали рекомбинантный белок, содержащий шесть дополнительных остатков гистидина (6 His) на N-конце. Рекомбинантный белок также связывался с Eco16S, его aKd была гораздо меньше в диапазоне 110-210 нМ [34, 35]. Как полагают, дополнительный фрагмент, содержащий 6 His, не влияет на связывание белка с 16S рРНК [35], а различие в константах отражает разницу в методах выделения. В настоящей работе был использован рекомбинантный белок EcoS7, который имел N-концевые 6 His [19]. Комплекс EcoS7 с Eco16S оказался более стабильным, чем считалось [34, 35], а его aKd составляла 21.5 ± 1.9 нМ (рис. 3), что свидетельствует о высокой активности.
Комплекс EcoS7-Eco16S облучали УФ-излучением, эффективность сшивки оценивали электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях по соотношению радиоактивности в зоне РНП к суммарной радиоактивности рРНК. Время облучения выбирали при максимальном значении выхода сшитого РНП. Для идентификации контакта Eco16S с EcoS7 положение сшитых с белком гетероциклических оснований рРНК определяли с помощью обратной транскрипции после гидролиза белка про-теиназой К, принимая во внимание, что обратная транскриптаза останавливается за один нуклеотид до модифицированного. Анализ «сшитого» комплекса Eco16S с EcoS7 (рис. 4, дорожка 2) однозначно выявляет уникальный стоп-сигнал, соответствующий нуклеотиду С1322 (сшивка с U1321). В остальных местах дополнительных «стопов» не обнаружено. Положение сшивки показано на третичной структуре 30S субчастицы рибосом E. coli (рис. 2).
Идентифицированный контакт Eco16S рРНК с белком EcoS7 отличается от уже известных контактов, образующихся при сшивании 16S рРНК с белком S7 в малой субчастице рибосом E. coli в растворе (та-
блица). Более того, найденный нами контакт Eco16S с белком EcoS7 не соответствует и структуре аналогичного РНП-домена в составе 30S субчастицы E. coli в кристалле (рис. 2): ближайший к U1321 аминокислотный остаток белка S7 расположен на расстоянии 35 Ä (таблица).
C U
A
G 2 3
Г" 7г
A1289
C1322
U1330
Рис. 4. Анализ сшивки EcoS7 и TthS7 с Eco16S в бинарных комплексах. Фрагмент радиоавтографа электрофореза в 8% ПААГ с 8 М мочевиной продуктов обратной транскрипции Eco16S с праймера. 1 - кДНК с Eco16S рРНК после УФ-облучения. С, и, А, G - продукты секвенирования Eco16S рРНК (А1289-Ш330).
2, 3 - Анализ УФ-облученных комплексов Есо16Б рРНК с белками EcoS7 и TthS7 соответственно. Стрелкой указана зона, соответствующая С1322 (сшивка с и1321)
Найденное различие можно объяснить тем, что при взаимодействии белка S7 с 16S рРНК на начальных этапах самосборки рибосомы структура образуемого бинарного комплекса отличается от конечной структуры соответствующего РНП-домена в составе субчастицы. Исходя из анализа структуры РНП-домена в структуре Eco16S и Tth30S, можно предположить, что для Eco16S в бинарном комплексе с белком S7 скорее всего характерно развернутое состояние пучка из четырех спиралей (Н30, Н41, Н42, Н43), которые в кристаллической структуре Eco16S и Tth30S упакованы вместе бок о бок [19]. Вероятно, для стабилизации бинарного комплекса в компактном состоянии при самосборке рибосом требуются дополнительные факторы, например, локально высокая концентрация ионов магния [19] или взаимодействие с другими белками домена. Это предположение согласуется с наличием у термофильных рибосом дополнительного особого белка ^х, который имеет сильно основной характер и, таким образом, может стабилизировать компактную структуру этого РНП-домена [8, 9].
Безусловный интерес представляет сравнительное изучение структуры гетерологичного комплекса белка TthS7 с Eco16S. В данном случае белок TthS7 может рассматриваться как «природный мутант» белка EcoS7 [19]. Как показано нами ранее [19, 36], TthS7 может образовывать стабильные комплексы с Eco16S. В данной работе гетерологичный комплекс имел аКй 35.8 ± 9.3 нМ (рис. 3), что сравнимо с аКй гомологичного комплекса EcoS7-Eco16S (аКй = 21.5 ± 1.9 нМ). Места контакта рекомбинантного TthS7 с фрагментом Eco16S идентифицировали так же, как и в случае комплекса Eco16S с EcoS7: с белком TthS7 сшивается и1321 (рис. 4). По-видимому, в гетерологичном комплексе существует похожий РНК-белковый контакт. Интересно, что позиция 1321 в 16S рРНК очень консервативна филогенетически, и замена выявлена только у термофильных 16S рРНК (рис. 5).
Есо 926 GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCT 98 6
Tth 926 GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA 98 6
Есо 1219 AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCT 1283
Tth 1219 TGGGCGACACACGTGCTACAATGCCCACTACAAAGCGATGCCACCCGGCAACGGGGAGCTAATCG 1283
Есо 1284 CATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTA 1346
Tth 12 84 CAAAAAGGTGGGCCCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACCCGACCCCATGAAGCCGGAATCGCTA 134 6
Есо 1347 GTAATCGTGGATCAGA-ATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT 1393
Tth 1347 GTAATCGCGGATCAGCCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT 1394
Рис. 5. Сравнение первичных структур фрагментов Есо^ и
Нумерация нуклеотидов в Eco16S стандартная, в Tth16S - согласно РОВ [12] для
Жирным выделены неидентичные нуклеотиды. Двутяжевые участки выделены серым
Рис. 6. Модель вторичной структуры фрагмента основного З'-концевого домена16S рРНК (D3LH, Eco16S), использованного в данной работе [18]. РНК-белковые сшивки указаны стрелками. Данные по сшивкам взяты из таблицы. Для 30S субчастицы рибосом E. coli: 1 -сшивка U1240-M115; 2 - сшивка C1378-K75. Для бинарного комплекса: 3 - сшивка и1321-белок S7, идентифицированная в нашей работе. В рамках показаны участки 16S рРНК, идентичные участку связывания S7 на стреп-томициновой мРНК [30]
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе показано, что для изучения первых этапов сборки малой субчастицы рибосом бактерий можно получать бинарные комплексы рибосом-ного белка S7 с его локальным участком связывания на 16S рРНК. Такая возможность хорошо согласуется с показанной ранее возможностью сборки отдельных доменных РНП-комплексов бактериальных рибосом [5, 37]. При УФ-облучении бинарных комплексов (260 нм) как в гомологичном (EcoS7-Eco16S), так и в ге-терологичном (TthS7-Eco16S) комплексе с белком S7 сшивается остаток Ш321. Как результат поиска сходных структур в 16S рРНК и мРНК Саито и Номура [38] предположили, что рекомбинантный белок S7 узнает определенный мотив в структуре 16 рРНК, расположенный рядом с обнаруженной сшивкой (рис. 6). Более того, идентифицирована сшивка белка S7 с фрагментом мРНК рядом с предполагаемым мотивом [39]. Совокупность этих данных говорит
в пользу предположения Саито и Номуры [38] о возможности первичного узнавания белком S7 данного мотива РНК.
Можно предположить, что формирование целой малой субчастицы рибосом приводит к реорганизации контактов в первоначальном бинарном комплексе. Подобная перегруппировка наблюдается и в других РНК-белковых комплексах; например, в комплексах тРНК с фенилаланин-тРНК-синтетазой [40]. Интересные перегруппировки обнаружены и при диссоциации бинарных РНК-белковых комплексов [41].
Авторы благодарят А.А. Богданова, Ю. Брозиуса, Т.И. Рассохина, Т.С. Рождественского,
В.А. Спиридонову за интерес, полезные дискуссии и поддержку.
Работа поддержана DAAD,
РФФИ (грант № 11-04-01990-а), РФФИ-НВО (гранты № 03-04-89001, 047.015.018).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Spirin A.S. // Ribosomes / Ed. Siekevitz P. N.Y.: Kluwer Acad./Plenum Publ., 1999. P. 98-101.
2. Nomura M. // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 6857-6864.
3. Culver G.M. // Biopolymers. 2003. V. 68. P. 234-249.
4. Williamson J.R. // RNA. 2003. V. 9. P. 165-167.
5. Mulder A.M., Yoshioka C., Beck A.H., Bunner A.E., Milligan R.A., Potter C.S., Carragher B., Williamson J.R. // Science.
2010. V. 330. № 6004. P. 673-677.
6. Bogdanov A.A., Kopylov A.M., Shatsky I.N. // Subcell. Biochem. 1980. V. 7. P. 81-116.
7. Nowotny V., Nierhaus K.H. // Biochemistry. 1988. V. 27.
P. 7051-7055.
8. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M. Jr., Morgan-Warren R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch T., Ramakrishnan V. // Nature. 2000. V. 407. P. 327-339.
9. Schluenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann M., Janell D., Bashan A., Bartels H., Agmon I., Franceschi F., Yonath A. // Cell. 2000. V. 102. P. 615-623.
10. Dunkle J.A., Xiong L., Mankin A.S., Cate J.H.D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. P. 17152-17157.
11. Копылов А.М. // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 372-382.
12. Weitzmann C.J., Cunningham P.R., Nurse K., Ofengand J. // FASEB J. 1993. V. 7. P. 177-180.
13. Samaha R.R., O'Brien B., O'Brien T.W., Noller H.F. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 7884-7888.
14. Agalarov S.C., Selivanova O.M., Zheleznyakova E.N., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I., Spirin A.S. // Eur. J.
Biochem. 1999. V. 266. P. 533-537.
15. Agalarov S.C., Zheleznyakova E.N., Selivanova O.M., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I., Vasiliev V.D., Spirin A.S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 999-1003.
16. Jagannathan I., Culver G.M. // J. Mol. Biol. 2003. V. 330.
P. 373-383.
17. Serdyuk I., Ulitin A., Kolesnikov I., Vasiliev V., Aksenov V., Zaccai G., Svergun D., Kozin M., Willumeit R. // J. Mol. Biol. 1999. V. 292. P. 633-639.
18. Dragon F., Brakier-Gingras L. // Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. P. 1199-1203.
19. Рассохин Т.И., Головин А.В., Петрова Е.В., Спиридонова В.А., Каргинова О.А., Рождественский Т.С., Брозиус Ю., Копылов А.М. // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 617-627.
20. Karginov A.V., Karginova O.A., Spiridonova V.A., Kopylov A.M. // FEBS Lett. 1995. V. 369. P. 158-160.
21. Osswald M., Greuer B., Brimacombe R., Stoffler G., Baumert H., Fasold H. // Nucl. Acids Res. 1987. V. 15. P. 3221-3240.
22. Wower I., Brimacombe R. // Nucl. Acids Res. 1983. V. 11.
P. 1419-1437.
23. Urlaub H., Thiede B., Muller E.C., Wittmann-Liebold B. // J. Protein Chem. 1997. V. 16. P. 375-383.
24. Urlaub H., Kruft V., Wittmann-Liebold B. Methods in Protein
Structure Analysis. N.Y.: Plenum Press, 1995. P. 275-282.
25. Urlaub H., Thiede B., Muller E.C., Brimacombe R., Wittmann-Liebold B. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 1454714555.
26. Zwieb C., Brimacombe R. // Nucl. Acids Res. 1979. V. 6.
P. 1775-1790.
27. Urlaub H., Kruft V., Bischof O., Muller E.C., WittmannLiebold B. // EMBO J. 1995. V. 14. P. 4578-4588.
28. Reinbolt J., Tritsch D. // FEBS Lett. 1978. V. 91. P. 297-301.
29. Johanson U., Hughes D. // Gene. 1992. V. 120. P. 93-98.
30. Ehresmann B., Backendorf C., Ehresmann C., Millon R., Ebel J.P. // Eur. J. Biochem. 1980. V. 104. P. 255-262.
31. Greuer B., Osswald M., Brimacombe R., Stoffler G. // Nucl. Acids Res. 1987. V. 15. P. 3241-3255.
32. Ehresmann B., Reinbolt J., Backendorf C., Tritsch D., Ebel J. // FEBS Lett. 1976. V. 67. P. 316-319.
33. Wittmann H.G. Ribosomes. Cold Spring Harbor: CSHL, 1974. P. 93-114.
34. Robert F., Brakier-Gingras L. // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. P. 677-682.
35. Robert F., Gagnon M., Sans D., Michnick S., Brakier-Gingras L. // RNA. 2000. V. 6. P. 1649-1659.
36. Spiridonova V.A., Golovin A.V., Drygin D.Yu., Kopylov A.M. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V. 44. P. 1141-1146.
37. Agalarov S.C., Selivanova O.M., Zheleznyakova E.N., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I., Spirin A.S. // Eur. J. Biochem. 1999. V. 266. № 2. P. 533-537.
38. Saito K., Nomura M. // J. Mol. Biol. 1994. V. 235. № 1.
P. 125-139.
39. Golovin A., Spiridonova V., Kopylov A. // FEBS Lett. 2006.
V. 580. № 25. P. 5858-5862.
40. Klipcan L., Moor N., Finarov I., Kessler N., Sukhanova N., Safro M.G. // J. Mol. Biol. 2012. V. 415. № 3. P. 527-537.
41. Anunciado D., Dhar A., Gruebele M., Baranger A.M. // J.
Mol. Biol. 2011. V. 408. P. № 5. P. 896-908.
