CC BY
57
© Е.Н. Телышева, 2014
УДК 616-006:575.17-078
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОНКОМАРКЕРОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИНВАЗИВНЫХ И НЕИНВАЗИВНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Е.Н. Телышева
ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, г. Москва
IDENTIFICATION OF MOLECULAR-GENETIC ONCOMARKERS WITH USING INVASIVE AND NON-INVASIVE METHODS OF INVESTIGATION
E.N. Telysheva
Russian Scientific Center of Roentgenology and Radiology, Moscow
Телышева Екатерина Николаевна — младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики 117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д. 86, тел. +7-917-513-53-40, e-mail: [email protected] Telysheva E.N. — junior researcher of the Laboratory of Molecular Biology and Cytogenetics 86 Profsoyuznaya St., Moscow, Russian Federation, 117997, tel. +7-917-513-53-40, e-mail: [email protected]
Реферат. Представлены результаты сравнительного анализа мутаций в гене B-Raf с использованием трех методов: прямое секвенирование по Сэнгеру; мутационно-специфическая ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» и секвенирова-ние следующего поколения (NGS). Были исследованы восемь пар образцов ДНК, выделенной из опухолевой ткани и плазмы крови пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями кожи. Полученные результаты позволили сделать вывод, что применение анализа свободно-циркулирующей ДНК в качестве неинвазивного метода исследования требует строгой стандартизации биологического материала и протокола его подготовки.
Ключевые слова: плазма крови, свободно-циркулирующая ДНК, неинвазивный метод, секвенирование следующего поколения (NGS).
Abstract. In this article results of comparative analysis of B-Raf mutations using three techniques: Sanger sequencing, real-time PCR and Next-generation sequencing (NGS) are presented. Eight pairs of samples, extracted from tumor tissue and blood plasma of patients with malignant and benign skin diseases were investigated. Results obtained in this work led us to the conclusion that cell-free circulating DNA analysis as non-invasive method of investigation requires the hard standardization of biological sample and its preparation protocols.
Key words: blood plasma, cell-free circulating DNA, non-invasive method, next-generation sequencing (NGS).
Введение
Частота онкологических заболеваний во всем мире до сих пор остается высокой. В соответствии с данными ВОЗ, смертность от рака к 2030 году может возрасти на 45% из-за старения населения [1]. По этой причине усилия многих исследовательских групп направлены на поиски чувствительных и специфических биологических маркеров для ранней диагностики, прогноза и наблюдения за пациентами в процессе лечения различных онкологических заболеваний.
Несмотря на то, что на сегодняшний день ДНК, выделенная из опухолевой ткани, является золотым
стандартом для молекулярно-генетических исследований, существуют серьезные ограничения, связанные с ее применением. Очень часто биопсийный материал невозможно получить, или его получение связано с определенными трудностями и серьезными клиническими осложнениями для пациентов [2]. Операционный материал тоже не всегда пригоден для исследования, что может быть связано, например, с процессом приготовления гистологических препаратов. Важно также отметить, что одним из свойств опухолевой ткани является гетерогенность, которая определяется различными молекулярно-генетическими профилями опухолевых клеток. Поэтому использование
■ > 1 ; I . г ■ I I г I I I ■ I I г
С I * с СТА С Атслллт С Г С в Л
74 17 Т» 79 В4 II К II Н II Н I! Н ** Я #1 М II 14 15
Рис. 1. Образец ДНК опухолевой ткани с мутацией в 15-м экзоне гена B-Raf (метод прямого секвенирования по Сэнгеру)
операционного или биопсийного материала далеко не всегда позволяет получить полную характеристику опухоли [3]. Учитывая также, что в процессе проведения дальнейшей терапии молекулярно-генетиче-ская характеристика опухолевых клеток изменяется, важно прослеживать эти изменения для корректировки проводимой терапии. Получение биопсийного материала в динамике не всегда возможно.
Свободно-циркулирующие нуклеиновые кислоты (сцНК) в плазме и сыворотке крови, которые были открыты более трех десятилетий назад, вызывают большой интерес в качестве объекта для проведения молекулярно-генетических исследований. Были предприняты попытки выявить корреляцию между концентрацией внеклеточной ДНК и развитием ряда патологических состояний [4]. Показано, что количества сцДНК существенно возрастают у людей с некоторыми заболеваниями, и что сцДНК могут нести множество генетических и эпигенетических нарушений, отражающих процессы канцерогенеза.
Анализ сцДНК и исследование возможного их применения для диагностики и мониторинга лечения проводят для довольно широкого диапазона заболеваний, в том числе для диабета, онкологических и аутоиммунных заболеваний. Первой опухоль-специфичный маркер, обнаруженный в крови онкологических больных, был мутированный КаБ-ген. Большинство исследований, сконцентрированных на выявлении мутированного гена К-КаБ в плазме или
сыворотке крови, проводили на пациентах с диагнозом «колоректальный рак» и «рак поджелудочной железы», что связано с высокой частотой выявления мутаций К-КаБ при данных патологиях [5].
Несмотря на рост исследований, связанных со сцДНК, на сегодняшний день некоторые важные аспекты биологии циркулирующих НК, такие как механизмы их высвобождения, способ циркуляции и биологическая роль в прогрессировании рака, до сих пор остаются неизвестными. Лимитирующими факторами в исследовании сцДНК в основном являются их низкая концентрация и несовершенство методов анализа [1].
Цель работы — оценить возможность использования свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови для анализа соматических мутаций при онкологических заболеваниях.
Материалы и методы исследования
На базе ФГБУ «РНЦ Рентгенорадиологии» Минздрава России обследовано семь пациентов с диагнозом «злокачественное заболевание кожи» (3 — с локальной болезнью, 4 — с региональными метастазами) и один пациент с диагнозом «доброкачественная патология кожи» (невус). Были собраны гистологические образцы операционного материала и образцы плазмы крови. Кровь забирали до операции(16 мл) в пробирки с ЭДТА перед хирургическим лечением.
Рис. 2. Образец ДНК опухолевой ткани с выявленной мутацией в 15-м экзоне гена B-Raf (метод ПЦР в режиме «реального времени»)
В течение часа после забора крови плазму отделяли от клеточного дебриса путем трехэтапного центрифугирования по 15 мин. при 4°С: при 1400 об/мин.; при 3400 об/мин.; при 4400 об/мин., соответственно. Аликвоты плазмы (по ~ 5 мл) хранили при температуре -80°С до проведения исследования.
ДНК из гистологических образцов выделяли с помощью наборов DNA Clean&Concentrator-5 (Zymo Recearch). Свободно-циркулирующую ДНК выделяли из плазмы с помощью QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen), согласно инструкции производителя.
Для исследования образцов ДНК на наличие мутаций в гене B-Raf применяли три метода анализа: прямое секвенирование по Сэнгеру (рис. 1); мутаци-онно-специфическая ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» («Евроген») (рис. 2) и секвенирование следующего поколения (NGS) с помощью наборов «CancerSnap», включающих 62 региона 17 генов (ООО «Номотек»).
Результаты и обсуждение
Был проведен сравнительный анализ восьми пар образцов ДНК, выделенной из опухолевой ткани и плазмы крови.
Мутации в гене B-Raf в ДНК опухолевой ткани определяли вышеуказанными тремя методами. В шести
случаях были получены одинаковые результаты: при применении всех трех методов была выявлена мутация У600Е. В двух случаях данная мутация была выявлена лишь двумя методами: ПЦР в режиме «реального времени» и ^Б (табл. 1). Можно предположить, что причиной этого является небольшой процент опухолевых клеток с мутированным геномом, что связано с гетерогенностью опухоли. Также нельзя исключить и методические сложности, связанные с подготовкой исследуемого материала. Для проведения корректного исследования образец опухолевой ткани должен содержать не менее 60% опухолевых клеток.
Анализ мутаций в ДНК, выделенной из плазмы крови, проводили методом ^Б с помощью наборов «СапсегБпар», которые предназначены непосредственно для применения в клинической практике. Результаты проведенного исследования (первые данные, полученные с помощью панели «СапсегБпар») показали, что только в одном из восьми образцов плазмы была выявлена мутация У600Е в гене В-Ка£ Следует особо остановиться на этом случае. У данного пациента была проведена операция по поводу удаления злокачественного образования кожи спины с метастазом в правый подмышечный лимфоузел. То есть анализ свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови был проведен в момент наибольшей опухолевой нагрузки. В остальных случаях мутации в гене
Таблица 1. Мутации в гене B-Raf в ДНК опухолевой ткани
Образец Секвенирование по Сэнгеру ПЦР в режиме «реального времени» Мутантная ДНК опухолевой ткани, %
3344 + + + 56.9
4149 + + + 0.7
4328 - + + 4.5
4354 + + + 40.7
4546 + + + 27.0
4606 - + + 1.6
4648 + + + 85.6
4701 + + + 27.5
B-Raf выявлены не были. Один пациент из обследованной группы был с доброкачественной патологией (№ 4149). Отсутствие мутации в ДНК плазмы крови в данном случае вполне объяснимо и не противоречит литературным данным [3]. Три случая (№№ 4328, 4354, 4701) — это пациенты с ранее удаленной первичной опухолью, кровь взята перед операцией по поводу удаления метастаза. Три пациента (№№ 3344, 4606, 4546) — с разной глубиной инвазии опухоли, но без регионарных и отдаленных метастазов. В качестве объяснения полученных данных можно преположить следующее. Одной из причин может быть гетерогенность опухоли — чем меньший процент опухолевой ДНК содержит мутацию, тем сложнее ее обнаружить в свободно-циркулирующей ДНК. Решить эту проблему можно двумя путями. Первый подход — увеличить выход свободно-циркулирующей ДНК в процессе выделения, что предполагает модификацию процесса получения и подготовки образцов плазмы и усовершенствование методов выделения ДНК. В настоящее время не существует единого стандарта для проведения таких исследований. Второй путь — внести изменения в процесс подготовки библиотек и процесс секвенирования для проведения более углубленного анализа, позволяющего выявлять изменения при минимальном количестве опухолевой ДНК в кровотоке.
Для детектирования мутированной опухолевой ДНК среди большого количества ненарушенных молекул требуются высокочувствительные методы, и это является одной из причин, почему в различных исследованиях получаются весьма разнообразные и зачастую противоречивые результаты [1].
На наш взгляд, одним из критических моментов является корректная подготовка плазмы крови для
дальнейшего выделения свободно-циркулирующей ДНК, которая должна обязательно проводиться с учетом времени и условий забора крови. Планируемые дальнейшие исследования с включением в обследование новых пациентов с применением унифицированных методов подготовки биологического материала (и ткани, и крови) и методов выделения ДНК позволят пролить свет на многие неясные вопросы.
Таким образом, дальнейшие исследования должны быть направлены на валидацию и верификацию лабораторных методов и протоколов для молеку-лярно-генетических тестов при работе со свободно-циркулирующими НК плазмы крови перед их внедрением в клиническую практику. Должна быть оценена возможность применения анализа циркулирующей опухолевой ДНК в различных клинических ситуациях, чтобы лучше понять ограничения и преимущества этого нового метода [2].
Выводы
На сегодняшний день показано, что многие генетические и эпигенетические изменения, которые присутствуют в опухолевых тканях, могут быть обнаружены в плазме онкологических больных. Однако проведенные нами исследования на ДНК, выделенной из опухолевой ткани и плазмы крови, позволяют сделать вывод, что применение неинвазивных методов для диагностики и мониторинга онкологических заболеваний требует строгой стандартизация как самого используемого биологического материала, так и протокола его подготовки для дальнейшего анализа.
Работа выполнена при участии ООО «Евроген»
Литература
1. Gonzalez-Masia Jose A. Circulating nucleic acids in plasma and serum (CNAPS): applications in oncology / Jose A. Gonzalez-Masia, Damian Garcia-Olmo, Dolores C. Garcia-Olmo // OncoTargets and Therapy. — 2013. — № 6. — С. 819—820.
2. Diaz Luis A. Jr Liquid Biopsies: Genotyping Circulating Tumor DNA / Luis A. Diaz Jr, Alberto Bardelli // Journal of Clinical Oncology. — 2014. — № 6. — C. 581.
3. Murtaza M. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma
DNA / Muhammed Murtaza, Sarah-Jane Dawson, Dana W.Y. Tsui et al. // Nature. — 2013. — № 497. — С. 108.
4. Тамкович С.Н. Циркулирующие ДНК крови и их использование в медицинской диагностике / С.Н. Тамкович, В.В. Власов, П.П. Лактионов // Молекулярная биология. — 2008. — № 1. — С. 18—19.
5. Chan K.C.A. and Lo Y.M.D. Circulating nucleic acids as a tumor marker // Histology and Histipatology. — 2002. — Vol. 17. — С. 938.
