CC BY
114
Шжолопмя КОЛОПРОКТОЛОГИЯ 3' 2016 _i том 6 / vol. 6
Colorectal ONCOLOGY
Роль циркулирующей в крови опухолевой ДНК при раке толстой кишки
М.Ю. Федянин, Е.М. Полянская, С. А. Тюляндин
ФГБУ«РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 23 Контакты: Михаил Юрьевич Федянин [email protected]
Под термином «жидкостная биопсия» ("liquid biopsy") понимают изучение различных дериватов опухоли (циркулирующая опухолевая ДНК, циркулирующие опухолевые клетки, опухолевая РНК, белки опухоли) в плазме крови. Данные жидкостной биопсии дают информацию о молекулярных нарушениях и морфологии в реальном времени по всей опухолевой массе и позволяют оценить в динамике эволюционные изменения образования, гетерогенность заболевания и эффективность терапии. Несмотря на впечатляющую перспективу применения данного метода в диагностике и мониторинге заболевания, тем не менее существует ряд проблем по внедрению жидкостной биопсии при различных онкопатологиях. В данном обзоре литературы мы сконцентрируемся на роли циркулирующей ДНК как источнике информации об опухоли у больных раком толстой кишки.
Ключевые слова: циркулирующая опухолевая ДНК, рак толстой кишки, биомаркеры
DOI: 10.17650/2220-3478-2016-6-3-43-52
Е га
09
Е
The role of circulating tumor DNA in patients with colon cancer M. Yu. Fedyanin, E.M. Polyanskaya, S.A. Tjulyandin
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center of the Ministry of Health of Russia; 23 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia
The term "liquid biopsy" describes the study of various tumor derivatives (circulating tumor DNA, circulating tumor cells, tumor RNA, tumor proteins) in the blood plasma. Results of liquid biopsy provide real-time information on the molecular pathologies and morphological features throughout the whole tumor mass and allow to estimate evolutionary changes of tumor mass in the dynamics, heterogeneity of mass formation and effectiveness of the therapy. Despite the impressive perspective of this method in the diagnosis, monitoring of disease, there is a number of problems for the implementation of liquid biopsy for various cancer pathologies. In this literature review, we focus on the role of circulating DNA as a source of information about the tumor in patients with colon cancer.
Key words: circulating tumor DNA, colon cancer, biomarkers
Введение
В последние 5 лет термин «жидкостная биопсия» ("liquid biopsy") стал очень популярен в онкологии. Под ним понимают изучение различных дериватов опухоли в плазме крови. Объяснением этому служит все большая персонификация лечения онкологических пациентов, основанная на молекулярных изменениях в опухоли конкретного больного. В процессе лечения возникают новые генетические изменения в образовании, определяющие его резистентность к проводимому лечению. Традиционная тканевая биопсия представляет данные лишь по одному небольшому участку первичной опухоли или метастаза, зачастую взятому еще до начала лечения. От выполнения повторных биопсий, как правило, пациенты отказываются. В клинике бывают случаи, когда блоки первичной опухоли утеряны, качество морфологического материала или его неправильное хранение не позволяет выполнить генетическое исследование, локализация метастазов препятствует выполнению биопсии. Все это определило
развитие альтернативных путей изучения опухолевого материала у онкологических больных. В качестве источника информации об образовании применяют его различные дериваты (циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК), опухолевая циркулирующая ДНК (цДНК), опухолевая РНК, белки опухоли). Данные жидкостной биопсии дают информацию о молекулярных нарушениях и морфологии в реальном времени по всей опухолевой массе и позволяют оценить в динамике эволюционные изменения образования, гетерогенность заболевания и эффективность терапии. Это определяется возможностью многократного взятия образцов крови пациента для анализа в процессе терапии, в отличие от традиционной тканевой биопсии, что помогает оценить механизмы резистентности к лечению и, возможно, уже в скором будущем модифицировать терапевтическую схему в соответствии с выявляемыми молекулярными нарушениями в опухоли. В данном обзоре литературы мы сконцентрируемся на роли цДНК как источника информации об опухоли у больных раком толстой кишки.
2 Методы выделения и изучения циркулирующей ДНК
^ Использование опухолевой цДНК в качестве сур-
£ рогата опухолевого генома было предложено еще е. в 70-е годы прошлого века [1]. Саму внеклеточную j= циркулирующую в крови ДНК (нуклеиновые кислоты) = у здоровых людей удалось выделить еще в 1940-е годы * P.M. Mandel и P. Métais [2].
= Источником опухолевой цДНК являются погибшие
в вследствие некроза, фагоцитоза или апоптоза клетки опухоли [3]. Процентное содержание опухолевой цДНК от общей цДНК в плазме крови, по данным K. Hibi и соавт., составляет от 0,2 до 10,0 % [4]. При этом оборот опухолевой цДНК довольной высокий за счет того, что период полураспада цДНК колеблется от нескольких минут до нескольких часов [5]. Следует отметить, что нормальных значений цДНК не определено, так как они значимо варьируют в зависимости от различных физиологических условий [6]. В свою очередь, гетерогенность и клональная эволюция опухоли в процессе лечения могут приводить к различиям между мутационным статусом первичной опухоли и цДНК, особенно при метастатическом поражении [7, 8].
В обзоре литературы, выполненном Т. Lecomte и соавт., уровень выявления мутаций в цДНК при раке толстой кишки варьировал от 9 до 100 %. Однако большинство исследований, вошедших в анализ, включали небольшое число пациентов [9]. Таким образом, сравнивать ранние работы, посвященные цДНК, довольно трудно. Тем не менее изучение опухолевой цДНК имеет значительные перспективы от скрининга и диагностики до мониторинга терапии онкологических заболеваний. При этом можно не только оценивать концентрацию опухолевой цДНК в крови, но и определять мутации в цДНК, как и отношение мутантных цДНК к их общему количеству.
За последние 5 лет различные независимые исследовательские группы показали возможность выделения опухолевой цДНК в крови у больных раком толстой кишки [10]. Такая возможность определяется чувствительностью методов изучения мутировавших последовательностей ДНК, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Основной проблемой применения в данных целях классической ПЦР является ее низкая чувствительность в выделении небольшого количества мутантных аллелей в большом количестве неизмененной ДНК. В связи с этим стали разрабатываться новые технологии для решения данной проблемы.
Следует отметить, что внеклеточная ДНК с длиной в среднем около 180 пар оснований высоко фрагмен-тирована в плазме крови [11]. У онкологических больных большая часть данных фрагментов короче 100 пар оснований [12]. Это позволяет повысить чувствительность метода ПЦР за счет укорочения ампликонов [13, 14]. В исследовании R.F. Andersen и соавт. провели анализ цДНК у 46 больных раком толстой кишки с мутацией в гене KRAS в первичной опухоли. С помощью
длинных ампликонов мутации в цДНК удалось выявить только в 61 % случаев, тогда как при применении метода коротких ампликонов стало возможным повысить конкордантность по мутационному статусу до 74 % [15]. Кроме этого, наряду с методикой изучения коротких ампликонов [15, 16] был предложен и ряд других разработок для повышения чувствительности метода выделения и анализа опухолевой цДНК. Так, рекомендуется использовать для анализа плазму, а не сыворотку крови пациента [7, 17], сочетать несколько методов анализа ДНК (мутационного анализа и метилирования ДНК) [18]. К примеру, в исследовании Е. Danese и соавт. изучили конкордантность мутационного статуса гена KRAS и метилирования гена SEPT9 между первичной опухолью и цДНК у 85 больных раком толстой кишки во время операции с помощью методов ARMS-qPCR и methylation specific qPCR. Общая конкордантность между мутационным статусом первичной опухоли и цДНК по мутационному статусу гена KRAS составила 89,4 %. Однако среди 29 больных с мутацией в гене KRAS аналогичная мутация в цДНК была обнаружена лишь у 22 (75,8 %). Это определило чувствительность теста в 85 %, а специфичность — в 93 %. По метилированию промотора гена SEPT9 конкордантность составила 86 %, чувствительность — 83 %, специфичность — 100 % [19]. К такому же выводу — о необходимости комбинации как минимум 2 маркеров в целях повышения чувствительности метода детекции опухолевой цДНК — пришли и F. Di Fiore и соавт., предложившие определять не только мутацию в гене KRAS, но и метилирование промотора гена RASSF2A цДНК [20].
Еще одним способом повышения чувствительно -сти метода выделения и анализа опухолевой цДНК является nucleic acid (PNA) — based PCR. Данная техника, по убеждению авторов, решает проблему небольшого числа мутантных аллелей в плазме крови, позволяя выявить 1 мутантный аллель на 10 тыс. Так, в 2014 г. группа исследователей из Тайваня представила анализ сравнения мутационного статуса гена KRAS в первичной опухоли и в цДНК в плазме крови 52 больных раком толстой кишки III—IV стадий с помощью данного варианта ПЦР. Только у 28,8 % больных была выявлена мутация гена KRAS в первичной опухоли, тогда как в 50 % случаев мутация гена KRAS была обнаружена в цДНК. То есть у 21,1 % больных с «диким» типом гена KRAS в опухоли обнаруживалась мутация в цДНК. Общая конкордантность по мутационному статусу гена составила 78,8 %. Авторы объяснили данное явление гетерогенностью заболевания [21].
Можно сделать вывод, что в основе повышения чувствительности большинства методов лежит насыщение изучаемого образца мутантными аллелями в процессе процедур амплификации с последующим применением чувствительных техник по детекции данного измененного гена. Однако эти процедуры весьма тру-
доемки и требуют многократного выполнения тестов, что осложняет их внедрение в рутинную клинико-ла-бораторную практику.
Сравнивая частоту выявления ЦОК и опухолевой цДНК, отметим, что во всех случаях выявления ЦОК в крови пациента всегда обнаруживается и опухолевая цДНК. Однако зачастую при отсутствии ЦОК в крови выявляется опухолевая цДНК [22]. Некоторые исследовательские группы выявили значимую корреляцию между выявлением ЦОК и мутацией в гене KRAS цДНК у больных метастатическим раком толстой кишки [23].
Стоит отметить, что любые манипуляции с опухолью приводят к увеличению уровня цДНК в крови пациента. Так, установка стентов в просвет толстой кишки в целях профилактики кишечной непроходимости приводила к увеличению уровня цДНК в крови в несколько раз с последующим снижением до первоначального уровня через 4 дня [24]. После метастаз-эктомий у всех (n = 10) больных с метастазами рака толстой кишки в печень отмечено повышение уровня цДНК в крови к 7-му дню после оперативного вмешательства. У 3 пациентов с прогрессированием заболевания в течение 6 мес после выполнения радикальной операции уровень цДНК увеличивался или оставался повышенным после хирургического лечения. Авторы исследования отметили, что развитие послеоперационных осложнений может уменьшать скорость снижения уровня цДНК [25]. В исследовании Т. Reinert и соавт., изучив концентрацию цДНК после хирургического вмешательства у 11 больных раком толстой кишки, выявили, что динамика уровня цДНК определяется следующими факторами: гибель нормальных клеток в результате хирургической травмы (определяя пик цДНК к 8-му дню после операции), гибель клеток вследствие послеоперационных осложнений, гибель клеток вследствие сопутствующей патологии, адъю-вантной химиотерапии и разрушение лейкоцитов в результате приготовления образцов крови для анализа. Также отмечено, что рост уровня опухолевой цДНК при прогрессировании заболевания наступает раньше получения объективных данных о прогрессировании [26]. Интересно, что применение техники No-touch isolation при удалении первичной опухоли снижает частоту выявления опухолевой цДНК до 14 % с 73 % при классической методике оперативного вмешательства [27].
Диагностическая польза и прогностическое значение циркулирующей ДНК при ранних стадиях рака толстой кишки
По сравнению со здоровыми добровольцами (n = 100) и пациентами с аденомой толстой кишки (n = 70) у больных с метастатическим раком толстой кишки (n = 100), получавших 2-ю линию химиотерапии, уровень цДНК в плазме крови был значимо выше. Этот уровень влиял на медиану времени до прогрессирова-ния и продолжительность жизни: 2,1 мес (95 % дове-
рительный интервал (ДИ) 2,0—3,4), 6,5 мес (95 % ДИ з 4,2-7,2; отношение рисков (ОР) 2,53 (95 % ДИ 1,57- ~ 4,06); p < 0,0001), 7,4 мес (95 % ДИ 4,3-8,7) и 13,8 мес (95 % ДИ 11,9-18,9; ОР 2,52 (95 % ДИ 1,54-4,13); p < 0,0001) соответственно [28]. Такие же обнадежива- j= ющие данные по возможности использования опухо- = левой цДНК в качестве биомаркера выявления рака а толстой кишки и его прогрессирования получили = S. Pucciarelli и соавт., изучившие различия в концент- œ рации опухолевой цДНК у здоровых добровольцев (n = 55), пациентов с аденомами толстой кишки (n = 24) и больных с различными стадиями рака толстой кишки (n = 136). При пороговом значении уровня опухолевой цДНК в 4,86 нг/мл чувствительность и специфичность метода составили 78,52 и 86,08 % соответственно [29]. Аналогичные результаты получены и другими исследовательскими группами [14, 30-32].
При анализе мутационного статуса генов TP53, APC, KRAS, BRAF, PIK3CA, FBXW7 и SMAD4 в цДНК и в опухолевом материале 19 пациентов с метастатическим раком толстой кишки применялась технологическая платформа MPS (Safe-SeqS). У 84,2 % больных в опухоли обнаружилась хотя бы 1 мутация в 1 из перечисленных генов, во всех случаях подтвержденная и цДНК (7 - KRAS, 3 - TP53, 3 - BRAF, 2 - APC и 1 -PIK3CA). Как и в других исследованиях, более высокая концентрация цДНК была ассоциирована с низкими показателями общей выживаемости (при пороговом значении 2,5 нг/мл): 6,9 мес против 12,2 мес; p = 0,0086 [33]. Эти же авторы с данной технологической платформой MPS (Safe-SeqS) в дальнейшем решили проспективно оценить прогностическое значение мутационных изменений опухолевой цДНК, взятой через 4-10 нед после операции, у 250 больных раком толстой кишки II стадии. При этом у 175 пациентов удалось взять образцы цДНК и через 3 мес после хирургического лечения. Предварительные данные о результатах лечения 112 пациентов были доложены в 2014 и 2015 гг. Хотя бы 1 мутация в перечисленных генах была обнаружена у всех больных. Прогрессирование заболевания развилось у 7 (77,8 %) из 9 больных с позитивной цДНК после оперативного лечения, тогда как в случае отсутствия цДНК в плазме крови после хирургического вмешательства прогрессирование наступило лишь у 7 (6,8 %) из 103. Данная закономерность выявлялась независимо от стадии T. При этом у половины пациентов с прогрес-сированием опухолевая цДНК выявлялась в процессе наблюдения после операции. Также наличие опухолевой цДНК значимо было ассоциировано с короткой безрецидивной выживаемостью (ОР 25,7; p < 0,001). Авторы работы сделали вывод о возможности оценки уровня опухолевой цДНК в крови пациента в процессе наблюдения за развитием рецидива болезни [33, 34].
Исследователи из Франции с помощью технологии Inplex оценили прогностическое значение таких параметров, как общая концентрация цДНК в плазме,
3 уровень фрагментации цДНК, мутационный статус
^ генов КВАБ и БВА1< в цДНК и процент мутантной
Е цДНК, у 98 больных метастатическим раком толстой кишки. Так, наличие мутации в гене БВА1' цДНК, вы-
2 сокий уровень цДНК в плазме крови, высокий процент
= мутантной цДНК (медиана 10,3 %) обладали значимым
а негативным влиянием на общую выживаемость [35].
е
п
° Конкордантность между мутационным статусом опухоли и циркулирующей ДНК
Одно из ключевых исследований, посвященных изучению конкордантности мутационных изменений цДНК и опухолевого материала, было проведено С. БеМ^ошёа и соавт. Конкордантность мутационного статуса гена КВАБ в первичной опухоли и в цДНК была оценена у 206 больных раком толстой кишки. Чувствительность метода оценки цДНК составила 87,2 %. У 26 пациентов при наличии мутации в первичной опухоли она не выявлялась в цДНК. При детальном анализе данной подгруппы пациентов отмечено, что такая ситуация была характерна в подгруппе с низким уровнем раково-эмбрионального антигена, муцинозным гистотипом опухоли, низким уровнем ала-нинаминотрансферазы и лейкоцитов, молодым возрастом больного. Авторы сделали вывод, что при небольшой распространенности заболевания чувствительность метода выявления мутаций в цДНК значимо снижается. Также в данной работе было доказано и негативное прогностическое значение концентрации цДНК у больных раком толстой кишки. Исследователи выявили мутацию в гене КВАБ цДНК у 38 % пациентов с про-грессированием заболевания на фоне анти-БОРЯ-терапии и с «диким» типом гена КВАБ в первичной опухоли, при этом у 62,5 % пациентов мутация в гене КВАБ цДНК локализовалась в 61-м кодоне 2-го экзона. Суммарно у 96 % больных были выявлены изменения цДНК, касающиеся генов МАРК-сигнального пути при прогрессировании на фоне терапии анти-БОРЯ-моноклональными антителами [22].
Исследователи из Китая в целях изучения конкор-дантности между опухолью и цДНК выбрали методы ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру и КОБ-технологией. При этом пороговое значение мутации в гене КВАБ было принято > 0,5 %. Всего в исследование были включены 27 пациентов, которым выполняли операцию по удалению первичной опухоли. Чувствительность и специфичность определения мутационного статуса гена КВАБ в цДНК составили 76,9 и 78,6 % соответственно. При этом в отношении мутаций в цДНК, но не в опухолевом материале чувствительность технологии N08 превосходила секвени-рование по Сэнгеру [36].
Аналогичные относительно неудовлетворительные данные по чувствительности мутационного анализа цДНК в отношении гена КВАБ были получены и Б. Бейлош и соавт. Метод, который применяли исследователи
у 35 больных метастатическим раком толстой кишки, получавших химиотерапию, в целях изучения статуса гена KRAS в цДНК, — TaqMan Mutation Detection Assay (TMDA). При сравнении мутационного статуса гена KRAS в опухоли и в цДНК чувствительность и специфичность метода составили 62 и 100 % соответственно. Авторы работы также отметили корреляцию между концентрацией цДНК и 3-месячными показателями выживаемости без прогрессирования [37]. Применение же цифровой ПЦР (Digital 3D™ QuantStudio) в качестве метода детекции мутации в гене KRAS цДНК у 34 пациентов с метастатическим раком толстой кишки характеризовалось аналогичными показателями чувствительности (63 %) и специфичности (100 %) [38].
А. Marziali и соавт. в целях снижения частоты ошибок секвенирования разработали собственный процесс отбора таргетной ДНК «дикого» типа, назвав данную технологию OnTarget. Применение такого подхода позволило добиться высоких показателей чувствительности (92 %) и специфичности (100 %) по определению мутационных изменений в генах цДНК у 17 больных раком толстой кишки [39].
R. Scott и соавт. представили результаты изучения соответствия мутационного анализа опухолевого материала и цДНК у 31 больного раком толстой кишки III и IV стадий с помощью теста OncoBEAM. Данный тест включал панель из 33 мутаций генов RAS. Отмечена высокая частота соответствия мутационного статуса гена KRAS между цДНК и опухолью — 93,5 % [40]. В 2015 г. были представлены результаты метаанализа 2 исследований по соответствию мутационного статуса генов RAS в опухоли и цДНК у больных метастатическим раком толстой кишки с помощью тест-системы OncoBEAM. Всего был изучен материал от 68 пациентов из Европы и Австралии, из которых 46 были с впервые выявленным заболеванием. Данная тест-система показала высокую частоту соответствия мутационного статуса между цДНК и опухолевым материалом — 96 %; в 100 % случаев подтверждался «дикий» тип генов, в 92 % — наличие мутации. Частота выявления мутации в опухоли и цДНК составила 55 и 57 % соответственно. В этих 3 случаях расхождения данных в цДНК был выявлен низкий процент мутаций в генах RAS от всей цДНК [41]. В настоящий момент продолжается исследование по валидации данной тест-системы на большем числе пациентов.
Исследователи из Японии изучили цДНК 29 больных метастатическим раком толстой кишки. Мутации в гене KRAS цДНК были обнаружены у 86 % пациентов с мутацией данного гена в первичной опухоли и у 14 % без таковой. Из 12 больных, которым были назначены анти-EGFR-моноклональные антитела с «диким» типом генов KRAS и BRAF в первичной опухоли, у 9 с отсутствием мутации и в цДНК наблюдали выраженный клинический ответ. Только у 1 из 3 пациентов
с мутацией в гене KRAS цДНК также был достигнут объективный ответ. Через 12 мес у 1 пациента отмечено появление мутации в гене KRAS цДНК на фоне анти-EGFR-терапии [42].
В другом исследовании при метастатическом раке толстой кишки с мутацией в гене KRAS отмечено высокое совпадение по мутационному статусу гена KRAS между опухолевым материалом и цДНК в плазме крови (n = 20) и моче (n = 16) — в 95 и 94 % соответственно. При этом исследователи изучали ультракороткие ампликоны (до 31 вр) для выявления мутации в гене KRAS в цДНК [43]. Такие же высокие результаты соответствия мутационного статуса первичной опухоли и цДНК в моче были получены и для гена BRAF — 94 %. Анализ был проведен среди 34 пациентов с метастатическими злокачественными опухолями различной локализации с мутацией в гене BRAF, включая 8 больных раком толстой кишки (см. таблицу) [44].
C. Trevisiol и соавт. с помощью метода RFLP-ПЦР выявили мутации во 2-м экзоне гена KRAS в опухолях 28 (33 %) пациентов с раком толстой кишки. Из них только у 36 % данные изменения регистрировались в цДНК. Исследователи подтвердили негативное прогностическое значение наличия мутации в гене KRAS цДНК у больных с метастатическим заболеванием [49]. Негативное прогностическое значение выявления мутации в гене KRAS цДНК при метастатическом и операбельном раке толстой кишки было показано и другими исследовательскими группами [50, 51].
В работах M. S. Kopreski и соавт. и J. Mora и соавт. мутации в гене KRAS цДНК были выявлены у 28 и 8,5 % пациентов соответственно. При этом в 1-м исследовании совпадение по мутационному статусу гена и первичной опухоли отмечено в 83 %, «дикий» же тип гена в первичной опухоли в 93 % случаев сопровождался и отсутствием мутации в цДНК. Во 2-м исследовании чувствительность метода оказалась низкой: если в цДНК мутация в гене KRAS была выявлена у 8,5 % больных, то в первичной опухоли она выявлялась уже у 41,0 % [32, 52]. В других исследованиях, проведенных в конце 90-х годов прошлого века, частота соответствия мутационного статуса гена KRAS в цДНК и опухолевом материале варьирует от 19 до 86 % [4, 53, 54].
Что касается совпадения по другим молекулярным изменениям в опухоли и в цДНК, то в этой связи интересны результаты следующих двух исследований. У 148 пациентов с аденомой или злокачественной опухолью толстой кишки проспективно был взят опухолевый материал и образцы крови для анализа на наличие фенотипа хромосомной нестабильности (CIN), метилирования ДНК (CIMP) и микросателлитной нестабильности (MSI). В аденомах MSI-, CIN- и CIMP-фенотипы были выявлены в 4, 32 и 7 % случаев соответственно. При этом изменений в цДНК плазмы крови от этих пациентов выявлено не было. Среди больных раком толстой кишки MSI-, CIN- и CIMP-
Конкордантность мутационного статуса опухолевого материала и циркулирующей ДНК
Автор Метод детекции Число пациен- Ген Конкордант-
тов, n ность, %
R.F. Andersen h соавт., 2015 [15] PCR-based 46 KRAS 71,0
E. Danese h co-aBT., 2015 [19] PCR-based 85 KRAS and metilation of SEPT9 89,4
Y.B. Kuo h co-aBT., 2014 [21] PNA-based PCR 52 KRAS 78,8
C. Bettegowda h coaBT., 2014 [22] PCR-based 206 KRAS 88,2
M.S. Kopreski h coaBT., 2000 [32] PCR-based 34 KRAS 83,0
F. Liu h coaBT., 2015 [36] NGS 27 KRAS 76,9
A. Marziali h coaBT., 2014 [39] OnTarget 17 KRAS 92,0
D. Sefrioui h coaBT., 2014 [40] TaqMan Assay 35 KRAS 62,0
F. Jones h coaBT., 2015 [41] OncoBEAM 68 RAS 92,0
T. Yamada h coaBT., 2014 [42] PCR-based 29 KRAS 86,0
J.C. Poole h coaBT., 2015 [43] PCR-based 20 KRAS 95,0
M.P. Morelli h coaBT., 2014 [45] GUARDANT sequencing technology 49 KRAS 70,0
J. Tabernero h coaBT., 2015 [46] BEAMing 503 KRAS NRAS BRAF 76,0 88,0 97,0
A.L.A. Wong h coaBT., 2015 [47] BEAMing 35 KRAS 77,0
M. Teufel h coaBT., 2015 [48] BEAMing 143 KRAS 65,0
фенотипы были выявлены в 10, 36 и 32 % случаев соответственно. Конкордантность с изменениями в цДНК отмечена у 25 % пациентов с MSI, у 23 % с CIN и у 60 % с CIMP-фенотипом. Минимальной для проведения полноценного анализа считали концентрацию цДНК 0,2 нг/мл [55].
Панель из 54 генов для анализа их мутационных изменений по технологии Guardant360 в цДНК была применена у 120 больных метастатическим раком толстой кишки, в среднем получивших 3 линии химиотерапии. Анализ мутации 50 генов в опухолевом материале был проведен с помощью технологии секвенирования (Ion Torrent). У 83 % пациентов в цДНК были выявлены изменения хотя бы в 1 из 54 генов исследуемой
Е га
09
Е
Онколотчеш^ ^OnPOH^O^R 3' 2Ü16
Colorectal QNCQLQGY
3 панели (в среднем 4,2 мутации на 1 больного), включая ^ амплификацию генов EGFR, MET или ERBB2 у 26 %. £ В опухолевом материале генетические аберрации выявлены у 88 % пациентов, при этом значимо менее j= часто — в среднем 2,9 мутации на 1 больного [56]. = Таким образом, метод детекции мутаций в интере-
а сующих генах в цДНК является краеугольным камнем в в достижении высоких показателей соответствия мутационному статусу опухолевого материала.
Клональная эволюция рака толстой кишки
В 1976 г. P. Nowell предположил, что прогресси-рование опухоли определяется селекцией наиболее агрессивных субклонов опухолевых клеток вследствие приобретаемых генетических различий между клетками. То есть происходит эволюционный отбор клеток опухоли, способных к выживанию, инвазии и метастазированию [57]. Внедрение методов изучения генома NGS (next generation sequencing) подтвердило генетическую гетерогенность опухолевых клеток в одной опухоли, в том числе и при раке толстой кишки [58, 59].
Драйверные мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF зачастую совпадают между клетками первичной опухоли и метастазов, что подтверждает их раннее возникновение в процессе туморогенеза [60]. При сравнении 15 пар синхронных метастазов и первичных опухолей было подтверждено соответствие по мутационному статусу генов PIK3CA и TP53 [61]. В других исследованиях также не выявлено значимых мутационных различий в генах семейства RAS между первичной опухолью в кишке и метастазах в печень [62, 63]. Однако в работе Т. Xie и соавт. описано появление новых мутаций в генах FBXW7, DCLK1, FAT2 в метастазах рака толстой кишки по сравнению с первичной опухолью [62]. Генетический профайлинг отдельных клеток 15 образцов рака толстой кишки также подтвердил, что мутации в генах APC, KRAS, PIK3CA и TP53 являются ранними событиями канцерогенеза [64].
В случае «диких» типов генов RAS у пациентов с метастатическим раком толстой кишки отмечена эффективность терапии анти-EGFR-моноклональными антителами. Однако в дальнейшем у них развивается вторичная резистентность к данному типу таргетного воздействия, а у части больных имеется и первичная резистентность к анти-EGFR-терапии. Интересное наблюдение было описано L.A. Diaz и соавт., которые выявили у 40 % больных метастатическим раком толстой кишки при прогрессировании заболевания на фоне терапии панитумумабом (анти-EGFR-монокло-нальное антитело) мутации в гене KRAS в цДНК. При этом у 3 пациентов были выявлены множественные аберрации в гене KRAS. Путем математического моделирования авторы статьи пришли к выводу, что данные изменения в гене KRAS существовали в отдельных клонах еще до лечения панитумумабом. Однако дан-
ная гипотеза не была подтверждена секвенированием опухолевого материала до терапии панитумумабом. Соответственно, появление мутаций в гене KRAS может быть и поздним событием, возникающим при терапии анти-БОРЯ-моноклональными антителами [65].
Аналогичное по дизайну исследование было проведено С. Bettegowda и соавт., которые изучили спектр мутаций в цДНК у пациентов с «диким» типом гена KRAS в первичной опухоли толстой кишки при прогресси-ровании на фоне терапии цетуксимабом. Были выявлены 66 различных генетических изменений в цДНК, которые не присутствовали в первичной опухоли. Половина этих изменений локализовалась во 2-м экзоне гена KRAS, а у 2 пациентов была найдена мутация в гене BRAF, отсутствовавшая ранее, также у 2 пациентов выявлены мутации в киназном домене гена EGFR [22].
S. Mohan и соавт. выполнили секвенирование генов (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, EGFR) цДНК у 10 пациентов с метастатическим раком толстой кишки и «диким» типом гена KRAS в первичной опухоли при прог-рессировании на фоне терапии анти-БОРЯ-моно-клональными антителами. У 40 % больных исследователи выявили увеличение количества копий гена KRAS. При этом, как и в других исследованиях, данное событие было взаимоисключающим с мутацией в том же гене и было ассоциировано с резистентностью к анти-БОРЯ-терапии [66—68].
В более расширенной публикации данного исследования среди 14 больных с метастатическим раком толстой кишки и «диким» типом гена KRAS в первичной опухоли при прогрессировании на фоне химиотерапии без анти-БОРЯ-моноклональных антител только у 1 пациента была обнаружена мутация в гене KRAS цДНК (в низкой концентрации 0,01 %). Тогда как среди 10 пациентов с прогрессированием болезни на фоне цетуксимаба у 7 (70 %) больных была обнаружена мутация в гене KRAS и еще у 1 (10 %) — амплификация гена KRAS. При этом мутация в 71 % случаев локализовалась в 13-м кодоне. У пациентов без мутации в гене KRAS цДНК после терапии цетуксимабом была выявлена амплификация гена MET цДНК, что расценено авторами как причина резистентности к анти-БОРЯ-воздействию [66, 69].
Исследователи из клиники MD Anderson с помощью технологии секвенирования ОЦАЯСАКТ изучили расхождение по мутационному статусу и числу копий 54 генов между опухолевым материалом и цДНК пациентов с метастатическим раком толстой кишки, рефрактерным к фторурацилу. При этом мутантными генотипами считали случаи с частотой мутантного аллеля более 0,1 %. Из 49 пациентов, которые ранее получали анти-БОРЯ-моноклональные антитела и имели «дикий» тип гена KRAS в опухоли, в 30 % случаев выявляли мутации в гене KRAS цДНК, а амплификацию гена KRAS отмечали у 12 %. У 14 % пациентов из описанных 49 выявляли мутацию в гене EGFR.
Однако если пациенты с «диким» типом гена KRAS не получали моноклональные антитела, мутация в цДНК встречалась только у 5 % больных. Амплификацию генов EGFR, BRAF, MYC и SMO у пациентов в цДНК выявляли в 23, 11, 11 и 4 % соответственно, что превышало аналогичные показатели по первичной опухоли [45].
Данные наблюдения об отсутствии изменений в гене KRAS в цДНК при прогрессировании на фоне только химиотерапии (без анти-EGFR-моноклональ-ных антител) не нашли подтверждения в других работах. Так, S. Kopetz и соавт. провели анализ конкордант-ности мутационного статуса генов, в том числе и KRAS, между первичной опухолью и метастазами. Было выявлено, что в случае, если пациент получил химиотерапию до биопсии метастатического очага, частота расхождения по мутационному статусу генов увеличивалась в 3,5 раза по сравнению с больными, не получавшими химиотерапию [70]. Аналогичные результаты были представлены и в исследовании D.M. Graham и соавт. [71].
В своей работе A.L.A. Wong и соавт. изучили динамику опухолевой цДНК у 35 больных, получавших терапию регорафенибом (мультитирозинкиназный ингибитор) по поводу химиорефрактерного метастатического рака толстой кишки. У 40 % выявлена мутация KRAS цДНК, у 11 % - PIK3CA, у 9 % - BRAF. У 13 % пациентов, ранее получавших анти-EGFR-моноклональные антитела, выявлена мутация KRAS в цДНК. Суммарно расхождение по мутационному статусу генов KRAS, BRAF, PIK3CA между первичной опухолью и цДНК выявлено у 23 % пациентов. При этом в случае выявления мутантного варианта KRAS в цДНК доля мутированных форм от общего количества цДНК колебалась в пределах от 0,03 до 54,0 %, что совпадает с данными других работ [47, 72-77]. Такая широкая вариабельность процента му-тантной формы цДНК подтверждает гетерогенность заболевания и ставит вопрос о пороговом значении мутированной цДНК, при котором необходимо считать, что опухоль имеет большую часть клеточных клонов с «диким» типом гена KRAS и пациенту целесообразно назначить анти-EGFR-препараты. Авторы статьи отметили, что у больных с длительным контролем болезни на фоне терапии регорафенибом общее количество цДНК было значимо ниже в процессе терапии по сравнению со случаями быстрого прогрессирова-ния. При выявлении мутантных форм цДНК прогноз течения болезни был хуже. Однако среди больных с мутированной формой цДНК доля мутантной опухолевой цДНК не коррелировала со временем до про-грессирования [47].
При анализе частоты встречаемости мутаций в цДНК у 143 химиорефрактерных больных азиатской расы, получавших регорафениб или плацебо в исследовании III фазы CONCUR, применяли технологию BEAM.
Мутация в гене KRAS выявлена у 54,5 %, NRAS — з у 7,0 %, BRAF - у 7,8 % и PIK3CA - у 16,1 % пациентов. При сравнении с архивными данными мутационного £ статуса гена KRAS первичной опухоли конкордантность в, с данными по цДНК составила всего 65 % [78]. j=
В исследовании регорафениба на европейской = популяции пациентов с химиорефрактерным метаста- а тическим раком толстой кишки (CORRECT) также был = проведен мутационный анализ цДНК. Применяемый в исследователями метод BEAMing (Beads, Emulsifica-tion, Amplification, and Magnetics) выявил мутацию в гене KRAS у 69 %, PIK3CA - у 17 % из 503 пациентов, включенных в анализ, и мутацию в гене BRAF — у 3 % из 502. В доступном архивном опухолевом материале тем же методом были выявлены мутации в генах KRAS, PIK3CA и BRAF в 59, 12 и 1 % случаев соответственно. При этом конкордантность по мутационному статусу причисленных генов между цДНК и опухолевым материалом составила 76, 88 и 97 % соответственно. Исследователей удивило такое несоответствие статуса по гену KRAS, что в основном было ограничено случаями наличия мутации в цДНК, но отсутствия ее в опухоли, и именно эти пациенты получали ранее анти-EGFR-терапию. Из 50 больных с несоответствием по мутационному статусу у 41 (82 %) отмечены мутации в цДНК, из них у 30 было подтверждено наличие «дикого» типа гена KRAS в опухолевом материале с помощью BEAMing. Также авторами показана обратная зависимость между концентрацией цДНК и выживаемостью [46].
Было проведено изучение соответствия первичной опухоли (n = 108) и динамики (n = 67) мутационного статуса генов KRAS и BRAF ц ДНК у пациентов с метастатическим раком толстой кишки в процессе терапии 3-й линии комбинацией цетуксимаба и иринотекана. У 78 % больных с мутацией гена KRAS в опухоли она была выявлена и в цДНК. Чувствительность метода оценки мутационного статуса гена KRAS в цДНК составила 78 %, а специфичность — 100 % [77]. Мутация в гене BRAF цДНК подтверждена у 2 из 3 больных. Контроль заболевания чаще достигался у пациентов с низким уровнем цДНК (< 25 %) — 77 % против 30 % у больных с высоким уровнем цДНК в плазме крови (> 75 %) (р = 0,009). Только у 4 и 1 пациента в процессе терапии стали выявляться мутации в генах KRAS и BRAF соответственно [79]. Также выживаемость без прогрессирования и продолжительность жизни были значимо выше при низких значениях опухолевой цДНК, постепенно снижаясь при увеличении числа аллелей цДНК [80].
В Германии с помощью технологии NGS (Ion Torrent PGM) оценили динамику опухолевой цДНК у 20 пациентов с мутацией в генах KRAS (n = 17) или NRAS (n = 3) с прогрессированием заболевания в процессе лечения. При радиографических признаках прогрес-сирования у 15 % пациентов не отмечено появления
Онкологическая ^OnPOK^O^ 3' 2Ü16
Colorectal QNCQLQGY
мутаций в генах RAS цДНК, у 55 % зарегистрировано повышение уровня мутантного аллеля в цДНК, у 30 % уровень мутантной формы гена не увеличивался по сравнению с уровнем на 60-й и 30-й дни до прогрес-сирования [81]. Интересное наблюдение было сделано исследователями из Японии, изучавшими динамику мутационных изменений в гене KRAS цДНК. Из 17 больных метастатическим раком толстой кишки с «диким» типом гена в цДНК до начала лечения у 3 в дальнейшем стала определяться мутация в гене KRAS цДНК. При этом только в 1 случае пациент получал анти-БОРЯ-моноклональные антитела [82].
В 2008 г. Р. Diehl и соавт. опубликовали работу по мутационному анализу генов APC, KRAS, PIK3CA цДНК 168 образцов крови от 18 больных раком толстой кишки. Во всех образцах опухолевая цДНК определялась до хирургического лечения. У пациентов с выявляемой опухолевой цДНК в процессе наблюдения после операции в дальнейшем отмечено прогрес-сирование заболевания [72]. В другом исследовании также оценили динамику мутации гена KRAS цДНК у 25 пациентов с различными стадиями рака толстой кишки после хирургического лечения. У 64 % больных мутация в гене KRAS выявлялась в первичной опухоли, из них только у 56 % она была также выявлена и в цДНК. У 8 из 9 пациентов с мутацией в цДНК последняя определялась и после операции. При этом у 62,3 % из них в дальнейшем развилось прогрессирование. В то же время исследователи не увидели значимой корреляции между показателями выживаемости и наличием мутации в гене KRAS цДНК [83].
G. Siravegna и соавт. также подтвердили появление мутаций в генах RAS в цДНК на фоне терапии анти-EGFR-моноклональными антителами. Однако после отмены данных препаратов отмечалось и снижение уровня мутированного аллеля KRAS в цДНК, и он не определялся на фоне последующих линий химиотерапии. Исследователи подчеркнули, что мутация в гене KRAS цДНК не появлялась в процессе монохимиотерапии с бевацизумабом или без. Таким образом, появляется возможность реиндукции анти-БОРЯ-мо-ноклональных антител при исчезновении клона опухолевых клеток с мутацией в гене KRAS. Особенно это
интересно в контексте того, что опухолевые клетки с «диким» типом генов выживают в присутствии анти-EGFR-моноклональных антител, если культивируются вместе с клетками с мутантным генотипом. Это происходит за счет протективного действия лигандов к EGFR (трансформирующий фактор роста а и амфи-регулин), секретирующихся клетками с мутацией в генах RAS [84]. В отношении 3 пациентов G. Siravegna и соавт. так и поступили — возобновили терапию анти-EGFR-моноклональными антителами при исчезновении мутации в гене KRAS цДНК и получили клинически значимый ответ опухоли. Однако в дальнейшем мутация в этом гене снова стала определяться. Авторы предполагают, что интермиттирующее назначение анти-EGFR-терапии позволит предотвратить динамику отдельных опухолевых клонов. В качестве методов оценки статуса генов применяли капельную цифровую ПЦР и метод BEAMing. Оба метода обладают высокой чувствительностью, позволяя детектировать 0,01—0,001 % мутаций в гене KRAS от всей цДНК [85]. В 97 % случаев (у 97 из 100 пациентов с метастатическим раком толстой кишки) авторы подтвердили соответствие мутационного статуса генов KRAS, NRAS и BRAF опухолевого материала и цДНК. У 8 больных выявлены изменения в цДНК, которые не обнаружились в опухолевом материале [86].
Заключение
В заключение следует отметить, что в настоящее время возрастает роль жидкостной биопсии в онкологии. На смену определению ЦОК приходят новые суррогаты материала для молекулярного анализа: цДНК, матричная РНК. И хотя все больше данных накапливается по прогностическому значению наличия ЦОК и цДНК у больных раком толстой кишки, все же в первую очередь данный вариант жидкостной биопсии войдет в клиническую практику как матери -ал для определения мутационного статуса генов RAS и BRAF. В дальнейшем мы увидим большое количество исследований по оценке динамики мутационных изменений в цДНК в процессе терапии анти-EGFR-препаратами и, возможно, это изменит режим назначения данных моноклональных антител.
ЛИТЕР
1. Leon S.A., Shapiro B., Sklaroff D.M., Yaros M.J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977;37(3):646-50.
2. Mandel P.M., Métais P. Les acides nucleiques du plasma sanguine chez l'homme. CR Acad Sci Paris 1948;142:241-3.
А Т У Р А / R E F E
3. Crowley E., Di Nicolantonio F., Loupakis F., Bardelli A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat Rev Clin Oncol 2013;10(8):472-84.
4. Hibi K., Robinson C.R., Booker S. et al. Molecular detection of genetic alterations in the serum of colorectal cancer patients. Cancer Res 1998;58(7):1405-7.
R E N C E S
5. Schwarzenbach H., Hoon D.S.,
Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nat Rev Cancer 2011;11(6):426-37.
6. Atamaniuk J., Vidotto C., Tschan H. et al. Increased concentrations of cell-free plasma DNA after exhaustive exercise. Clin Chem 2004;50(9):1668-70.
7. Heitzer E., Ulz P., Geigl J.B. Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clin Chem 2015;61(1):112-23.
8. Ignatiadis M., Dawson S.J. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA
for precision medicine: dream or reality? Ann Oncol 2014;25(12):2304-13.
9. Lecomte T., Ceze N., Dorval E., Laurent-Puig P. Circulating free tumor DNA and colorectal cancer. Gastroenterol Clin Biol 2010;34(12):662-81.
10. Xie F., Yan X., Madan A. et al. Examination of circulating DNA by using next generation sequence technology in colorectal cancer. J Clin Oncol 2015;33(suppl):abstr e14507.
11. Jahr S., Hentze H., Englisch S. et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res 2001;61:1659-65.
12. Mouliere F., Robert B., Arnau P.E. et al. High fragmentation characterizes tumour derived circulating DNA. PLoS One 2011;6(9):e23418.
13. Sikora A., Zimmermann B.G., Rusterholz C. et al. Detection of increased amounts of cell-free fetal DNA with short PCR amplicons. Clin Chem 2010;56(1):136-8.
14. Diehl F., Li M., Dressman D. et al. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102(45):16368-73.
15. Andersen R.F., Spindler K.L., Brandslund I. et al. Improved sensitivity
of circulating tumor DNA measurement using short PCR amplicons. Clin Chim Acta 2015;439:97-101.
16. Thierry A.R., Mouliere F., El Messaoudi S. et al. Clinical validation of the detection
of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA. Nat Med 2014;20(4):430-5.
17. Jung K., Fleischhacker M., Rabien A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker - a critical appraisal of the literature. Clin Chim Acta 2010;411(21-22):1611-24.
18. Wasserkort R., Kalmar A., Valcz G. et al. Aberrant septin 9 DNA methylation
in colorectal cancer is restricted to a single CpG island. BMC Cancer 2013;13:398.
19. Danese E., Minicozzi A.M., Benati M. et al. Comparison of genetic and epigenetic alterations of primary tumors and matched plasma samples in patients with colorectal cancer. PLoS One 2015;10(5):e0126417
20. Di Fiore F., Charbonnier F., Lefebure B. et al. Clinical interest of KRAS mutation detection in blood for anti-EGFR therapies in met-astatic colorectal cancer. Br J Cancer 2008;99(3):551-2.
21. Kuo Y.B., Chen J.S., Li Y.S. et al. Comparison of KRAS mutation analysis of primary tumors and matched 2 circulating cell-free DNA in plasmas of patients with colorectal cancer. Clin Chim Acta 2014;433:284-9.
22. Bettegowda C., Sausen M., Leary R.J. et al. Detection of circulating tumor DNA
in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med 2014;6(224):224ra24.
23. Garcia J.L., Matos I., Mejorada R.L. et al. Mutational analysis of circulating DNA and cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann Oncol 2014;25(suppl 4):iv546-63.
24. Takahashi G., Yamada T., Kan H. et al. Self-expandable colonic stent increases plasma level of circulating cell free DNA significantly in patients with obstructive colorectal cancer. ECCO 2015;abstr 2028.
25. Iwai T., Yamada T., Kan H. et al. Follow-up after resection of metastatic liver tumor from colorectal cancer using circulating cell-free DNA. ECCO 2015;abstr 434.
26. Reinert T., Schaler L.V., Thomsen R. et al. Analysis of circulating tumour DNA to monitor disease burden following colorectal cancer surgery. Gut 2016;65(4):625-34.
27. Hayashi N., Egami H., Kai M. et al. No-touch isolation technique reduces intraoperative shedding of tumor cells into the portal vein during resection of colorectal cancer. Surgery 1999;125(4):369-74.
28. Spindler K.L.G., Appelt A.L., Pallisgaard N. et al. Cell-free DNA levels in colorectal cancer patients treated with irinotecan, healthy controls, and non-cancer patients with comorbidity. J Clin Oncol 2014;32(5s):abstr 3559.
29. Pucciarelli S., Enzo M., Agostini M. et al. Cell-free circulating DNA as a promising marker of colorectal cancer detection and progression. J Clin Oncol 2009;27(15s):abstr 11059.
30. Danese E., Montagnana M., Minicozzi A.M. et al. Real-time polymerase chain reaction quantification of free DNA
in serum of patients with polyps and colorectal cancers. Clin Chem Lab Med 2010;48(11):1665-8.
31. Frattini M., Gallino G., Signoroni S. et al. Quantitative and qualitative characterization of plasma DNA identifies primary and recurrent colorectal cancer. Cancer Lett 2008;263(2):170-81.
32. Kopreski M.S., Benko F.A., Borys D.J. et al. Somatic mutation screening: identification of individuals harboring K-ras mutations with the use of plasma DNA. J Natl Cancer Inst 2000;92(11):918-23.
33. Tie J., Kinde I., Wang Y. et al. Circulating tumor DNA (ctDNA) as a marker
of recurrence risk in stage II colon cancer (CC). J Clin Oncol 2014;32(5s): abstr 11015.
34. Tie J., Wang Y., Kinde I. et al. Circulating tumor DNA (ctDNA) in nonmetastatic colorectal cancer (CRC): Potential role
as a screening tool. J Clin Oncol 2015;33(s3):abstr 518.
35. Messaoudi S.E., Mouliere F., Mollevi C. et al. Circulating DNA as a strong multimarker prognostic tool in metastatic colorectal cancer patients. J Clin Oncol 2014;32(5s):abstr 3604.
36. Liu F., Li C., Zhao J. et al. Detection of KRAS mutations in plasma from patients
with metastatic colorectal cancer by the next-generation sequencing. ECOO 2015;abstr 2185.
37. Sefrioui D., Vasseur N., Sesboüé R. et al. Plasma cell-free DNA and fraction
of circulating KRAS mutations as prognostic in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2014;32(3s):abstr 490.
38. Sefrioui D., Vasseur C., Sesboué R. et al. Clinical interest of digital PCR for routine detection of circulating DNA in metastatic colorectal cancer. Ann Oncol 2014; 25(suppl 4):iv546-63.
39. Marziali A., Vysotskaia V., Wiggin M. et al. Circulating tumor DNA as a highly specific diagnostic marker for colorectal cancer. J Clin Oncol 2014;32(suppl):abstr e22126.
40. Scott R., Dooley S., Lewis W. et al. Concordance of RAS mutation status in CRC patients by comparison of results from circulating tumour DNA and tissue-based testing. Ann Oncol 2015;26(suppl 4):1-100.
41. Jones F., Edelstein D., Wichner K. et al. Concordance of RAS mutation status
in metastatic CRC patients by comparison of results from circulating tumor DNA and tissue-based RAS testing. ECOO 2015;abstr 2012.
42. Yamada T., Kan H., Matsumoto S. et al. Liquid biopsy detection of KRAS and BRAF mutations may be useful as a prognostic
or predictive marker. Ann Oncol 2014; 25(suppl 4):iv58-84.
43. Poole J.C., Vibat C.R.T., Benesova L. et al. Highly sensitive quantitative detection
of circulating tumor DNA in urine and plasma from advanced colorectal cancer patients in aid of early diagnosis of clinically relevant KRAS mutations. J Clin Oncol 2015; 33(suppl 3):abstr 654.
44. Janku F., Vibat C.R.T., Falchook G.S.
et al. Low frequency KRAS G12/13 mutations in urine cell-free (cf) DNA from patients with BRAF V600E-mutant advanced cancers. J Clin Oncol 2015;33(suppl 3):abstr 11048.
45. Morelli M.P., Overman M.J., Sanchez E.V. et al. Frequency of concurrent gene mutations and copy number alterations in circulating cell-free DNA (cfDNA) from refractory metastatic CRC patients. J Clin Oncol 2014;32(5s):abstr 11117.
46. Tabernero J., Lenz H.J., Siena S. et al. Analysis of circulating DNA and protein biomarkers to predict the clinical activity
of regorafenib and assess prognosis in patients with metastatic colorectal cancer: a retrospective, exploratory analysis of the CORRECT trial. Lancet Oncol 2015;16(8):937-48.
47. Wong A.L., Lim J.S., Sinha A. et al. Tumour pharmacodynamics and circulating cell free DNA in patients with refractory colorectal carcinoma treated with regorafenib. J Transl Med 2015;13:57.
48. Teufel M., Kalmus J., Rutstein M. et al. Analysis of biomarkers in circulating tumor DNA from the phase 3 CONCUR study
of regorafenib in Asian patients with metastatic
E ra
as
E
E
«0
09
E
colorectal cancer (mCRC): Correlation with clinical outcome. ECOO 2015;abstr 2013.
49. Trevisiol C., Di Fabio F., Nascimbeni R. et al. Prognostic value of circulating KRAS2 gene mutations in colorectal cancer with distant metastases. Int J Biol Markers 2005;21(4):223-8.
50. Ryan B.M., Lefort F., McManus R. et al. A prospective study of circulating mutant KRAS2 in the serum of patients with colorectal neoplasia: strong prognostic indicator in postoperative follow up. Gut 2003;52(1):101-8.
51. Lecomte T., Berger A., Zinzindohoue F. et al. Detection of freecirculating tumor-associated DNA in plasma of colorectal cancer patients and its association with prognosis. Int J Cancer 2002;100(5):542-8.
52. Mora J., Urgell E., Farre A. et al. Agreement be-519 tween K-ras sequence variations detected in plasma and tissue DNA in pancreatic and colorectal cancer. Clin Chem 2006;52(7):1448-9.
53. de Kok J.B., van Solinge W.W., Ruers T.J. et al. Detection of tumour DNA in serum
of colorectal cancer patients. Scand J Clin Lab Invest 1997;57(7):601-4.
54. Kopreski M.S., Benko F.A., Borys D.J. et al. Somatic mutation screening: identification of individuals harboring K-ras mutations with the use of plasma DNA. J Natl Cancer Inst 2000;92(11):918-23.
55. Minarikova P., Benesova L., Belsanova B. et al. Evaluation of circulating-tumor DNA (ctDNA) as a source material for molecular phenotyping of colorectal tumors. J Clin Oncol 2015;33(suppl 3):abstr 642.
56. Morris V.K., Morelli M.P., Janku F. et al. Clinical utility of a circulating cell-free DNA assay for clinical trial enrollment in refractory metastatic colorectal cancer patients. J Clin Oncol 2015;33(suppl 3):abstr 3601.
57. Nowell PC. The clonal evolution of tumor cell populations. Science 1976;194(4260):23-8.
58. Gerlinger M., Rowan A.J., Horswell S. et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366(10):883-92.
59. Kreso A., O'Brien C.A., van Galen P. et al. Variable clonal repopulation dynamics influence chemotherapy response
in colorectal cancer. Science 2013;339(6119):543-8.
60. Brannon A., Vakiani E., Sylvester B.E.
et al. Comparative sequencing analysis reveals high genomic concordance between matched primary and metastatic colorectal cancer lesions. Genome Biol 2014;15(8):454.
61. Donna M.A., Graham M., Mahadeo A. et al. Analysis of clonal evolution in colorectal cancer. J Clin Oncol 2014;32(5s).
62. Xie T., Cho Y.B., Wang K. et al. Patterns of somatic alterations between matched primary and metastatic colorectal tumors characterized by whole-genome sequencing. Genomics 2014;104(4):234-41.
63. Lee S.Y., Haq F., Kim D. et al. Comparative genomic analysis of primary and synchronous metastatic colorectal cancers. PLoS One 2014;9(3):e90459.
64. Sottoriva A., Kang H., Ma Z. et al. A Big Bang model of human colorectal tumor growth. Nat Genet 2015;47(3):209-16.
65. Diaz L.A. Jr, Williams R.T., Wu J. et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature 2012;486(7404):537-40.
66. Mohan S., Heitzer E., Ulz P. et al. Changes in colorectal carcinoma genomes under anti-EGFR therapy identified by whole-genome plasma DNA sequencing. PLoS Genet 2014;10(3):e1004271.
67. Misale S., Yaeger R., Hobor S. et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature 2012;486(7404):532-6.
68. Valtorta E., Misale S., Sartore-Bianchi A. et al. KRAS gene amplification in colorectal cancer and impact on response
to EGFR-targeted therapy. Int J Cancer 2013;133(5):1259-65.
69. Bardelli A., Corso S., Bertotti A. et al. Amplification of the MET receptor drives resistance to antiEGFR therapies in colorectal cancer. Cancer Discov 2013;3(6):658-73.
70. Kopetz S., Overman M.J., Chen K. et al. Mutation and copy number discordance
in primary versus metastatic colorectal cancer (mCRC). J Clin Oncol 2014;32(5s): abstr 3509.
71. Graham D.M., Arseneault M.,
Sukhai M.A. et al. Analysis of clonal evolution in colorectal cancer. J Clin Oncol 2014;32(5s): abstr 3510.
72. Diehl F., Schmidt K., Choti M.A. et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med 2008;14(9):985-90.
73. Leary R.J., Kinde I., Diehl F. et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci Transl Med 2010;2(20):20ra14.
74. Holdhoff M., Schmidt K., Donehower R., Diaz L.A. Jr. Analysis of circulating tumor DNA to confirm somatic KRAS mutations.
J Natl Cancer Inst 2009;101(18):1284-5.
75. Mouliere F., Thierry A.R. The importance of examining the proportion of circulating
DNA originating from tumor, microenvironment and normal cells in colorectal cancer patients. Expert Opin Biol Ther 2012;12(Suppl 1): S209-15.
76. Lee J., Mortimer S., Mei G. et al. Ultra-high-quality sequencing assay for comprehensive genetic panel analysis of tumor-derived circulating cell-free DNA in colorectal cancer patients. J Clin Oncol 2014;
32 (suppl 3):abstr 504.
77. Spindler K.L., Pallisgaard N., Vogelius I., Jakobsen A. Quantitative cell free DNA, KRAS, and BRAF mutations in plasma from patients with metastatic colorectal cancer during treatment with cetuximab and irinotecan. Clin Cancer Res 2012;18(4);1177-85.
78. Teufel M., Kalmus J., Rutstein M. et al. Analysis of biomarkers in circulating tumor DNA from the phase 3 CONCUR study
of regorafenib in Asian patients with metastatic colorectal cancer (mCRC): Correlation with clinical outcome. ECOO 2015;abstr 2013.
79. Pallisgaard N., Spindler K.G., Vogelius I.S. et al. Cell-free DNA, KRAS, and BRAF mutations in plasma from patients with metastatic colorectal cancer treated with third-line cetuximab and irinotecan. J Clin Oncol 2011;29(suppl):abstr 3599.
80. Spindler K.G., Pallisgaard N., Skovgaard K. et al. Circulating free DNA and plasma KRAS mutations in metastatic colorectal cancer patients treated with bi-weekly cetuximab and iri-notecan. Ann Oncol 2014;25(suppl 4):iv58-84.
81. Mende M., Thiede C., Schuster C. et al. Detection of tumor progression via cell-free DNA (cfDNA) in patients with colorectal cancer. J Clin Oncol 2015;33(suppl 3):abstr 598.
82. Takayama Y., Suzuki K., Daito T. et al. Emergence of KRAS mutation in detection of circulating tumor DNA during treatments for metastatic gastrointestinal cancer patients. J Clin Oncol 2015;33(suppl 3):abstr 11026.
83. Lindforss U., Zetterquist H., Papadogi-annakis N., Olivecrona H. Persistence of K-ras mutations in plasma after colorectal tumor resection. Anticancer Res 2005;25(1B):657-61.
84. Siravegna G., Mussolin B., Buscarino M. et al. Clonal evolution and resistance to EGFR blockade in the blood of colorectal cancer patients. Nat Med 2015;21(7):827.
85. Hobor S., Van Emburgh B.O., Crowley E. et al. TGF-a and amphiregulin paracrine network promotes resistance to EGFR blockade in colorectal cancer cells. Clin Cancer Res 2014;20(24):6429-38.
86. Hindson B.J., Ness K.D. Masquelier D.A. et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem 2011;83(22):8604-10.
