CC BY
15Fundamental and Applied NanoElectroMag-netics (FANEM'12). The 25th anniversary of the Research Institute for Nuclear Problems BSU. Conference Proceedings. - May 22-25, 2012. - Minsk, Belarus: Belarussian State University, 2012. - P. 15.
19. Quantum-chemical modeling of en-dohedral derivatives of buckminsterfuller-enes Gd@C60(CHR)2 and Gd@C80(CHR)2 / E. A. Dikusar [et al.] // Theoret. and experiment. chem. - 2010. - Vol. 46. - № 4. - P. 213-217.
20. Машковский, М. Д. Лекарственные средства / М. Д. Машковский - М.: Новая Волна, 2014. - 1200 с.
21. Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот, Д. Эллиот - М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2002. - 446 с.
22. Huennekers, F. M. The methotrex-ate story: a paradigm development of cancer therapeutic agents / F. M. Huennekers // Adv. Enzyme Regulation. - 1994. - Vol. 34, № 1. -P. 392-419.
23. Sandler, S. I. Chemical, biochemical, and engineering thermodynamics / S. I. Sandler. - John Wiley & Sons., Inc., 2006. -760 p.
24. Demerel, Y. Nonequilibrium thermodynamics: transport and rate processes in physical, chemical and biological systems / Y. Demerel. - 3rd ed. - Amsterdam, Oxford: Elsevier Science, 2014. - 792 p.
25. Молекулярное моделирование: теория и практика / Х.-Д. Хельтье [и др.]. -М.: Лаборатория знаний, 2010. - 318 с.
26. Каплан, И. Г. Межмолекулярные взаимодействия / И. Г. Каплан. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. - 394 с.
27. Романовский, И. В. Теоретический курс биоорганической химии: учебно-методическое пособие / И. В. Романовский, О. Н. Ринейская, В. В. Пинчук. - Минск: БГМУ, 2010. - 166 с.
Адрес для корреспонденции
220072, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Сурганова 13, Институт физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси, тeл. +375-17-2841600, моб. +375-29-6228644, e-mail: dikusar@ifoch.bas-net.by, Дикусар Е. А.
Поступила 30.12.2016 г.
С. В. Баюрка, С. А. Карпушина
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИРТАЗАПИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА В МОЧЕ НА ОСНОВЕ КОМБИНИРОВАНИЯ МЕТОДОВ ТСХ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
Национальный фармацевтический университет, г. Харьков, Украина
Предложены условия обнаружения и идентификации миртазапина в моче после приема разовой терапевтической дозы антидепрессанта на основе комбинированного использования методов ТСХ и масс-спектрометрии. Разработана методика жидкость-жидкостной экстракции миртазапина и его метаболита из мочи хлороформом при рН 8—9. Предварительно проводили кислотный гидролиз конъюгатов и экстракционную очистку гидролизита диэтиловым эфиром из кислой среды. Установлены параметры хроматографической подвижности нативного соединения и Nоксида миртазапина в скрининговых ТСХ-системах, а также результаты их визуализации хромогенными реактивами, используемыми для токсикологического скрининга в систематическом токсикологическом анализе. Предложены подвижные фазы с обратной корреляцией значений hRf нативного вещества и метаболита: эти-лацетат — метанол — 25%раствор аммиака (85:10:5); метанол — 25%раствор аммиака (100:1,5); циклогексан - толуол - диэтиламин (75:15:10); толуол - ацетон — этанол — 25%раствор аммиака (45:45:7,5:2,5). Структуру нативного соединения и метаболита, экстрагированных из мочи, подтверждали масс-спектрометрически. Использовали ионизацию электронным ударом (70 эВ), прямой ввод пробы в ионную камеру, режим полного сканирования.
Ключевые слова: миртазапин, Nоксид миртазапина, экстракция из мочи, тонкослойная хроматография, масс-спектрометрия.
Вестник фармации №1 (75) 2017 ВВЕДЕНИЕ
Миртазапин (1,2,3,4,10,146 - Гексагид-ро-2-метилпиразино[2,1 -а]пиридо[2,3-с] [2]-бензазепин) - современный анксио-литик, относящийся к группе норадре-нергических селективных серотонинер-гических антидепрессантов (НаССА) [1]. Миртазапин применяют для лечения депрессивных состояний различной степени тяжести [2, 3], в комплексном лечении алкогольной [4] и наркотической зависимостей [5], отмечена его эффективность при депрессиях, резистентных к трици-клическим антидепрессантам (ТЦА) [3]. Несмотря на то, что миртазапин рассматривают как один из наиболее безопасных антидепрессантов [6], кардиотоксическое действие препарата явилось причиной смертельного отравления [7]. Для лечения резистентных депрессий используют сочетание нескольких антидепрессантов с разным механизмом тимолептического действия, в частности, НаССА с ТЦА [3], селективными ингибиторами обратного захвата серотонина (СИОЗС) [8] и ингибиторами обратного захвата серотонина и норадреналина (ИОЗСН) [9]. «Серото-ниновый синдром», как следствие осложнений комбинированной терапии антидепрессантами, неоднократно был причиной острых и смертельных отравлений [10]. Это дает основание рассматривать миртазапин как потенциальный объект токсикологического скрининга [7, 11, 12]. Согласно результатам фармакокинетических исследований, около 75% от принятой дозы миртазапина элиминируется с мочой, преимущественно в виде продуктов метаболизма, в течение нескольких дней [13, 14]. Концентрация миртазапина в моче при смертельных отравлениях находилась в диапазоне 0,01-6,5 мг/л [11-14].
Одним из основных скрининговых методов, используемых в клинической и судебной токсикологии, является ТСХ-скрининг [15, 16]. Универсальность подхода обеспечивается наличием базы данных по параметрам хроматографической подвижности более 1600 токсикологически значимых веществ для ряда стандартных ТСХ-систем, которые рекомендованы Комитетом по систематическому токсикологическому анализу (СТА) Международной ассоциации судебных токсикологов (Т1АБТ) [14, 16]. Последо-
вательное применение ТСХ-скрининга и масс-спектрометрии представляет собой подход, который сочетает относительную доступность и надежную идентификацию токсиканта и продуктов его биотрансформации [16]. В литературе отсутствуют данные по изучению хроматографической подвижности миртазапина в тонких слоях сорбента.
Целью наших исследований явилась разработка условий обнаружения и идентификации миртазапина в моче в присутствии продуктов его биотрансформации с комбинированным использованием ТСХ-скрининга и метода масс-спектрометрии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Миртазапин принимал мужчина в возрасте 46 лет, здоров, внутрь 2 таблетки «Миртел» (по 30 мг) после еды, что соответствовало разовой терапевтической дозе лекарственного средства (ЛС). Мочу собирали с учетом данных литературы по элиминации миртазапина [13, 14]. Время полувыведения ЛС составляет 20-40 ч. Пробы мочи собирали в течение 36 ч порциями по 50 мл, начиная с семи часов после приема ЛС. Пробоподговку мочи для целей токсикологического скрининга проводили в условиях, соответствующих общепринятым в химико-токсикологическом анализе методам изолирования лекарственных веществ. Согласно полученным нами ранее результатам определения степени экстракции миртазапина из водных растворов в зависимости от природы органического растворителя и рН водной фазы, хлороформом из кислой среды (рН 1-2) экстрагировалось 4-6% миртазапина, из щелочной среды (рН 8-9) - 25-27% антидепрессанта. Степень экстракции ЛС диэтиловым эфиром при указанных выше значениях рН составила 2-5% и 26-27% соответственно.
Методика изолирования миртазапина из мочи. К 20 мл мочи добавляли концентрированную кислоту хлористоводородную (из расчета 0,10 мл кислоты на 2,0 мл биологической жидкости) и проводили кислотный гидролиз, нагревая полученную смесь в течение 30 мин на кипящей водяной бане. Охлажденный гидро-лизат дважды взбалтывали в делительной воронке с 10 мл диэтилового эфира по
5 мин каждый раз. Фазу органического растворителя отбрасывали, оставшийся кислый водный слой подщелачивали 20% раствором натрия гидроксида до рН 8-9 и проводили трехкратную экстракцию хлороформом порциями по 10 мл. Объединенный органический экстракт фильтровали через бумажный фильтр, содержащий 0,5 г безводного сульфата натрия, и выпаривали досуха на водяной бане при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяли в хлороформе, переносили в мерную колбу вместимостью 25,00 мл и доводили указанным растворителем до метки.
Предварительно было проведено исследование устойчивости раствора мирта-запина к примененным условиям кислотного гидролиза мочи. Контролировали возможное появление продуктов кислотной деструкции миртазапина методом ТСХ в условиях, описанных ниже. При этом дополнительных пятен на хроматограммах не наблюдали. Параллельно проводили «холостые» опыты с пробами мочи волонтера, полученные до употребления им миртазапина.
Методика исследования экстрактов методом ТСХ. На линию старта хро-матографической пластины Merck (Silica gel 60 F254, размер 10 х 20 см) точечно наносили по 1/10 части экстрактов из ги-дролизата мочи, содержащей миртазапин, и гидролизата, полученного в «холостом» опыте, по 10 мкл стандартных растворов миртазапина и референтного вещества (перечень приведен ниже) в хлороформе (10 мг/мл). На одну из хроматографи-ческих пластин, которую в дальнейшем развивали в подвижной фазе (П.Ф.) № 2 (перечень П.Ф. приведен ниже), полосой наносили оставшуюся часть исследуемого экстракта, выпаренного до минимального объема (~ 0,05 мл). Хроматограммы развивали в хлороформе, высушивали на воздухе и развивали повторно в одной из П.Ф (№): этилацетат - метанол - 25% раствор аммиака (85:10:5) (№ 1); метанол - 25% раствор аммиака (100:1,5) (№ 2); циклогексан - толуол - диэти-ламин (75:15:10) (№ 3); толуол - ацетон - этанол - 25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5) (№ 4). Хроматограммы проявляли последовательно раствором нингидрина и реактивом Драгендорфа по Мунье (или подкисленным раствором
калий йодплатината). Наблюдали появление окрашенных пятен. Экстракт, полученный в «холостом» опыте, соответствующих пятен не давал. По величине ИЯ^. миртазапина в стандартном растворе устанавливали локализацию нативного соединения на хроматограмме. Пробу экстракта, которая была нанесена полосой, реактивами для проявления не обрабатывали. С непроявленной полосы на уровне, соответствующем месту нахождения окрашенных пятен, элюировали исследуемые вещества метанолом (степень элюи-рования составляла 99,5±2,0%). Полученные элюаты использовали для проведения реакций с рядом хромогенных реактивов, приведенных в таблице.
Методика масс-спектрометричес-кого исследования элюатов. Исследование элюатов с хроматограмм проводили на масс-спектрометре Уапап 1200 L (Нидерланды) с двойным квадрупольным масс-анализатором. Использовали ионизацию электронным ударом (70 эВ) и прямой ввод пробы в ионную камеру, исследования проводили в режиме полного сканирования.
РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно литературным данным [13, 14], в процессе биотрансформации мирта-запина возможно образование 8-гидрок-симиртазапина, #-дезметилмиртазапина и его 8-гидроксипроизводного, ^-оксида миртазапина. Поскольку большая часть образовавшихся метаболитов вступает в реакцию конъюгации с глюкуроновой кислотой, на этапе пробоподготовки нами был проведен кислотный гидролиз конъ-югатов.
При исследовании экстрактов из мочи методом ТСХ на хроматограммах наблюдали пятна нативного вещества и одного продукта биотрансформации миртазапина. Значения детектированных соединений и результаты реакций окрашивания их с реактивами-визуализаторами приведены в таблице. Для стандартизации условий хро-матографирования были подобраны референтные вещества: П.Ф. № 1 - амброксол (ИЯГ 41), П.Ф. № 2 и 3 - галидор (И^ 39 и 64 соответственно), П.Ф. № 4 - антипирин (ИЯГ 46).
В П.Ф. № 1 и 2 значения ИЯ^. нативно-го вещества и метаболита имели обратную
Таблица - Параметры хроматографической подвижности и результаты визуализации миртазапина и его метаболита - ^-оксида миртазапина
TT - Значения hRf ± A hRf (n = 5; Р = 0,95)
Подвижная фаза № Миртазапин Метаболит
1 0,85 ± 0,04 0,71 ± 0,04
2 0,65 ± 0,03 0,59 ± 0,03
3 0,40 ± 0,04 0,62 ± 0,04
4 0,55 ± 0,02 0,71 ± 0,02
Результаты визуализации
Реактив Миртазапин Метаболит
Драгендорфа оранжевое оранжевое
Калий иодплатинат подкисленный сине-фиолетовое сине-фиолетовое
Нингидрин * н.о. н.о.
Манделина оранжевое коричнево-же лто е
Формальдегид (пары) + р-в Манделина оранжевое коричневое
Либермана бледно-оранжевое н.о.
Н^04 конц. коричнево-бурое н.о.
Фреде н.о. н.о.
Эрдмана н.о. н.о.
Марки н.о. н.о.
НШ3 конц. н.о. н.о.
НС104 конц. н.о. н.о.
Примечание: * — нет окрашивания.
корреляцию по отношению к П.Ф. № 3 и 4. Условия хроматографического анализа, при которых наблюдается обратная корреляция параметров хроматографической подвижности, позволяют повысить надежность идентификации токсиканта методом тонкослойной хроматографии [14, 16]. Предварительно, с использованием стандартных растворов ЛС в хлороформе, были изучены реакции окрашивания миртазапина с рядом хромогенных реактивов и установлены их чувствительности (мкг в пробе): реактив Драгендорфа (1,0), калий иодплатинат подкисленный (0,5), реактив Манделина (3,0), пары формальде-
гида + реактив Манделина (3,0), реактив Либермана (15,0), серная кислота концентрированная (12,0).
Исследование элюатов с хроматограм-мы методом масс-спектрометрии позволило подтвердить структуру нативного соединения, экстрагированного из мочи (рисунок 1), и установить структуру детектируемого на хроматограмме метаболита -7У-оксида миртазапина (рисунок 2).
Для установления структуры использовали базу данных масс-спектров МБТ 08 и значение молекулярных масс соединений, которые определяли по положению пиков молекулярных ионов в масс-спектрах.
¡pectum 1А
BP: 195t1-11feH-e=1ciP4*'i- -n-tazap ie-dep-г 1 П. П&.201 S.xms лпяп. Spans: 72-74, 50.0:4ДД_Р>. Ion: NA, RIC: З.ВЗЗ&+Э, ВС
"11 t _i_..til.IJ I._i.i .hi_Ll . ii..
106
_L<_4_
265
Exact Mass 265,41 1
- 3 - :■ ■ i
Рисунок 1 - Масс-спектр миртазапина, экстрагированного из мочи (основные ионы m/z 195, 194, 265, 193, 139, 69, 111, 166, 222, 264)
Jji^r.rru:Vi l'A' ВГ* flfi t Я OA-J»«-* 7 I ....... 1.W-■ ..............Г-- h ч >
1СИИ JQI"- mir, Г; ,1 Г.' Il: :i "-i . и OT-flO. Ml П 4M О-. Ii ir . Г . ■ I-' ■. ■■ : I ■
Ml
_L
jr
E*acl Mass: 291.153
Uiiii
' №
TiiT
г I
Рисунок 2 - Масс-спектр метаболита миртазапина, экстрагированного из мочи (основные ионы m/z 65, 79, 97, 61, 266, 280)
ВЫВОДЫ
Предложены условия обнаружения и идентификации миртазапина в моче на основе комбинированного использования методов ТСХ и масс-спектрометрии. Разработана методика жидкость-жидкостной экстракции миртазапина и его метаболита из мочи после кислотного гидролиза конъюгатов. Разработаны условия ТСХ-скрининга миртазапина в присутствии продуктов его биотрансформации. Установлены параметры хроматографической подвижности нативного соединения и ^-оксида миртазапина в скрининговых ТСХ-системах, а также результаты реакций их визуализации хромогенными реактивами, используемыми в СТА. Предложены подвижные фазы с обратной корреляцией значений hRf нативного вещества и метаболита, использование которых позволяет повысить надежность предварительной идентификации токсиканта методом тонкослойной хроматографии. Показана возможность детектирования миртазапина и его метаболита - ^-оксида миртазапина в моче методом ТСХ после приема разовой терапевтической дозы антидепрессанта.
SUMMARY
S. V. Bayurka, S. A. Karpushyna IDENTIFICATION OF MIRTAZAPINE AND ITS METABOLITE IN URINE BASED ON THE COMBINATION OF TLC AND MASS-SPECTROMETRY METHODS The conditions of detection and identification for mirtazapine in the urine after administration of a single therapeutic dose of
the antidepressant based on the combined use of TLC and mass spectrometry methods have been proposed. The liquid-liquid extraction method of mirtazapine and its metabolite from urine with chloroform at pH 8-9 has been developed. The acid prehydrolysis of conjugates and back-extraction purification of the hydro-lysate by diethyl ether at acidic medium were carried out. Chromatographic mobility of the native compound and mirtazapine-N-oxide in the TLC screening systems as well as the results of visualization with chromogenic reagents applied for toxicological drug screening in systematic toxicological analysis have been determined. Mobile phases with inverse correlation of hRf values of the native substance and metabolite have been proposed. They were ethyl acetate - methanol - 25% ammonia solution (85:10:5); methanol - 25% ammonia solution (100:1.5); cyclohex-ane - toluene - diethylamine (75:15:10); toluene - acetone - ethanol - 25% ammonia solution (45:45:7.5:2.5). The structure of the native compound and metabolite extracted from urine was confirmed by mass-spectrometry. Electron impact ionization (70 eV), direct input of the sample into ionization chamber, full scan mode were used.
Keywords: mirtazapine, mirtazapine-N-oxide, extraction from urine, thin-layer chro-matography, mass-spectrometry.
ЛИТЕРА ТУРА
1. Anttila, S. A. A review of the pharmacological and clinical profile of mirtazapine / S. A. Anttila, E. V. Leinonen // CNS Drug Rev. - 2011. - V. 7 (3). - P. 249-264.
2. Дробижев, М. Ю. Как использовать миртазапин в клинической практике? /
М. Ю. Дробижев, С. В. Кикта // Соц. и клин. психиатрия. - 2009. - № 3. - С. 60-65.
3. Павличенко, А. В. Клинические особенности применения миртазапина (Миртазонала) / А. В. Павличенко // Эффективная фармакотерапия в неврологии и психиатрии. - 2010. - № 3. - С. 16-20.
4. Малин, Д. И. Эффективность реме-рона в комплексной терапии алкогольного абстинентного синдрома / Д. И. Малин, Е. В. Янкин, В. М. Медведев // Психиатрия и психофармакотерапия. - 2003. - Т. 5, № 3. -С. 113-115.
5. Mirtazapine and mirtazapine-like compounds as possible pharmacotherapy for substance abuse disorders: evidence from the bench and the bedside / S. M. Graves [et al.] // Pharmacol. Ther. - 2012. - V. 136 (3) - P. 343-353.
6. Lack of significant toxicity after mirtazapine overdose: a five-year review of cases admitted to a regional toxicology unit / W. S. Waring [et al.] // Clin. Toxicol. - 2007. - V. 45 (1). - P. 45-50.
7. Tissue distribution of mirtazapine and desmethylmirtazapine in a case of mirtazapine poisoning / S. Wenzel [et al.] // Forensic Sci. Int. - 2006. - V. 156 (2-3). - P. 229-236.
8. Mirtazapine and paroxetine in major depression. A comparison of monotherapy versus their combination from treatment initiation / P. Blier [et al.] // J. Eur. Neuropharm. -2009. - V. 19 (7). - P. 457-465.
9. Rush, A. J. Tranylcypromine Versus Venlafaxine Plus Mirtazapine Following Three Failed Antidepressant Medication Trials for Depression: a STAR'D Report / A. J. Rush // Am. J. Psychiatry. - 2006. - V. 163 (9). - P. 1531-1541.
10. First death case of serotonin syndrome
in Japan induced by fluvoxamine and tandospirone / T. Kawano [et al.] // Chudoku Kenkyu. - 2011. - 24 (4). - P. 305-310.
11. Anderson, D. T. Distribution of mir-tazapine (Remeron) in thirteen postmortem cases / D. T. Anderson, K. L. Fritz, J. J. Muto // J. Anal. Toxicol. - 1999. - V. 23 (6). -P. 544-548.
12. Tissue distribution of mirtazapine (Re-meron) in postmortem cases / K. A. Moore [et al.] // J. Anal. Toxicol. - 1999. - V. 23 (6). -P. 541-543.
13. Baselt, C. R. Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man: 9-th edition / C. R. Baselt. - Seal Beach, California: Biomedical Publications, 2011. - 1900 p.
14. Clarke's analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material: 4-th edition / A. C. Moffat [et al.]. - London, Chicago: Pharmaceutical Press, 2011. - 2736 p.
15. Методы химико-токсикологического анализа в диагностике сочетанных отравлений психотропными препаратами / Ж. А. Лисовик [и др.] // Токсикологический вестник. - 2008. - № 5. - С. 2-6.
16. Jickells, S. Clarke's Analytical Forensic Toxicology / S. Jickells, A. Negrusz. -London: Pharmaceutical Press, 2008. - 648 p.
Адрес для корреспонденции:
61168, Украина,
г. Харьков, ул. Валентиновская, 4,
Национальный фармацевтический университет,
кафедра лекарственной
и аналитической токсикологии,
тел. раб. 038(0572) 67-91-92,
e-mail: svitkrp@gmail.com,
Карпушина С. А.
Поступила 21.12.2016 г.
