CC BY
0
DOI: 10.24412/2074-5036-2024-262-15-19 УДК: 579.62: 577.29
Ключевые слова: кишечник, поросята, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, ЖКТ, идентификация, свойства
Key words: gut, piglets, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, gastrointestinal tract, identification, properties
1,3Сыромятников М. Ю., 2Шабунин С. В., 1,3Нестерова Е. Ю., Чладких М. И., Толкачева А. А., 1Бондарева О. В., 1Корнеева О. С., 2Михайлов Е. В.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СВОЙСТВА ЛАКТОБАКТЕРИЙ В КИШЕЧНИКЕ ПОРОСЯТ
IDENTIFICATION AND PROPERTIES OF LACTOBACILLACEAE IN INTESTINES OF PIGLETS
'ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет инженерных технологий». Адрес: 394036, Россия, Воронеж, пр. Революции, 19
Voronezh State University of Engineering Technologies. Address: 394036, Russia, Voronezh, Revolutsiipr., 19. 2ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии». Адрес: 394087, Россия, Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б All-Russian Veterinary Research Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy. Address: 394087, Russia, Voronezh, Lomonosova st., 114-b 3ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет». Адрес: 394018, Россия, Воронеж, Университетская пл. 1 Voronezh State University. Address: 394018, Russia, Voronezh, 1 Universitetskaya sq.
Сыромятников Михаил Юрьевич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий. E-mail: mihan.vrn@mail.ru
Syromyatnikov Mikhail Yurievich, PhD of Biological Sciences, Leading Researcher at the Laboratory of Metagenomics and Food Biotechnologies, e-mail: mihan.vrn@mail.ru Шабунин Сергей Викторович, доктор ветеринарных наук, научный руководитель. E-mail: svshabunin@rambler.ru Shabunin Sergey Viktorovich, Doctor of Veterinary Sciences, Scientific Supervisor. E-mail: svshabunin@rambler.ru Нестерова Екатерина Юрьевна, младший научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий. E-mail: katya.nesterova.1997@mail.ru Nesterova Ekaterina Yurievna, Junior Researcher at the Laboratory of Metagenomics and Food Biotechnologies.
E-mail: katya.nesterova.1997@mail.ru Гладких Мария Ивановна, младший научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий.
E-mail: mariya221095@yandex.ru Gladkikh Maria Ivanovna, Junior Researcher at the Laboratory of Metagenomics and Food Biotechnologies.
E-mail: mariya221095@yandex.ru Толкачева Анна Александровна, младший научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий. E-mail: anna-biotech@yandex.ru Tolkacheva Anna Alexandrovna, Junior Researcher at the Laboratory of Metagenomics and Food Biotechnologies.
E-mail: anna-biotech@yandex.ru Бондарева Ольга Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории метагеномики и пищевых биотехнологий, e-mail: bond.vrn15@yandex.ru Bondareva Olga Vladimirovna, Junior Researcher at the Laboratory of Metagenomics and Food Biotechnology.
E-mail: bond.vrn15@yandex.ru Корнеева Ольга Сергеевна, доктор биологических наук, заведующий кафедрой биохимии и биотехнологии.
E-mail: korneeva-olgas@yandex.ru Korneeva Olga Sergeevna, Doctor of Biological Sciences, Head of the Department of Biochemistry and Biotechnology.
E-mail: korneeva-olgas@yandex.ru Михайлов Eвгений Владимирович, кандидат ветеринарных наук, заведующий отделом экспериментальной фармакологии. E-mail: voronezh81@rambler.ru Evgeniy Vladimirovich Mikhailov, PhD of Veterinary Sciences, Head of the Department of Experimental Pharmacology. E-mail: voronezh81@rambler.ru
Аннотация. В кишечнике поросят идентифицированы два вида лактобактерий - Lactobacillus plantarum и Lactobacillus salivarius. Изучена устойчивость культур L. plantarum и L. salivarius к желчным кислотам, проведена оценка их антагонистической активности, а также толерантности к экстремально низким и высоким значениям рН. L. salivarius
проявлял большую устойчивость к желчным кислотам и большую антагонистическую активность к условно-патогенным штаммам E. coli, чем L. plantarum. В отношении нормобиоты оба штамма не оказывали антагонистического действия. Экстремально низкие и высокие значения рН не провоцировали гибель L. salivarius и L. plantarum. В целом, L. salivarius обладал большими пробиотическими свойствами in vitro по сравнению с L. plantarum. Summary. Two species of Lactobacillaceae have been identified in the intestines of piglets - Lactobacillus plantarum and Lactobacillus salivarius. The resistance of cultures of L. plantarum and L. salivarius to bile acids was studied, their antagonistic activity was evaluated, as well as tolerance to extremely low and high pH values. L. salivarius showed greater resistance to bile acids and greater antagonistic activity to opportunistic strains E. coli than L. plantarum. In relation to normobiota, both strains did not have an antagonistic effect. Extremely low and high pH values did not provoke the death of L. salivarius and L. plantarum. In general, L. salivarius has greater probiotic properties in vitro compared to L. plantarum.
Введение
Желудочно-кишечный тракт свиней населен множеством различных микроорганизмов. Лактобактерии являются одним из распространенных таксонов бактерий кишечника [2]. Молочнокислые бактерии представляют собой грамположительные, кислотоустойчивые микроорганизмы, имеющие форму палочки или сферы. Отдельные представители данного таксона оказывают непосредственное влияние на физиологические и метаболические характеристики организма-хозяина за счет молочной кислоты, являющейся конечным продуктом ферментации углеводов [3].
К основным положительным свойствам лак-тобактерий относят их способность регулировать активность и состояние микрофлоры кишечника и поддерживать иммунитет, влияя на состояние слизистой оболочки кишечника [6]. Их антимикробная активность осуществляется за счет ингибирования адгезии патогенов к клеткам эпителия кишечника. Безопасность подобных пробиотических препаратов делает возможным потенциальное использование их в качестве альтернативы некоторым антибиотикам [10]. Доказано, что белковые продукты метаболизма L. acidophilus и Saccharomyces boulardii оказывают подавляющее воздействие на Helicobacter pylori и Escherichia coli O157:H7 соответственно [9]. Эти свойства лактобактерий позволяют использовать их в качестве пробиотиков как для лечения и профилактики заболеваний сельскохозяйственных животных, так и в качестве кормовых добавок, на всех этапах выращивания поголовья [4, 5].
Одним из источников лактобактерий с проби-отическими свойствами является кишечник. Целью исследования являлась изоляция, идентификация и исследование пробиотических свойств лактобактерий из кишечника поросят.
Материалы и методы
В исследовании использовали фекалии поросят (5 особей) возрастом 2-5 суток без признаков
каких-либо патологий. Для идентификации лактобактерий 1 грамм свежеизолированных фекалий поросят высевали на среду MRS. Для проверки устойчивости исследуемых штаммов к желчным кислотам проводили культивирование изолированных культур на среде MRS, содержащей 10, 20, 30 и 40 % желчи. Суспензии исследуемых микроорганизмов получали глубинным культивированием при температуре 37 °С, 220 об/мин в течение 24 часов. Устойчивость к желчи определяли по изменению числа колониеобразующих единиц (КОЕ). Количество жизнеспособных клеток бактерий в 1 см3 суспензии определяли методом предельных разведений (от 10-2 до 10-10) при глубинном высеве на агаризованную питательную среду MRS. Подсчет КОЕ проводили после инкубирования их в термостате при температуре 37 °С через 24 часа.
Для оценки антагонистической активности пробиотических штаммов L. plantarum и L. salivarius использовали метод агаровых блоков. Преимуществом данного метода является возможность проверить антагонистическую активность штаммов микроорганизмов и тест-культур, растущих на разных по составу плотных питательных средах. Культуры пробиотиков глубинно засевали на агаризованную среду MRS в чашки Петри для образования сплошного роста (вносили 1 см3 суточного инокулята L. plantarum и L. salivarius). Посевы пробиотических культур инкубировали в течение 120 часов при температуре 37 °С. После стерильным пробочным сверлом (диаметром 6-8 мм) из слоя среды вырезали агаризованные блоки и переносили их на поверхность агаризованной среды, с засеянной тест-культурой.
Оценку толерантности штаммов L. plantarum и L. salivarius к экстремально низким и высоким значениям рН среды определяли по изменению числа колониеобразующих единиц (КОЕ). Для этого исследуемые штаммы культивировали в жидкой питательной среде MRS с рН от 2 до 10 в течение 72 часов при температуре 37 °С. Через каждые 24 часа проводили отбор проб с дальней-
шим высевом на агаризованную питательную среду MRS, для подсчета количества жизнеспособных клеток бактерий в 1 см3 суспензии при помощи метода предельных разведений (от 10-2 до 10-10). Подсчет КОБ проводили после инкубирования их в термостате при температуре 37 °С через 24 часа.
Выделение ДНК из изолированных бактерий осуществляли с помощью набора ПРОБА-ГС («ДНК-технология», Россия). Качественная ПЦР проводилась с использованием 5X ScreenMix-HS реакционной смеси («Eвроген», Россия) с прай-мерами 337F/1100R с последующим проведение электрофореза амплифицированных образцов в 2 %-ном агарозном геле и экстракцией ампли-конов из геля с помощью коммерческого набора Cleanup Standard («Eвроген», Россия). Измерение концентрации очищенных продуктов ПЦР
осуществляли с помощью флуориметра Qubit 2.0 Invitrogen (Life Technologies, Сингапур).
Секвенирование очищенных продуктов ПЦР проводилось на генетическом анализаторе «На-нофор 05» («Синтол», Россия) с использованием BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с помощью инструмента Blast.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Statistica (StatSoft Inc., США). Различия анализировали с помощью дисперсионного анализа Anova.
Результаты и обсуждение
На перовом этапе были изолированы лакто-бактерии из кишечника поросят. Вид изолированных бактерий был идентифицирован с помощью
Таблица 1
Секвенированные последовательности ДНК региона гена 16S rRNA, изолированных из кишечника поросят лактобактерий
№ Полученная нуклеотидная последовательность Идентифицированный вид бактерий Совпадение в системе NCBI GenBank, %
1 TCATCTCCGACCGAGCTGACTGACAGCCATGCACCACCTGTC ACTTTGTCCCCTGAAGGGAAAGCCTAATCTCTTAGGTGGTCA AAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAA TTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGC TTATTGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAA CACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCT AATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGAACCTCAGCGTCAGTTA CAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATAT CTACGCATTTCACCGCTACACATGGGAGTTCCACTCTCCTCTT CTGCACTCAAGTCTTCCAGTTTCCAATGCACTACTCCGGTTAA GCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAGACCGCCTGCGTTC CCTTTACGCCCAATAAATCCGGACTACGCTTGCCACCTACGTA TTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTGCTGGTT AGATACCGTCATCGAATGAACAGTTACTCTCACTCGTGTTCTT CTCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAGACCTTCTTCACTCA CGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTC CCTACTGCAGCTCCCC Lactobacillus salivarius 99,06
2 GACCGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCC CCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAA GACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACAT GCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTT CAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGT TAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGC ATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT TGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAG ACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCAT TTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCA AGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGG CTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACG CCCAATAAATCCGGACTAACGCTTGGCACCTACGTATTACCGC GGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGGCTTTCTGGTTAAATAC CGTCAATACCTGAACAGGTACTCTCAGATATGGTCTTCTTTAA CAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGG CGTTGCT Lactobacillus plantarum 99,27
Таблица 2
Оценка устойчивости L. plantarum и L. salivarius по отношению к различным концентрациям
желчных кислот (±SD)
Концентрация желчных кислот, % L. plantarum, КОЕ L. salivarius, КОЕ
10 3,0±0,4*105 ## 4,7±0,9*106
20 4,5±0,4*105 ## 3,9±0,4*106
30 1,4±0,2*105 ## 6,5±0,7*105 #
40 1,7±0,3*105 ## 2,5±0,3*105 #
Контроль 2,0±0,4*107 5,0±0,7*106
Примечание: # - различия с контролем статистически достоверны (р<0,01); ## - различия с контролем статистически достоверны (р<0,001).
секвенирования региона гена 16S rRNA. Всего было идентифицировано два вида лактобакте-рий - L. salivarius и L. р1аШагит (таблица 1).
Вид бактерий Ь. р1аШагит обнаружен и в кишечнике животных и человека. Он обладает способностью ферментировать большое разнообразие растительных углеводов и проявляет устойчивость к солям желчи и низкому рН, что потенциально позволяет использовать его в качестве пробиотика [11]. Было установлено, что даже единократное введение некоторых штаммов Ь. р1аМатт оказывает положительный эффект на состояние ЖКТ поросят во время отъема [1].
Возможность роста в анаэробных условиях, при оптимальном значении рН от 5,5 до 6,5 позволяет использовать Ь. salivarius в качестве составляющей пробиотического продукта [7]. Помимо способности ингибировать патогенные организмы, Ь. salivarius увеличивает количество иммунокомпетентных клеток и усиливает экспрессию гена ^-6 в кишечнике свиней [12]. В исследовании на поросятах-сосунах было продемонстрировано улучшение общего самочувствия животных (снижение диареи, улучшение морфологии эпителия кишечника) при перораль-ном введении культур Ь. salivarius [8].
В результате проверки устойчивости Ь. р1ап-tarum и Ь. salivarius к желчным кислотам было установлено, что при высеве суспензии Ь. р1ап-tarum с содержанием различных концентраций
желчи через 24 ч наблюдался рост клеток, однако титр бактерий относительно контроля снизился во всех образцах (таблица 2).
L. salivarius показал большую устойчивость к желчным кислотам, при концентрации желчи в среде 10 % и 20 % титр бактерий не изменился, а при 30 % и 40 % желчи титр бактерий относительно контроля уменьшился.
Для оценки антагонистической активности пробиотических штаммов L. plantarum и L. salivarius в качестве тест-культуры использовали условно-патогенные бактерии (Escherichia coli top 10) и нормобиоты (Escherichia coli 12). Суточный инокулят тест-культуры глубинно засевали на агаризованную среду LB. Если тест-культуры чувствительны к антимикробному веществу, продуцируемому пробиотиками в составе агарового блока, то после инкубации вокруг блока формируется зона задержки или отсутствия роста. По диаметру зоны ингибирования тест-культуры можно судить об антагонистической способности L. plantarum и L. salivarius. Оценку антагонистической активности проводили через 24 часа инкубирования при температуре 37 °С (рисунок 1).
L. salivarius проявлял большую антагонистическую активность по отношению к условно-патогенным штаммам, чем L. plantarum. По отношению к представителям нормобиоты оба пробиотических штамма не оказывали антагонистического действия.
Таблица 3
Оценка толерантности L. plantarum и L. salivarus к рН (±SD)
рН Lactobacillus plantarum Lactobacillus salivarus
24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч
2 0,5±0,2*105 1,7±0,3*105 1,0±0,2*105 4,0±0,7*104 1,2±0,2*106 3,0±0,6*106
4 1,1±0,3*106 1,3±0,3*107 2,1±0,3*105 1,3±0,2*104 1,2±0,1*107 1,7±0,3*106
6 1,1±0,2*106 2,0±0,5*107 1,9±0,4*105 2,1±0,4*104 6,0±0,7*107 3,2±0,5*106
8 3,8±0,4*108 1,4±0,1*107 2,0±0,4*107 1,7±0,3*104 8,0±0,8*107 0,9±0,1*106
10 5,8±0,6*107 1,0±0,1*108 3,0±0,5*107 3,4±0,5*104 1,6±0,2*107 1,1±0,2*106
■ Lactobacillus plantarum и Lactobacillus salivarus
E.COÜ12
Рис. 1. Оценка антагонистической активности лактобак-терий относительно различных штаммов E. coli; * - различия в замедлении роста бактерий по сравнению с контролем статистически достоверны (p<0,01)
По результатам оценки толерантности проби-отических штаммов L. plantarum и L. salivarius к рН среды было установлено, что L. plantarum растет в более широком диапазоне рН (таблица 3).
Установлено, что изолированные штаммы бактерий способны выживать в кислой среде при рН 2. L. salivarius менее устойчив к низким значениям рН среды при кратковременной инкубации, но процент выживаемости клеток выше относительно L. plantarum при длительном культивировании.
Заключение
В кишечнике поросят идентифицировано два вида лактобактерий - L. salivarius и L. plantarum. Установлено, что L. salivarius проявлял большую устойчивость к желчным кислотам, чем L. plantarum. Вместе с тем L. salivarius проявлял большую антагонистическую активность по отношению к условно-патогенным штаммам, чем L. plantarum. Что касается отношения к нормо-биоте, оба пробиотических штамма не оказывали антагонистического действия. Экстремально низкие и высокие значения рН не провоцировали гибель L. salivarius и L. plantarum. Таким образом, L. salivarius обладал большими проби-отическими свойствами in vitro по сравнению с
L. plantarum. Необходимы дальнейшие исследования in vivo изолированных штаммов лактобак-терий.
Список литературы
1. De Vries M. C. Lactobacillus plantarum-survival, functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract / M. C. de Vries, E. E. Vaughan, M. Kleerebezem, W. M. de Vos // Int. Dairy J. 2006. V. 16, № 9. P. 1018-1028.
2. Kant R. Genome sequence of Lactobacillus amylovorus GRL1118, isolated from pig ileum / R. Kant, L. Paulin, E. Alatalo et al. // J. Bacteriol. 2011. V. 193, № 12. P. 3147-8.
3. Meng Q. W. Influence of probiotics in different energy and nutrient density diets on growth performance, nutrient digestibility, meat quality, and blood characteristics in growing-finishing pigs / Q. W. Meng, L. Yan, X. Ao et al. // J. Anim. Sci. 2010. V. 88, № 10. P. 3320-6.
4. O'Toole P. W. Probiotic bacteria influence the composition and function of the intestinal microbiota / P. W. O'Toole, J. C. Coo-ney // Interdiscip Perspect Infect Dis. 2008. V. 2008. P. 175285.
5. Pereira W. A. Beneficial effects of probiotics on the pig production cycle: An overview of clinical impacts and performance / W. A. Pereira, S. M. Franco, I. L. Reis et al. // Vet. Microbiol. 2022. V 269. P. 109431.
6. Rauch M. Probiotic manipulation of the gastrointestinal microbiota / M. Rauch, S. V Lynch // Gut Microbes. 2010. V 1, № 5. P. 335-338.
7. Salih N. K. M. Maximization of growth and storage of locally isolated Lactobacillus salivarius subsp. salivarius with high stability and functionality / N. K. M. Salih, A. Hutari, W. S. Gaseem, W. M. W. Yusoff// In 25th Southern Biomedical Engineering Conference (15-17 May 2009). Miami, Florida, USA, 2009. P. 175-178.
8. Sayan H. Effect of Lactobacillus salivarius on growth performance, diarrhea incidence, fecal bacterial population and intestinal morphology of suckling pigs challenged with F4+ enterotoxigenic Escherichia coli / H. Sayan, P. Assavacheep, K. Angkanaporn, A. Assavacheep // Asian-Australas J Anim Sci. 2018. V. 31, № 8. P. 1308-1314.
9. Scharek L. Impact of the probiotic bacteria Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) and Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112 on the development of serum IgG and faecal IgA of sows and their piglets / L. Scharek, J. Guth, M. Filter, M.F. Schmidt // Arch Anim Nutr. 2007. V 61, № 4. P. 223-34.
10. Suez J. The pros, cons, and many unknowns of probiotics / J. Suez, N. Zmora, E. Segal, E. Elinav // Nat Med. 2019. V 25, № 5. P. 716-729.
11. Suo C. Effects of Lactobacillus plantarum ZJ316 on pig growth and pork quality / C. Suo, Y Yin, X. Wang et al. // BMC Vet Res. 2012. V 8. P. 89.
12. Zhang J. Modulatory effects of Lactobacillus salivarius on intestinal mucosal immunity of piglets / J. Zhang, J. Deng, Z. Wang et al. // Curr Microbiol. 2011. V 62, № 5. P. 1623-31.
| Подписной индекс журнала |
| «Актуальные вопросы ветеринарной биологии»: |
| Агентство «Роспечать» - 33184 |
^ммммммммммммммммммммммммммммммммммм
