CC BY
57
УДК 615.322: 615.071: 615.074
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ В НАСТОЙКЕ И СИРОПЕ ПЛОДОВ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА ОБЫКНОВЕННОГО
IDENTIFICATION AND QUANTIFICATION OF FLAVONOIDS IN TINCTURE AND SYRUP OF COMMON JUNIPER FRUITS
Т.А. Олейникова 1, Э.Ф. Степанова 1, О.О. Новиков 2, Д.И. Писарев 2,
М.М. Евсеева 3
T.A. Oleynikova 1, E.F. Stepanova 1, О.О. Novikov 2, D.I. Pisarev 2, M.M. Evseeva 3
1) Пятигорский медико-фармацевтический институт — филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава, Россия, 357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, д. 11
2 Белгородский государственный национальный исследовательский университет, Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д.85
3) Международный медицинский центр «СИНАИ», Россия, 119180, г. Москва, ул. Б. Полянка, д. 54
1) Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of GBOU VPO VolgGMU Ministry of Health,
Russia, 357532, Pyatigorsk, Kalinina Ave., 11
2) Belgorod National Research University, Russia, 308015, Belgorod, Pobedy St., 85
3) International Medical Center «SINAY», Russia, 119180, Moscow, B. Polyanka St., 54
E-mail: [email protected]
Аннотация. Целью исследования явилось изучение состава и количественное определение флавоноидов в настойке и сиропе плодов можжевельника обыкновенного Juniperus communis L. Для осуществления поставленной цели использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) в градиентном режиме элюирования. Детектирование осуществляли при длине волны (X): 340 нм. Количественное определение флавоноидов проводили методом абсолютной градуировки. В качестве стандартного образца использовали скутелляреин-7-О-глюкозид. В результате исследования выявлено, что доминирующими группами флавоноидов являются бифлавоноиды (50%), скутелляреин-7-О-глюкозид (22%) и гликозиды апигенина (14%).
Resume. The purpose of the research was to study the composition and quantification of flavonoids in tincture and syrup of Common Juniper fruits - Juniperus communis L. High performance liquid chromatography (HPLC) in a gradient elution mode has been used to achieve this goal. Detection was performed at a wavelength (X): 340 nm. Quantification of flavonoids was determined by absolute calibration. Scutellarein-7-O-glucoside was used as a standard sample. The study revealed that the dominant groups of flavonoids are biflavonoids (50%), scutellarein-7-O-glucoside (22%) and apigenin glycosides (14%).
Ключевые слова: Juniperus communis L. настойка и сироп плодов можжевельника обыкновенного, экстракция, высокоэффективная жидкостная хроматография, флавоноиды
Keywords: Juniperus communis L. tincture and syrup of Common Juniper fruits, extraction, high performance liquid chromatography, flavonoids.
Введение
При лечении, реабилитации и, особенно, для профилактики различных заболеваний практикующие врачи, да и сами пациенты, все чаще предпочитают пользоваться лекарствами растительного происхождения, ведь никто не будет оспаривать тот факт, что для здоровья необходимы натуральные пищевые продукты. Это справедливо и в отношении лекарств [Евсеева, 2008]. Достоинством растительных лекарственных средств является возможность их длительного применения в домашних условиях и доступность для населения, что особенно важно для восстановительного лечения и реабилитации различных заболеваний хронической этиологии. Лекарственные травы -это готовые лечебные комплексы, чьи компоненты находятся в сбалансированном состоянии. Одно и то же лекарственное растение может с успехом использоваться при самых различных заболеваниях, что, возможно, обусловлено их многокомпонентным составом. Так, например, плоды можжевельника обыкновенного издавна применяют в народной медицине при женских болезнях, простудных заболеваниях, туберкулезе, ревматизме, заболеваниях печени и почек и многих других
[Евсеева, 2008]. Долгое время лечебный эффект можжевельника связывали лишь с действием эфирных масел, однако, можно предположить, что многогранное действие этого целебного растения связано с наличием других биологически активных веществ. J. communis - это эфиромаслич-ное растение, фармакологический эффект которого обусловлен, в основном, терпенами [Писарев, 2007, Соколов, 2010]. Известно также, что в суммарном фармакологическом эффекте участвует полифенольный комплекс [Писарев, 2010]. Уточнение данных о химическом составе таких используемых препаратов как настойка и сироп плодов можжевельника, позволит шире использовать их в этиотропной медицине.
Цель
Целью нашего исследования явилось изучение состава и количественное определение флавоноидов в настойке и сиропе плодов можжевельника обыкновенного Juniperus communis L.
Материал и методы исследования
Объектом исследования служили настойка и сироп плодов можжевельника обыкновенного J. Communis L.
Настойку плодов можжевельника обыкновенного получали методом ремацерации в соотношении 1:5 с использованием 40%-ного спирта этилового в качестве экстрагента. Для этого рассчитанное количество экстрагента делили на две части 3:2. Настаивание сырья проводили 24 с первой порцией, извлечение сливали, 24 ч со второй порцией экстрагента, извлечение сливали, отжимали и объединяли. Полученный продукт представлял собой коричневую жидкость, с легкой опалесценцией, запах - ароматный, вкус пряный, сладко-горький, жгучий.
Сироп плодов можжевельника обыкновенного получали по традиционной схеме изготовления сиропов в соотношении 20 г настойки сиропа и 80 г сиропа сахарозы.
Для осуществления поставленной цели использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) в градиентном режиме элюирования. Исследования проводили на хрома-тографическом приборе фирмы «Agilent Technologies 1200 Infinity» (США) по оригинальной методике, разработанной на кафедре химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета [Писарев, 2013].
Регистрацию и обработку спектральных данных проводили с использованием программного обеспечения «Agilent Chem Station».
При жидкостной хроматографии для приготовления подвижных фаз применяли следующие растворители: воду сверхчистую, спирт этиловый (по ГОСТ Р 51652), кислоту муравьиную (квалификация х.ч. по ГОСТ 61).
Эффективность колонки определяли вычислением числа теоретических тарелок (N) по формуле:
Г / v
N = 5.545 х -г-
\^0-5 J
где t - время удерживания определяемого вещества, мм; Д0.5 - ширина на половине высоты пика, мм.
Коэффициент разделения пиков Rs вычисляли по формуле:
А).5(1) + М).5(2)
где Д1 - расстояние между вершинами двух соседних пиков, мм; Ц0.5М, Д0.5М - ширина на половине высоты пиков двух компонентов мм. Причем, согласно Европейской Фармакопее (ЕФ) [European Pharmacopoeia, 2014], коэффициент разделения Rs, должен быть не менее 1.5.
Форму хроматографического пика определяли путём расчёта коэффициента асимметрии пика (Т/) по формуле:
Y — М)-05
7 = 2 х f '
где Д0.05 - ширина пика на высоте 5% от базовой линии (мм); f - расстояние от начала пика на высоте 5% от базовой линии до перпендикуляра, проведенного из его вершины (мм).
За оптимальную величину коэффициента асимметрии Т/ принимали показатель - менее 2.
Исследовали настойку и сироп плодов можжевельника, разделяя их в следующих условиях. Подвижная фаза: 1% водный раствор кислоты муравьиной (А) - 95% спирт этиловый (Б) в градиентном режиме элюирования; колонка: Ascentis express C18 2.7 дмх100 ммх4.6 мм; скорость подвижной фазы - 0.5 мл/мин; температура колонки +350С; объём вводимой пробы 5 д1.
Состав подвижной фазы программировали в условиях, указанных в представленной таблице (табл. 1).
Таблица 1 Table. 1
Условия градиентного элюирования флавоноидов плодов J. communis L. Terms of gradient elution flavonoids J. communis L. fruits
Время, мин А, % Б, %
0 90 10
10 80 20
20 70 30
30 50 50
40 10 90
Детектирование осуществляли при длине волны (X): 340 нм.
По данным Д.И. Писарева и соавторов [Писарев, Новиков и др., 2016], для большинства флавоноидов существует общая полоса поглощения, по которой можно оценить их содержание на хроматограмме, она лежит в максимуме поглощения при длине волны (X) 340 нм, поэтому именно эту величину мы использовали при детектировании.
Идентификацию компонентов осуществляли по совпадению времён удерживания анализируемых веществ со стандартным образцом (СО) зафиксированных в аналогичных условиях эксперимента и по результатам диодно-матричного детектирования.
Относительное содержание флавоноидов определяли как отношение площади хроматогра-фического пика и суммы площадей пиков всех идентифицированных флавоноидов по формуле:
^ х 100 XI -,
Е 8
где Si - среднее значение площади пика компонента на хроматограммах суммы; ^ - среднее значение суммы всех площадей пиков на хроматограммах.
Результаты и их обсуждение
Хроматограмма спиртового извлечения из плодов J. communis L. представлена на рисунке 1.
DAD1 E, Sg=340,4 Ref=off (2016-01-18JJNIPER5.D)
irAU " g
100- 3
80-
Рис. 1. Хроматограмма настойки плодов можжевельника обыкновенного J. communis L. (детекция диодно-матричная при Х=340 нм)
Fig. 1. Chromatogram of tincture of the J. communis L fruits. (diode array detection at Х=340 nm)
Эффективность хроматографической системы оценивали по критериям, результаты расчёта которых приведены в таблице 2.
60
40
20
0
0
0
15
20
25
30
35
40
45
Таблица 2 Table. 2
Показатели пригодности хроматографической системы для определения флавоноидов в настойке плодов можжевельника обыкновенного J. communis L. Indicators of chromatographic system suitability for determination of flavonoids in tincture of J.
communis L. fruits
tR S N Rs Tf Wb
5.682 1282.0 24946 >1.5 0.73 0.1439
14-345 318.5 234468 >1.5 0.757 0.1185
18.143 815.2 3013252 >1.5 0.767 0.1322
17.406 120.3 231516 >1.5 1.106 0.1447
21.304 366.5 498457 >1.5 0.798 0.1207
19.930 169.9 282457 >1.5 1.209 0.15
24.897 46.1 611048 >1.5 1.021 0.1274
23.697 98.0 404701 >1.5 0.658 0.149
27.421 127.5 943840 >1.5 0.752 0.1129
Примечание: tR - абсолютное время удерживания, S - площадь пика, N - число теоретических тарелок, Rs - коэффициент разделения пиков, Tf - коэффициент асимметрии, Wb - ширина пика на базовой линии
По результатам расчёта критериев пригодности N>5000, Tf<2, Rs>i.5, что свидетельствует об адекватности использованной хроматографической системы и она может быть признана абсолютно пригодной для определения флавоноидов в настойке плодов можжевельника J. communis L. Компонентный состав флавоноидов представлен нами в таблице 3.
Таблица 3 Table. 3
Компонентный состав полифенолов в настойке плодов можжевельника
обыкновенного J. communis L. Component composition of polyphenols in tincture of J. communis L. fruits
Время удерживания, мин УФ-профиль идентифицированных компонентов Идентифицированные компоненты Суммарная площадь пиков компонентов на хроматограмме, £S
14.345, 18.143 80 70 60 90 40 30 20 230 240 2E02E030D 320 340 3E03ED гг Бифлавоноиды (амен-тофлавон и купрессу-сфлавон) 1133.67
21.304 •CADI, 21.748 (117 mAU, - ) №21.115 822915 cfJlNFEFRDD 220 240 260 280 300320340 360 380 гг 7-О-глюкозид скутел-ляреина 486.0
19.930, 24.897 20^ 7Б-15^ 26^ 10^ 76^ 51 25- MD, 20348 (18.E nAU, - ) №=201X8 &206E6 cfJLNFHFQD 22321023203:0 323 3 0 383 383 Гликозиды 6-оксилютеолина 214.0
23.697 ,0 220 240 260:80 300 320 340:60380 гг Кверцетин 92.0
Окончание табл. 3
120 *DADI, 34.148 (124 nAI, - ) Re=34015 &3471 cfJlNFEER0D
27.421, 27.808, 30.191 100 80 30 40 20 Л''1- \ Гликозиды апигенина 314.5
220240200280300320340 :00 :80 m
Процентное содержание различных флавоноидов в настойке плодов можжевельника обыкновенного J. communis L. представлено на столбиковой диаграмме (рис. 2).
Рис. 2. Содержание различных групп флавоноидов в настойке плодов можжевельника J. communis L., согласно их площадям пиков на хроматограмме (%) Fig. 2. The content of the various groups of flavonoids in tincture of J. communis L. fruits, according to their peak
areas in the chromatogram (%)
Из представленной диаграммы видно, что доминирующими группами флавоноидов являются бифлавоноиды (5o%), скутелляреин-7-О-глюкозид (22%) и гликозиды апигенина (l4%).
Количественное определение флавоноидов проводили методом абсолютной градуировки. В качестве СО использовали скутелляреин-7-О-глюкозид.
Предварительно настойку плодов можжевельника обыкновенного массой l.o г помещали в мерную колбу вместимостью loo мл, растворяли в 2o мл 95% спирта этилового, доводили объём раствора этим же растворителем до метки и перемешивали. Сироп плодов можжевельника массой 4,o г помещали в мерную колбу вместимостью loo мл, растворяли в 2o мл 95% спирта этилового, доводили объём раствора этим же растворителем до метки и перемешивали. Таким образом, было приготовлено 7 отдельно взятых образцов настойки и сиропа.
Примечание:
1. Приготовление раствора СО. 20 мг СО помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли l0 мл 95% спирта этилового, доводили объём раствора этим же растворителем до метки и перемешивали.
2. Приготовление подвижной фазы А. lo мл кислоты муравьиной (хч) помещали в мерную колбу вместимостью looo мл, доводили объём раствора водой сверхочищенной (HPLC) до метки и перемешивали.
3. Приготовление подвижной фазы Б. Для хроматографии использовали 95% спирт этиловый.
Для построения градуировочного графика из полученного раствора готовили серию калибровочных растворов. Для этого в 6 мерных колб вместимостью 25 мл пипеткой переносили раствор А в объёмах: 2.o; 4.o; 6.o; 8.o; lo.o; l2.o мл, содержимое колб тщательно перемешивали и доводили спиртом этиловым 95%-ным до метки. Полученные растворы хроматографировали в вышеуказанных условиях и определяли площади их пиков.
Результаты хроматографирования представляли в виде калибровочного графика (Рис. 3).
И
й
X =
к л
ч
св *
О
ч И
3000 2500 2000 1500 1000 500
y=143668Х R2 = 0.9997
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 Концентрация стандатрного образца, С%
Рис. 3. Калибровочный график зависимости концентрации скутелляреин-7-О-глюкозида от площади пика Fig. 3. Calibration graph of scutellarein -7-O-glucoside concentration against peak area
Далее анализируемые образцы хроматографировали и у определяемых компонентов измеряли площади пика. Далее на основании градуировочного графика рассчитывали их количество по формуле:
x =
Сст х W х 100
m х (100 - B)
где Сст - количество флавоноида, найденного по калибровочному графику (%); m - масса навески образца; W - разведение образца; В - потеря в массе при высушивании образца.
Результаты расчёта содержания скутелляреин-7-О-глюкозида в настойке плодов можжевельника обыкновенного представлены в таблице 4.
Таблица 4 Table. 4
Результаты количественного определения скутелляреин-7-О-глюкозида в настойке плодов
можжевельника обыкновенного The results of the quantitative determination scutellarein -7-O-glucoside in the tincture of Common
Juniper fruits
0
№ п/п Содержание скутелляреин-7-О-глюкозида (Х), % X S AX e, %
1. 0.0053
2. 0.0052
3. 0.0052
4. 0.0053 0.00525 0.000049 0.000126 2.4
5. 0.0052
6. 0.0053
7. 0.0053
Результаты расчёта содержания скутелляреин-7-О-глюкозида в сиропе приведены в таблице 5.
Таблица 5 Table. 5
Результаты количественного определения скутелляреин-7-О-глюкозида в сиропе плодов
можжевельника обыкновенного The results of the quantitative determination scutellarein -7-O-glucoside in the syrup of Common
Juniper fruits
№ п/п Содержание скутелляреин-7-О-глюкозида (Х), % X S AX e, %
1. 0.00132
2. 0.00131
3. 0.00134
4. 0.00136 0.00133 0.0000187 0.000048 3.6
5. 0.00134
6. 0.00132
7. 0.00135
Из результатов таблицы видно, что ошибка единичного определения во всех случаях не превышает 5%, при относительной погрешности Р 95%, что находится в диапазоне, рекомендуемом ГФ.
Заключение
Таким образом, использование хроматографической системы позволило с высокой достоверностью идентифицировать и определить количественное содержание флавоноидов в настойке и сиропе плодов можжевельника обыкновенного. Установлено, что большую часть (50%) составляют бифлавоноиды, 22% приходится на 7-0-гликозиды скутелляреина, 14% - на гликозиды апигенина и лишь 9.5% на гликозиды 6-оксилютеолина и 4.1% на кверцетин.
Список литературы References
Евсеева М.М. 2008. Фитотерапия в гинекологии. В кн.: Гинекология. Руководство для врачей. Под ред. В.Н. Серова, Е.Ф. Кира. М., Литтерра: 786-792.
Evseeva M.M. 2008. Fitoterapiya v ginekologii [Phytotherapy in gynecology]:. V kn.: Ginekologiya. Rukovodstvo dlya vrachey. Pod red. V.N. Serova, E.F. Kira. M., Litterra: 786-792. (in Russian)
Писарев Д.И. 2007. Обзор современного состояния исследований в области систематики, химии и фармакологии рода Juniperus L. Современные проблемы фитодизайна: материалы международной научно-практической конференции (Белгород, 28-31 мая 2007 г.). Белгород, Изд-во БелГУ. 296-304.
Pisarev D.I. 2007. Obzor sovremennogo sostoyaniya issledovaniy v oblasti sistematiki, khimii i farmakologii roda Juniperus L [Overview of the current state in the field of taxonomy, chemistry and pharmacology kind Juniperus L. research]. Sovremennye problemy fitodizayna: materialy mezhdunarodnoy nauchno-prakticheskoy konferentsii (Belgorod, 28-31 maya 2007 g.). Belgorod, Izd-vo BelGU. 296-304. (in Russian)
Писарев Д.И., Новиков О.О., Новикова М.Ю., Жилякова Е.Т. 2010. Изучение флавоноидного состава шишкоягод можжевельника длиннохвойного. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 150 (12): 657-660.
Pisarev D.I., Novikov O.O., Novikova M.Yu., Zhilyakova E.T. 2010. Izuchenie flavonoidnogo sostava shishkoyagod mozhzhevel'nika dlinnokhvoynogo [The study of the flavonoid composition fruit juniper oblonga]. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 150 (12): 657-660. (in Russian)
Писарев Д.И. 2013. Методологические основы комплексного исследования полифенольных веществ и тест-соединений природного и синтетического происхождения. Автореф. дис....докт. фарм. наук. Курск, 37 с.
Pisarev D.I. 2013. Metodologicheskie osnovy kompleksnogo issledovaniya polifenol'nykh veshchestv i test-soedineniy prirodnogo i sinteticheskogo proiskhozhdeniya [Methodological basis of a comprehensive study of polyphenolic substances and test-compounds of natural and synthetic origin ]. Avtoref. dis....dokt. farm. nauk. Kursk, 37 s. (in Russian)
Писарев Д.И., Новиков О.О., Корниенко И.В., Малютина А.Ю., Жилякова Е.Т., Трифонов В.В., Новикова М.Ю., Титарева Л.В., Шестопалова Н.Н., Гурьев И.В. 2016. Исследование экстрагирующей способности различных концентраций спирта этилового для изолирования комплекса флавоноидов из шишкоягод Juniperus communis L. в рамках научного направления «Фармацевтический ремейк». Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. 19 (240^136-147.
Pisarev D.I., Novikov O.O., Kornienko I.V., Malyutina A.Yu., Zhilyakova E.T., Trifonov V.V., Novikova M.Yu., Titareva L.V., Shestopalova N.N., Gur'ev I.V. 2016. Issledovanie ekstragiruyushchey sposobnosti razlichnykh kontsentratsiy spirta etilovogo dlya izolirovaniya kompleksa flavonoidov iz shishkoyagod Juniperus communis L. v ramkakh nauchnogo napravleniya «Farmatsevticheskiy remeyk» [Research extracting ability of various concentrations of ethyl alcohol to isolate a complex of flavonoids from fruits Juniperus communis L. under the scientific direction "pharmaceutical remake" ]. Nauchnye vedomosti BelGU. Seriya: Meditsina. Farmatsiya. 19 (240):136-147. (in Russian)
Соколов С.Я. 2000. Фитотерапия и фитофармакология. М., Мед. информ. Агентство. 976. Sokolov S.Ya. 2000. Fitoterapiya i fitofarmakologiya [Phytotherapy and phytopharmacology]. M., Med. inform. Agentstvo. 976. (in Russian)
European Pharmacopoeia [Text]: 2 vol. - 8th ed. 2014. European Directorate for Quality of Medicines and Health care. Strasbourg : Council of Europe. cop.
