CC BY
14Вестник фармации №3 (37) 2007
ФАРМАКОГНОЗИЯ И БОТАНИКА
А.А. Карусевич, Д.В. Моисеев, Г.Н. Бузук
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ 20-ГИДРОКСИЭКДИЗОНА В ЛИСТЬЯХ ЛЕВЗЕИ САФЛОРОВИДНОЙ МЕТОДОМ ВЭЖХ
Витебский государственный медицинский университет
Разработана методика определения 20-гидроксиэкдизона в водно-спиртовом экстракте листьев левзеи сафлоровидной (Rhaponticum carthamoides) методом ВЭЖХ. Определение фитоэкдистероида проводится на обращенно-фазовой колонке (Waters Spherisorb ODS-2 250x4,6 мм, 5 мкм) с изократическим режимом элюирования ПФ (вода и ацетонитрил 83:17 по объему). Градуировочный график
зависимости площади пика вещества от содержания в пробе линеен при концентрациях 1-500 мкг/мл.
ВВЕДЕНИЕ
20-гидроксиэкдизон (он же в-экдизон; в дальнейшем 20Е) - соединение из комплекса полигидроксилированных стеринов, получивших название «экдисте-роиды» [1,2].
Экдистероиды являются весьма распространенными стероидными соединениями (рис. 1). Они выявлены более чем у 90% членистоногих и беспозвоночных. В растительном мире они найдены более чем в 80 семействах [3]. Основное содержание при этом приходится на а-экдизон и 20Е. Остальные экдистероиды принято называть минорными.
ОН
Рис. 1 - Общая структурная формула экдистероидов
К настоящему времени установлены структурные формулы примерно 150 экдистероидов, продуцируемых только лишь растительными организмами (хотя, учитывая комбинации индивидуальных модифи-
каций, теоретически можно ожидать более 1000 различных модификаций [4,5]).
Примеры самых распространенных из них приведены в табл.1.
Таблица - Заместители в наиболее распространенных экдистероидах
Наименование Ri R2 R3 R4
а-экдизон -H -OH -H -H
в-экдизон -OH -OH -H -H
Инокостерон -OH -H -OH -H
Макистерон А -OH -H -OH 3 H3 о 1
Понастерон А -OH -H -H -H
Для количественного определения 20Е применяется как обращено-фазовый
[8.9], так и нормально-фазовый вариант ВЭЖХ [5,10]. Описанные в литературе методики количественного определения 20Е относятся либо к определению его в корнях левзеи, либо в других видах растений
[9.10]. Единственным источником, определенно указывающим на содержание 20Е в листьях левзеи, остается Вересковский
В.В. [3], хотя суть метода количественного определения там не упоминается.
Целью настоящего исследования являлся подбор оптимальных условий хроматографического определения и разработка методики, позволяющей идентифицировать и определять 20Е в листьях левзеи методом ВЭЖХ с изократическим
элюированием. Мы посчитали также целесообразным снять спектр поглощения 20Е для данных условий хроматографирования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнялась на жидкостном хроматографе фирмы Agilent HP 1100, в комплекте с системой подачи и дегазации на четыре растворителя G1311A, диодноматричным детектором G1315B, термостатом колонок G1316A, устройством для автоматического ввода образцов (автосэмплер) G1313A. Сбор данных, обработка хроматограмм и спектров поглощения проводилась с помощью программы Agilent ChemStation for LC 3D.
листьев левзеи (внизу)
Разделение проводилось на хроматографической колонке Waters Spherisorb ODS-2 250x4,6 мм, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза: вода и ацетонитрил 83:17 (по объему), объем пробы 10 мкл. Разделение проводилось при температуре колонки 30°С, давлении в системе около 120 bar. Детектирование осуществляли при длине волны 242 нм, спектр поглощения в области максимума пика 20Е записывали с по-
мощью фотодиодноматричного детектора Diode-array detector Agilent HP 1100 G1315B и программы Agilent ChemStation for LC 3D. В качестве стандарта использовали образец 20Е (Sigma-Aldrich). Вещество считали идентифицированным при совпадении времени удерживания (рис. 2) и спектра поглощения (рис. 3) со стандартом.
Рис.3 - Спектр поглощения спиртового раствора 20Е в ультрафиолетовой области.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оптимизация условий определения При воспроизведении методики определения 20Е методом ВЭЖХ, описанной в литературе [8], оказалось, что коэффициент удерживания данного соединения на хроматографической колонке при описанных в методике параметрах системы составляет около 0,03, и, следовательно, вещество элюируется практически в мертвом объеме. Поэтому нами экспериментально
были подобраны условия
хроматографического определения 20Е, при которых при наименьших затратах рабочего времени достигается приемлемое разрешение пиков 20Е и других веществ на хроматограмме. В табл.2 представлено влияние концентрации органического
модификатора подвижной фазы (ПФ) на коэффициент удерживания 20Е, который рассчитывали по формуле: к’^я-^Лю, где - время удерживания вещества, а ^ -мертвое время (при скорости подачи ПФ 0,5 мл/мин составляло 4,00 мин).
Таблица 2 - Зависимость коэффициента емкости колонки от концентрации ацетонитрила в _____________________________ ПФ (по объему).____________________________________
Ацетонитрил, % 60 40 30 20 17 15
Коэффициент удерживания, k’ 0,03 0,42 0,53 2,37 5,32 9,70
Для ускорения проведения анализов пиков веществ и пика 20Е представлены в
скорость подачи ПФ увеличили с 0,5 табл.3.
мл/мин до 1 мл/мин. Данные о разделении
Таблица 3 - Основные хроматографические параметры разделения 20Е
Эффективность разделения (N) Коэффициент асимметрии пика (As) Селективность разделения (а) Коэффициент разрешения пиков (RS) Коэффициент удерживания (k’)
~ 10500 0,7 > 1,3 > 2,0 5,32
Расчет количественного содержания 20е. Градуировочный график строили по зависимости площади пика 20Е на хроматограмме от содержания вещества во вводимой пробе. Уравнение прямолинейной зависимости (при концентрациях 20Е от 1 до 500 мкг/мл) имеет вид 8=4,511*0, Я2=0,9986.
Пробоподготовка. В литературе описаны различные методики подготовки проб, содержащих 20Е, для высокоэффективной жидкостной хроматографии [8,5,9,10,11]. Чаще всего это экстракция водно-метанольными или водно-этанольными растворами с последующей очисткой полученного экстракта либо при помощи малополярных органических растворителей [8,11], либо при помощи концентрирующих патронов с сорбентом С16
[9,6,5,10]. В качестве малополярных растворителей чаще всего используется хлороформ.
При разработке методики подготовки пробы для хроматографирования мы исходили из предположения, что любая дополнительная операция с образцами влечет за собой потерю части 20Е. Поэтому пробы получали по разработанной нами методике [12] без дополнительных стадий очистки.
МЕТОДИКА
Около 10 г сухих листьев (точная навеска) левзеи сафлоровидной помещали в коническую колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 100 мл 70% этанола и настаивали при периодическом перемешивании в течение суток. Затем содержимое колбы отфильтровывали через хлопчатобумажную ткань в коническую колбу вместимостью 200 мл, фильтровали через фильтр с
диаметром пор 0,45 мкм и инжектировали в хроматограф.
Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО): около
0,0050 г (точная навеска) 20-
гидроксиэкзидона (производства (81§ша-АЫпсЬ) взвешивали в мерной колбе на 50,0 мл, затем доводили до метки этанолом, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и инжектировали в хроматограф.
Для анализируемого раствора и РСО получали не менее 5 хроматограмм, площадь пиков и другие параметры рассчитывали как среднее значение пяти определений.
Концентрацию 20Е в левзеи сафлоровидной вычисляли по следующей формуле:
С,% = 5иссл хМстанд х 100%,
^станд ХМиссл
где
С,% - количественное содержание
20Е,
8 - площади пиков РСО и исследуемого образца,
М - массы навесок РСО и исследуемого образца в граммах.
ВЫВОДЫ
Таким образом, нами разработана методика ВЭЖХ-определения главного действующего вещества (20-
гидроксиэкдизона) в листьях левзеи сафлоровидной. Продолжительность одного определения без учета пробоподготовки составляет около 20 минут. Методика может быть применена для стандартизации лекарственного растительного сырья лев-
зеи сафлоровидной и лекарственных средств на ее основе.
Содержание 20Е в листьях левзеи сафлоровидной, определенное по предлагаемой нами методике, составляло 0,130,82% от общей массы сухого сырья, в зависимости от времени сбора.
SUMMARY A.A. Karusevich, D.V. Moiseev, G.N. Buzuk IDENTIFICATION AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF 20-HYDROXYECDYZONE IN THE LEAVES OF RHAPONTICUM CARTHAMOIDES
HAS BEEN ELABORATED BY THE METHOD OF HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
The determination of 20-hydro-xyecdyzone in the leaves of Rhaponticum car-thamoides has been elaborated by the method of high-performance liquid chromatography. The determination of phytoecdysteroid has been performed of the inverted - phase column (Waters Spherisorb ODS-2 250x4, 6 mm, 5^m) with isocratic regime of MP eluirovation (water and acetonitril 83:17 according to the volume). Gradual schedule of the dependence of the area of the substance peak on the content in the sample is lined in concentration 1-500 ^g/ml
ЛИТЕРАТУРА
1. Фитоэкдистероиды / Л.И Алексеева [и др.]; под общ. ред. В.В. Володина. -СПб.: Наука, 2003. - 293 с.
2. Фитоэкдистероиды - растительные аналоги гормонов линьки насекомых / В.В. Володин [и др.] // Растительные ресурсы. -2004. - Вып.2 - С. 1-18.
3. Вересковский, В.В. Левзея-перспективное лекарственное, пищевое и кормовое растение / В.В. Вересковский, Минск: Наука и техника, 1992. - 64 с.
4. Тимофеев, Н.П. Накопление и сохранность 20-гидроксиэкдизона в лекарственном сырье левзеи / Н.П. Тимофеев // Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами создание функциональных продуктов. Мат. докл. 1-ой Рос. научно-практ. конф. [Электронный ресурс]. - 2006. - Режим
доступа: http/: www.leuzea.ru/левзея сафлоровидная новейший экдистероид содержащий продукт - Leuzea-Rhaponticum carthamoides New ecdysteroid containing product.htm. - Дата доступа:16.07.2006.
5. Куренкова, С.В. Продуктивность и химический состав Rhaponticum carthamoides (Willd.), выращиваемого в республике Коми / С.В. Куренкова, Г.Н. Таба-ленкова // Растительные ресурсы. - 2000. -№2. - С. 14-23.
6. Рапонтикум сафлоровидный -Rhaponticum carthamoides // Лекарственные растения Государственной фармакопеи. Лекарственные растения, разрешенные для производства ГЛС. - М. - 2001. - С. 369373.
7. Пчеленко, Л.Д. Адаптогенный эффект экдистероидсодержащей фракции Seratulla Coronata L. / Л.Д. Пчеленко, Л.Г. Метелкина, С.О. Володина // Химия растительного сырья. - 2002. - №1. - С. 69-80.
8. Зарембо, Е.В. Содержание 20-гидроксиэкдизона в видах родов Raponti-cum Ludw. и Serratula L. флоры Дальнего Востока России / Е.В. Зарембо, Л.И. Соколова, П.Г. Горовой // Растительные ресурсы. - 2001. - №3. - С. 59-64.
9. Алексеева, Л.И. Метод концентрирования минорных гидрофобных экдисте-роидов с использованием фронтальной хроматографии / Л.И. Алексеева, В.В. Володин, В. Г. Лукша // Растительные ресурсы. - 2000. - №4. - С. 122-127.
10. Филиппова, В.Н. Экдистероиды в культурах клеток Serrtulla coronata и Ajuga reptans / В.Н. Филиппова [и др.] // Химия растительного сырья. - 2002. - №1. - С. 5762.
11. Маматханов, А.У. Получение экди-стерона /А.У. Маматханов, М.-Р. Шамсут-динов, Т. Т. Шакиров // Химия природных соединений. - 1983. - №5. - С. 90-92.
12. Карусевич, А. А. Выделение и очистка экдистероидов из листьев левзеи сафлоровидной / А.А. Карусевич, Г.Н. Бу-зук // Вестник ВГМУ. - 2005. - т.4. - №3. -
С. 87-91.
Поступила 26.07.2007г
