CC BY
7
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ СТРУКТУР CRISPR/CAS-СИСТЕМ В ГЕНОМАХ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ KLEBSIELLA PNEUMONIAE
РЕЗЮМЕ
Степаненко Л.А. 1, Сухов Б.Г. 2, Конькова Т.В. 2, Бединская В.В. 1, Клушина Н.В. 2, Злобин В.И. 1
1 ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России (664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1, Россия)
2 ФГБУН Институт химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского СО РАН (630090, г. Новосибирск,
ул. Институтская, 3, Россия)
Автор, ответственный за переписку: Степаненко Лилия Александровна,
e-mail: steplia@mail.ru
Обоснование. Klebsiella pneumoniae относится к группе бактерий-оппортунистов, обладающих способностью формировать множественную анти-биотикорезистентность и передавать её разным видам бактерий путём горизонтального переноса генов. Данные исследования посвящены изучению структурного и функционального разнообразия CRISPR/Cas-систем, защищающих бактерии от инородной ДНК. Их анализ на примере антибио-тикорезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae продемонстрирует их устойчивость к определённым бактериофагам, что позволит разработать подходы в лечении сложных инфекционных заболеваний, вызванных данными микроорганизмами, путём создания таргетной фаговой терапии. Цель исследований. Выполнить биоинформатический анализ выявленных структурных компонентов CRISPR/Cas-систем для скрининга отбора бактериофагов через спейсеры CRISPR-кассет на примере антибиотикоре-зистентных штаммов Klebsiella pneumoniae.
Материалы и методы. В статье проанализированы 29 полногеномных последовательностей Klebsiella pneumoniae, в геноме которых были определены структуры CRISPR/Cas-систем и гены антибиотикорезистентности (по данным NCBI). Для решения поставленной цели с помощью программных методов моделирования произведён поиск üas-генов и CRISPR-кассет, дана их структурная и функциональная характеристики. Результаты. При помощи биоинформационных алгоритмов поиска в геноме антибиотикорезистентных штаммов были определены функционально активные CRISPR/Cas-системы с наличием одной или двух CRISPR-кассет и относящиеся к Type I Subtype Е. Определены группы резистентных штаммов, обладающие идентичным спейсерным составом CRISPR-кассет. Проведён филогенетический анализ, подтверждающий их единое происхождение. Путём анализа спейсерныхпоследовательностей CRISPR-кассет определён спектр разнообразия фагов бактерий рода Klebsiella, Salmonella, относящихся к одному семейству Enterobacteriaceae. Таким образом, была получена информация о бактериофагах, на которые нацелено действие CRISPR-систем штаммов Klebsiella pneumoniae, обладающих анти-биотикорезистентностью.
Заключение. Анализ функциональных и структурных особенностей CRISPR/Cas-систем антибиотикорезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae позволил получить информацию об их эволюционной истории и о бактериофагах, против которых направлено их действие, то есть об их фагоустойчивости. Использованный в данный исследованиях подход в дальнейшем может послужить основой для создания персонифицированной фаготерапии.
Ключевые слова: Klebsiella pneumoniae, антибиотикорезистентность, CRISPR/Cas-система, спейсер, протоспейсер, бактериофаг, биоинформатика
Для цитирования: Степаненко Л.А., Сухов Б.Г., Конькова Т.В., Бединская В.В., Клуши-Сшья пшупига: 27.08.2023 на Н.В., Злобин В.И. Идентификация и анализ структур CRISPR/Cas-систем в геномах
Статья принята: 06 12 2023 антибиотикорезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae. Acta biomedica scientifica.
Статья опубликована:'29.12.2023 2023 8(6): 105-116. doi: 10.29413/ABS.2023-8.6.9
IDENTIFICATION AND ANALYSIS OF CRISPR/CAS SYSTEMS STRUCTURES
IN THE GENOMES OF ANTIBIOTIC-RESISTANT STRAINS OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE
ABSTRACT
Stepanenko L.A. 1, Sukhov B.G. 2, Kon'kova T.V. 2, Bedinskaya V.V. 1, Klushina N.V. 2, Zlobin V.I. 1
1 Irkutsk State Medical University (Krasnogo Vosstaniya str. 1, Irkutsk 664003, Russian Federation)
2 Voevodsky Institute of Chemical Kinetics and Combustion, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Institutskaya str. 3, Novosibirsk 630090, Russian Federation)
Corresponding author: Lilia A. Stepanenko,
e-mail: steplia@mail.ru
Background. Klebsiella pneumoniae belongs to a group of opportunistic bacteria that can form multiple resistance to antibiotics and transmit it to various types of bacteria through horizontal gene transfer. These studies examine the structural and functional diversity of CRISPR/Cas systems that protect bacteria from foreign DNA. Their analysis using the example of antibiotic-resistant strains of Klebsiella pneumoniae will demonstrate their resistance to certain bacteriophages, which will make it possible to develop approaches to the treatment of complex infectious diseases caused by these microorganisms by creating targeted phage therapy. The aim. To perform a bioinformatics analysis of the identified structural components of CRISPR/Cas systems for screening bacteriophages through CRISPR cassette spacers using the example of antibiotic-resistant strains of Klebsiella pneumoniae. Materials and methods. The article analyzed 29 full-genome sequences of Klebsiella pneumoniae, in the genome of which the structures of CRISPR/Cas systems and antibiotic resistance genes were determined (according to NCBI). To achieve this goal, using software modeling methods, a search was made for Cas genes and CRISPR cassettes, and their structural and functional characteristics were given. Results. Using bioinformatic search algorithms in the genome of antibiotic-resistant strains, functionally active CRISPR/Cas systems with the presence of one or two CRISPR cassettes and belonging to Type I Subtype IE were identified. Groups of resistant strains with identical spacer composition of CRISPR cassettes have been identified. A phylogenetic analysis was carried out confirming their common origin. By analyzing the spacer sequences of CRISPR cassettes, the spectrum of diversity of phages of bacteria of the genus Klebsiella, Salmonella, belonging to the same family Enterobacte-riaceae, was determined. Thus, information was obtained about the bacteriophages that are targeted by the action of CRISPR systems of Klebsiella pneumoniae strains that have antibiotic resistance.
Conclusions. Analysis of the functional and structural features of the CRISPR/Cas systems of antibiotic resistant Klebsiella pneumoniae strains made it possible to obtain information about their evolutionary history and about the bacteriophages against which their action is directed, that is, about their phage resistance. The approach used in this study may further serve as the basis for the creation of personalized phage therapy.
Key words: Klebsiella pneumoniae, spacer, antibiotic resistance, CRISPR/Cas-system, bacteriophage, protospacer, bioinformatics
Received: 27.08.2023 Accepted: 06.12.2023 Published: 29.12.2023
For citation: Stepanenko L.A., Sukhov B.G., Kon'kova T.V., Bedinskaya V.V., Klushina N.V., Zlobin V.I. Identification and analysis of CRISPR/Cas systems structures in the genomes of antibiotic-resistant strains of Klebsiella pneumoniae. Acta biomedica scientifica. 2023; 8(6): 105-116. doi: 10.29413/ABS.2023-8.6.9
ВВЕДЕНИЕ
Антибиотики являются одним из величайших достижений человечества. С их появлением стали излечимы ранее фатальные заболевания. Однако формирование устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам на сегодняшний день является одной из серьёзнейших проблем системы здравоохранения [1]. Во всём мире регистрируется рост показателей распространённости анти-биотикорезистентных штаммов [2-6]. Инфекционные заболевания, вызванные данными возбудителями, характеризуются более длительным течением, присоединением многочисленных осложнений, увеличением уровня инвалидности и смертности [7-9]. В связи с этим значительно возрастают экономические затраты, связанные с увеличением продолжительности и стоимости лечения больных в стационаре [10, 11]. В феврале 2017 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) опубликовала список бактериальных патогенов, требующих новых подходов в лечении в связи с их высокой вирулентностью и ан-тибиотикорезистентностью. К данной группе относится Klebsiella pneumoniae. Она является грамотрицательным оппортунистическим патогеном, вызывающим различные инфекционные заболевания, включая инфекции мо-чевыводящих путей, бактериемию, пневмонию и абсцессы [12, 13]. Распространение по всему миру клонов Klebsiella pneumoniae, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL, extended-spectrum beta-lactamases) и карбапенемазы (КРС), стало серьёзной угрозой для медицинских учреждений, так как они являются основной причиной развития опасных для жизни нозокомиальных инфекций [14]. Широкое распространение штаммов, обладающих множественной антибиотикорезистентностью, диктует необходимость поиска альтернативных методов борьбы с ними. ВОЗ в целях борьбы с антибиотикорези-стентностью инициировала многочисленные кампании. Запущен в работу эпидемиологический надзор за устойчивостью микроорганизмов к антимикробным препаратам [1]. Создаются новые подходы в лечении инфекционных заболеваний, которые снижают или полностью заменяют применение антибиотиков [15]. На этом фоне в лечебной практике вновь появляется интерес к применению бактериофагов для лечения заболеваний бактериального происхождения. Одним из реальных инструментов эффективной борьбы становится недавно открытая у бактерий система CRISPR/Cas, защищающая бактерии от чужеродных мобильных генетических элементов. Бактерии способны приобретать и интегрировать генетические элементы в собственный геном [16]. Таким образом, они сохраняют генетическую запись предыдущих атак чужеродных нуклеиновых кислот в массивах CRISPR. Эти массивы состоят из коротких и консервативных повторяющихся последовательностей, называемых повторами, которые стратегически расположены между уникальными последовательностями, называемыми спейсерами. Они встраиваются специализированными белками Cas в массив CRISPR во время инфекций путём вторжения нуклеиновых кислот [17-20]. Адаптивный иммунитет прокариотов против чужеродных генетических элементов достигается за счёт образования
эффекторных комплексов из РНК-ориентированных эн-донуклеаз, которые способны обнаруживать и разрезать чужеродную ДНК, предварительно включённую в массив CRISPR, при вторичном заражении [17, 21]. Таким образом, изучение особенностей строения и работы CRISPR/Cas систем штаммов Klebsiella pneumoniae, обладающих антибиотикорезистентностью, позволит разработать подходы создания таргетной фаговой терапии при лечении сложных инфекционных заболеваний.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выполнить биоинформатический анализ выявленных структурных компонентов CRISPR/Cas-систем для скрининга бактериофагов через спейсеры CRISPR-кассет на примере антибиотикорезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа проводилась на базе лаборатории молекулярной вирусологии и биотехнологии Научно-исследовательского института биомедицинских технологий ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России. Системный дизайн проведённых исследований представлен на рисунке 1.
При проведении данных исследований рандомно были определены 50 полногеномных последовательностей Klebsiella pneumoniae, в геноме которых биоинформа-тическим методом были выявлены CRISPR/Cas-системы. Объектом исследования послужили 29 из 50 полногеномных последовательностей Klebsiella pneumoniae, загруженные из базы данных GenBank, в геноме которых определялись гены антибиотикорезистентности (по данным NCBI (National Center for Biotechnology Information)). Для решения поставленной цели с помощью разработанного биоинформационного программного алгоритма произведён поиск Cas генов и CRISPR-кассет, даны их структурная и функциональная характеристики.
Для поиска CRISPR/Cas-систем и генов Cas использовались программные методы моделирования: Macromolecular System Finder (MacSyF, ver. 1.0.2) с вспомогательными пакетами makeblastDB (ver. 3.0) и HMMER (ver. 2.2.28). Детекция и анализ CRISPR-кассет в геномах проводились с использованием онлайн-сервисов доступных программ: CRISPRCasFinder [22] и CRISPROne [23]. Для поиска фагов расшифрованные спейсерные последовательности в формате FASTA были загружены в онлайн-приложение CRISPRTarget. В работе были использованы только те штаммы, в геноме которых определялись CRISPR/Cas-системы по результатам всех используемых программ ряде программ.
Построение филогенетических деревьев и их выравнивание проводились с помощью программы MEGA X по методу ближайших соседей (NJ, neighbor joining) с анализом статистической значимости топологии бутстрэп-методом (число реплик - 500) и с использованием модели генетических дистанций Maximum
Composite Likelihood. Для «укоренения» дерева к вы- гого вида Escherichia coli (NC 000913.3), который соста-борке исследуемых организмов добавлен штамм дру- вил аутгруппу.
I
I
РИС. 1.
Схема системного дизайна исследований
FIG. 1.
Systematic research design flowchart
РИС. 2. FIG. 2.
Схема расположения CRISPR-кассет и Cas-генов системы Type Scheme of the location of CRISPR cassettes and Cas genes
I Subtype IE в геноме штаммов Klebsiella pneumoniae(данные of the Type I Subtype IE system in the genome of Klebsiella pneumo-
из GenBank: NZ_CP011624.1, NZ_CP006798.1) niaestrains (data from GenBank: NZ_CP011624.1, NZ_CP006798.1)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Объектом исследования послужили 29 из 50 штаммов с наличием CRISPR/Cas-системы в геноме и обладающие генами устойчивости к антибактериальным препаратам (по данным NCBI). Из 29 исследуемых штаммов 55,2 % (n = 16) обладали карбапенемазной активностью, по 3,4 % (n = 1) были устойчивы к рифампицину и три-метоприм-сульфаметоксазолу и 11 (37,9 %) штаммов обладали множественной антибиотикорезистентностью.
При помощи нескольких биоинформационных программ поиска в CRISPR/Cas-системах исследуемых штаммов идентифицировано наличие одной или двух CRISPR-кассет. Во всех случаях рядом с кассетами определён полный набор Cas-генов, характерный для систем Type I Subtype IE (cas2, cas!, cas5, cas7, cas6, cse2gr11, cas8, cas3), что свидетельствует о функциональной активности CRISPR/Cas-систем исследуемых бактерий (рис. 2).
Во всех исследуемых CRISPR-кассетах количество выявленных спейсеров составило 1629. Из них 498 спей-серов не повторялись, 276 спейсеров имели повторы в двух и более CRISPR-локусах. Внутри кассет спейсер-ных повторов не регистрировалось. Количество спейсеров в кассетах составляло от 4 до 64. При этом в штаммах, содержащих одну кассету, суммарное количество спейсеров было больше по сравнению со штаммами, содержащих две кассеты.
Проведённый анализ позволил определить два вида консенсусных последовательностей повторов CRISPR-кассет. Это может свидетельствовать о наличии определённого типа CRISPR-системы (в нашем случае это Type I Subtype IE) и о достаточно стабильной её работе, так как именно данные повторы распознаются белками эндонуклеазы Cas, действие которых направлено на разрезание и разрушение мишени (рис. 3).
G aAACACCccCACg tgcgtg GGG aA® ас cGGTTT aTCcCCcCtgGcgCgGggAACAC
РИС. 3.
Нуклеотидная последовательность консенсусных повторов CRISPR-кассет антибиотикорезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae FIG. 3.
Nucleotide sequence of consensus repeats of CRISPR cassettes of antibiotic-resistant Klebsiella pneumoniae strains
Скрининг спейсерных последовательностей CRISPR-кассет исследуемых штаммов показал их полное соответствие протоспейсерам фагов бактерий семейства Enterobacteriaceae рода Klebsiella (табл. 1). Необходимо отметить, что к большинству спейсеров не было выяв-
лено полного соответствия протоспейсеров фагов из известных баз данных.
При анализе установлено, что в CRISPR-кассетах исследуемых штаммов (NZ_CP013322.1) отмечалось соответствие участка одного спейсера (6) протоспейсерам нескольких фагов бактерий одного семейства, а также соответствие нескольких спейсеров (52, 55) одного штамма (NZ_CP017934.1) протоспейсерам одного и того же фага. Это может свидетельствовать о том, что в процессе эволюции бактерии приспособились приобретать только те спейсеры из ДНК фага, которые эффективно распознаются их эффекторным комплексом, что повышает защитное действие систем CRISPR/Cas.
Таким образом, был определён полный спектр бактериофагов, детектируемых через спейсерные последовательности CRISPR-кассет антибиотикорезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae с доступом к их полному геному в GenBank. Учитывая принцип работы CRISPR/Cas-систем бактерий, можно предполагать, что при встрече с данными фагами они будут уничтожены Cas-нуклеазами при условии соответствия участка его генома последовательности спейсера в CRISPR-кассете бактерий. Данный подход в дальнейшем может быть использован как основа создания персонифицированной фаготерапии.
Далее при анализе антибиотикорезистентных штаммов были определены группы бактерий, обладающие идентичным спейсерным составом CRISPR-кассет. Первую группу составили два штамма, обладающие различным сочетанием генов карбапенемаз (NDM-1, OXA-48, OXA-181), которые были связаны с другими детерминантами устойчивости, включая ß-лактамазы расширенного спектра и метилазу ArmA, кодирующую устойчивость к ами-ногликозидам. Поэтому они были определены как пан-резистентные, так как обладали множественной анти-биотикоустойчивостью. Среди антибиотикорезистентных бактерий выявлены пять штаммов. Необходимо отметить, что данные штаммы, имея сходный спейсерный состав, были выделены в разных регионах мира (Южная Корея, Китай (Шанхай)) и в разное время (2013, 2014 гг.) (табл. 2).
Вторую группу составили три штамма, обладающие множественной антибиотикоустойчивостью, выделенные в одном стационаре (Греция), но в разное время (2011, 2013 гг.). Они были определены как внутригоспиталь-ные штаммы. В их геноме определялось по одной CRISPR-кассете. Причем два штамма имели одинаковый спейсер-ный состав кассет, представленный 24 спейсерами (табл.3).
Третью группу составили восемь штаммов, продуцирующих карбапенемазу и выделенных от больных, находившихся на лечении в стационаре Нижней Саксонии (Германия), где была зарегистрирована нозокомиальная вспышка, вызванная Klebsialla pneumoniae. Установлено, что данные штаммы имели в геноме по одной CRISPR-кассете, состоящие из 35 спейсеров, полностью идентичных друг другу. Также в данную группу вошли еще три штамма, имеющие аналогичный спейсерный состав кассет, но выделенные в разных регионах мира (Арабские Эмираты, США, Сингапур) и в разное время (2015, 2016, 2014 гг.).
Сходство спейсерного состава кассет в геномах штаммов представленных групп может свидетельство-
ТАБЛИЦА 1
РАЗНООБРАЗИЕ СПЕЙСЕРОВ И СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИМ ПРОТОСПЕЙСЕРОВ ФАГОВ В ГЕНОМАХ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ KLEBSIELLA PNEUMONIAE
TABLE 1
DIVERSITY OF SPACERS AND CORRESPONDING PHAGE PROTOSPACERS IN THE GENOMES OF ANTIBIOTIC-RESISTANT KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS
Штамм Кассета/спейсер 5aKTeKpMO$ar Номер доступа в GenBank
NZ_CP008929.1 1/6 Klebsiella phage ST13-OXA48phi12.4 MK422450
NZ_CP009208.1 1/2 Klebsiella phage ST512-KPC3phi13.1 MK448235
NZ_CP009208.1 1/2 Klebsiella phage ST11-VIM1phi8.1 MK448233
NZ_CP009208.1 2/4 Klebsiella phage ST147-VIM1phi7.2 MK448232
NZ_CP009208.1 2/4 Klebsiella phage 1 LV-2017 KY271401
NZ_CP012426.1 1/3 Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231
NZ_CP012743.1 1/12 Klebsiella phage ST11-OXA245phi3.2 MK416010
NZ_CP012744.1 1/12 Klebsiella phage ST11-OXA245phi3.2 MK416010
NZ_CP012745.1 1/3 Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231
NZ_CP012745.1 1/22 Klebsiella phage YMC1601N133_KPN_BP MF476925
NZ_CP012745.1 1/25 Klebsiella phage 2b LV-2017 KY271395
NZ_CP013322.1 1/6 Klebsiella phage ST512-KPC3phi13.1 MK448235
NZ_CP013322.1 1/6 Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231
NZ_CP013322.1 1/6 Klebsiella phage ST11-VIM1phi8.1 MK448233
NZ_CP013322.1 1/6 Klebsiella phage 2 LV-2017 KY271396
NZ_CP013322.1 1/6 Klebsiella phage 2b LV-2017 KY271395
NZ_CP015382.1 1/3 Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231
NZ_CP015500.1 1/3 Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231
NZ_CP015500.1 1/22 Klebsiella phage YMC1601N133_KPN_BP MF476925
NZ_CP015500.1 1/25 Klebsiella phage 2b LV-2017 KY271395
NZ_FO834906.1 1/10 Klebsiella phage ST11-VIM1phi8.2 MK448234
NZ_CP022127.1 2/6 Klebsiella phage ST13-OXA48phi12.4 MK422450
1/53 Klebsiella phage ST405-OXA48phi1.2 MK416007
1/55 Klebsiella phage 1 LV-2017 KY271401
1/22 Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.3 MK416017
1/36 Klebsiella phage 2b LV-2017 KY271395
NZ_CP017934.1 1/52 Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.3 MK416017
1/52 Klebsiella phage ST147-VIM1phi7.2 MK448232
1/52 Klebsiella phage 1 LV-2017 KY271401
1/18 Klebsiella phage ST16-OXA48phi5.1 MK416013
1/18 Klebsiella phage 5 LV-2017 KY271399
NZ_CP018140.1
NZ_CP018686.1
NZ_CP018695.1
NZ_CP018701.1 NZ_CP018707.1 1/3 Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231
NZ_CP018713.1
NZ_CP018719
NZ_CP017985.1
NZ_CP018140.1
NZ_CP018686.1
NZ_CP018695.1
NZ_CP018701.1 NZ_CP018707.1 1/14 Klebsiella phage YMC1601N133_KPN_BP MF476925
NZ_CP018713.1
NZ_CP018719
NZ_CP017985.1
ТАБЛИЦА 1 (продолжение) TABLE 1 (continued)
NZ_CP018140.1 NZ_CP018686.1 NZ_CP018695.1 NZ_CP018701.1 NZ_CP018707.1 NZ_CP018713.1 NZ_CP018719 NZ_CP017985.1 1/17 Klebsiella phage 2b LV-2017 KY271395
NZ_CP018458.1 2/6 Klebsiella phage ST13-OXA48phi12.4 MK422450
NZ_CP019047.1 2/11 Klebsiella phage 2 LV-2017 KY271396
NZ_CP019047.1 2/5 Klebsiella phage ST11-OXA245phi3.2 MK416010
NZ_CP019047.1 2/13 Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231
NZ_CP019047.1 2/12 Klebsiella phage ST16-OXA48phi5.2 MK448230
ТАБЛИЦА 2 TABLE 2
СПЕЙСЕРНЫЙ СОСТАВ CRISPR-КАССЕТ SPACER COMPOSITION OF CRISPR CASSETTES
ПЕРВОЙ ГРУППЫ ПАН-РЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ OF THE FIRST GROUP OF PAN-RESISTANT
KLEBSIELLA PNEUMONIAE KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS
№ штамма в GenBank NZ_CP014004.1 NZ_CP012753.1
Место и год выделения штамма Китай, Цзянси 2014 Южная Корея 2013
TGCCTCCAATGCAATCACCGGCCTGCTAACCGG TGCCTCCAATGCAATCACCGGCCTGCTAACCGG
CGTGTCGAAGCGCACCTCGTAGCCGAGCCAGTC CGTGTCGAAGCGCACCTCGTAGCCGAGCCAGTC
CGTCATCAG CG CCTTGTTCCAG CGGCGACCACC CGTCATCAGCGCCTTGTTCCAGCGGCGACCACC
TCCAGTCGTCGTAGTCCTCGGTAATGTCCTCGA TCCAGTCGTCGTAGTCCTCGGTAATGTCCTCGA
TATCGTGCAGAGTCACAACCTGACGGGATTATC TATCGTGCAGAGTCACAACCTGACGGGATTATC
TCGTGCATGGTGAGGATTCTACAGTCGCACCAT TCGTGCATGGTGAGGATTCTACAGTCGCACCAT
га н TACCTCCCGGCGTCCGCGCCAGGG CGATCACGTG TACCTCCCGGCGTCCGCGCCAGGGCGATCACGTG
и и га CCTGCAGCTGGCCGTCGAGCTGACGGATGCCGG CCTGCAGCTGGCCGTCGAGCTGACGGATGCCGG
TTCATCACGTGTGAGCGGATTTGGCTCTATCCT TTCATCACGTGTGAGCGGATTTGGCTCTATCCT
TATCATCCCTATCGCGCAGCACTTCGACGGCGA TATCATCCCTATCGCGCAGCACTTCGACGGCGA
TACCGCCGCGATACTGGCAGTTTTCAGCTGAAT TACCGCCGCGATACTGGCAGTTTTCAGCTGAAT
TCCCGCTGGGTAAGCAATATATAACATTTGCAG
TTTAACATTCTGAAAGTGCAATTTTTGAGGCTC
TTAAGGAGGGGCGCCATGGAGCCCGTATTGATT
CAGCGGCGGCGGTAACGCCGCCAGGAGCAACCT CAGCGGCGGCGGTAACGCCGCCAGGAGCAACCT
CACCGATCTGCGCCAGCTGGGTGAGACGATGAC CACCGATCTGCGCCAGCTGGGTGAGACGATGAC
TACACTCAAGAAAACAAAATCTCAGGTTGATAC TACACTCAAGAAAACAAAATCTCAGGTTGATAC
2 га н TGGAAGGCGCGATTTGGAGATAGAGCAGCATGA TGGAAGGCGCGATTTGGAGATAGAGCAGCATGA
CTCGCACAGCATCGCCCGGATCCGCTTCCACGC CTCGCACAG CATCG CCCGG ATCCG CTTCCACG C
и и га CACCCGCGTTTTCGAAAGGGATGGCGGCTATGT CACCCGCGTTTTCGAAAGGGATGGCGGCTATGT
CGACGGGGCAGGTTTACGTCTACCCGGGCAGGG CGACGGGGCAGGTTTACGTCTACCCGGGCAGGG
CATACCAGTCTCCGCCGCGGTCGTACTCAATAT CATACCAGTCTCCGCCGCGGTCGTACTCAATAT
TCCGCCGTTTAATCGCGGTGATGATATCCGGCA TCCGCCGTTTAATCGCGGTGATGATATCCGGCA
GGAATCCACGACGCGCCGTACCAGCGCGGGCATTCGTTCT TGGAATCCACGACGCGCCGTACCAGCGCGGGCATTCGTTCT
Примечание. Цветом выделены идентичные спейсеры/
ТАБЛИЦА 3
СПЕЙСЕРНЫЙ СОСТАВ CRISPR-KACCET ВТОРОЙ ГРУППЫ РЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ KLEBSIELLA PNEUMONIAE
TABLE 3
SPACER COMPOSITION OF CRISPR CASSETTES OF THE SECOND GROUP OF RESISTANT KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS
№ штамма в GenBank NZ_CP012743.1 NZ_CP012744.1 NZ_CP012745.1
Место и год выделения Греция Греция Греция
штамма 2011 2013 2013
CATTTCATAGTGATTCGACTATTTAATTAACA
CATTTCATAGTGATTCGACTATTTAATTAACA
AGTTCACGACAGGCAAAGTCTTTACGGTATGC
AGTTCACGACAGGCAAAGTCTTTACGGTATGC
TCTG CTG GTTAC AG G AG A A AA A A ATG ATTG GT
TCTGCTGGTTACAGGAGAAAAAAATGATTGGT
TTATTTCTAAACTAAGTTTTGTTTCATGCAGT TTTTTTTGACGAAGACGGCAACGAGTTAGAAG GTCTCTGCCAGTTTTACCTGCTCAGCGGATAA CTGACAGCTGGCG СТА ACCCGTCGTTTATCG С CGTG AG CATCTG G G С ATCTTC AGTG ATAG CGT
TTATTTCTAAACTAAGTTTTGTTTCATGCAGT TTTTTTTGACGAAGACGGCAACGAGTTAGAAG GTCTCTG CC AGTTTTACCTG CTC AG CG G ATA A CTG AC AG CTG G CG СТА ACCCGTCGTTTATCG С CGTG AG CATCTG G G С ATCTTC AGTG ATAG CGT
TATTTTTGAGATGATGGATTGTTGCACACCAG
TATTTTTGAGATGATGGATTGTTGCACACCAG
CG CTTCTCG G CTTCTCTG A ATTTATCCG CCC A ATCCCGACCCGCTCCTCCAGAGCGAATACGAT TGCTTTATGGCAAATAAGAGAGGATATAACCA G CGTCCG CCTCCC A A ATAG CC AG G CTGTTATT TAAATCCCAGCTGGTTTGACGTAGTGGCACTG
CG CTTCTCG G CTTCTCTG A ATTTATCCG CCCA ATCCCG ACCCG CTCCTCC AG AG CG A ATACG AT TG CTTTATG G С A AATA AG AG AG G ATATA ACC A G CGTCCG CCTCCC A A ATAG CC AG G CTGTTATT ТА A ATCCC AG CTG GTTTG ACGTAGTG G С ACTG
CAATGAAGGCTTATAAGGGTGAAGAGAGCAGG CAGTCGGTAACGG CTG GGCGTGACCTCAAAGC GTG CC ATTTTTATTTTG CTTAA A ATA A ATATC
С A ATG A AG G CTTATA AG GGTGAAGAGAGCAGG CAGTCGGTAACGGCTGGGCGTGACCTCAAAGC GTG CC ATTTTTATTTTG CTTAA A ATA A ATATC
CCTATTGTGTTCAGTCGTAACAGCTGAATCAG
CCTATTGTGTTCAGTCGTAACAGCTGAATCAG
GGCGCGGCG G A ATA ACC ACTTTATG AG С AG GT
CCCCGTCGTC ATTCG CG С ATTCTG CGCACAGA
GGCGCGGCGGAATAACCACTTTATGAGCAGGT
CCCCGTCGTCATTCGCGCATTCTGCGCACAGA
TAACAGGGCCATTTTCCCGGGTTGCCAGACGA
ТА AC AG G G CC ATTTTCCCG GGTTGCCAGACGA
TCACCCTCGTAGCCGATACCACTTTCGCGCAG
TCACCCTCGTAGCCGATACCACTTTCGCGCAG
GGGTTCACTTGGGTGAAACTGAACTAACT
G G GTTC ACTTG GGTGAAACTGAACTAACT
GAGCAGGCACCCGCCGCAACGACGAAGAGCGC AAATCAGCCAGCACCACGATTCTGGGAAATTT ACAGGCTTACCCGTATTGAGACGGTTGCTGAA GAAACCCCATCAGATGACCCTCCCCATGTTGGC TTGCCTGGTCTGCTTGGTGATGATCCGTGGTA TACAGAACGACTGAGGCGGCGTGTATTGCATA G ATCTTA ACTCTATTG CCA ATG G CG С A ATTC A G G CG ATG CG CG CTCTG CTG G CTATCG GTA AA A A ATG CAGCAACCGG С A A ATATATCG CCG GTA A GGGCTGCCGCACG CCTG GGACGAGTCGAGCCC CCG С A ATA AC A A A A ATA A ATG AG G GTTA A AGT GTAAATGGGAATGAGTAGAAGAGCGTCATTGG CCCCCGCG С ACATG CTTA A ACG CG CTATC ACG G G С ATCTGTTGTGTA ATGTTG AGTTTTTTTC A С AG GTTA A AC ATGTA A A A A ATG ACCGTCGCCG CACATTGCCCGGTCTGAAAAGTATTTGAAAAT TCCGCACAGTCAAACGCTCCAGACACCAACCC CCGGAACACCACCAGTAACAGCTACTGTAGGC TGACCCTGTTGATTTTGTTCCAGGTAATACGT TTAACCTCGTCGTTCTG GTTTCCG CCCAGG AT G A ACCTG A ATTCG AAG G GTG G GTC ATCCTTCC GGACCCCGAGCGACCCGGTCACCCTCCGACCT CCGTCGAACGGCGGTTATATCCATCTTGAGTC ACCG ATCCC АСА ATTG CG G CG GTTG AG ATTG A
вать об их едином происхождении. Можно предположить, что в результате широкой циркуляции штаммы генетически изменялись, но при этом сохраняли структуру CRISPR-кассет, а в условиях стационара (внутригоспи-тальные вспышки) обменивались генетической информацией, приобретая новые свойства, но при этом также сохраняли структуру CRISPR-кассеты. Для подтверждения данного момента был проведён филогенетический анализ исследуемых штаммов на основе нуклеотидной последовательности ^ rRNA (рис. 4).
Филогенетический анализ показал, что в исследуемых группах штаммы со сходным спейсерным со-
ставом CRISPR-кассет являются близкородственными, так как располагаются на ветках, имеющих одного предка (один узел). При этом штамм (NZ_CP012745.1), входящий в группу 2 и обладающий индивидуальным спейсерным составом CRISPR-кассет, не имеет единого предка с остальными представителями данной группы.
Таким образом, обнаружение схожих спейсеров в CRISPR-кассетах различных штаммов может указывать на филогенетические связи между штаммами. Данный приём может быть использован при проведении эпидемиологического анализа вспышек заболеваний, вызванных анти-биотикорезистентными штаммами Klebsiella pneumoniae.
РИС. 4.
Филогенетическое дерево на основе маркера 16S rRNA ан-тибиотикорезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae (использована модель генетических дистанций Maximum Composite Likelihood)
FIG. 4.
Phylogenetic tree based on the 16S rRNA marker of antibiotic-resistant Klebsiella pneumoniae strains (Maximum Composite Likelihood model of genetic distances was used)
3
2
Скрининг бактериофагов по спейсерным последовательностям CRISPR-кассет штаммов из вышеперечисленных групп представлен в таблице 1, за исключением двух пан-резистентных штаммов из первой группы (NZ_CP014004.1 и NZ_CP012753.1), так как не было выявлено полного соответствия спейсеров в составе их кассет протоспейсерам из известных баз данных. Однако проведённый анализ спейсерных последовательностей позволил установить наибольшее их соответствие протоспейсерам фагов бактерий рода Klebsiella, Salmonella, относящихся к одному семейству Enterobacteriaceae (табл. 4).
Важно отметить, что в CRISPR-кассетах исследуемых штаммов отмечалось соответствие одного из спей-серов протоспейсерам нескольких фагов бактерий, относящихся к одному семейству. Это может указывать на консервативность приобретаемых новых спейсеров из участков ДНК фагов. Таким образом, бактерия «одним спейсером» защищается от нескольких фагов. Наличие данного механизма повышает эффективность защитного действия систем CRISPR/Cas.
Изучение выявленных бактериофагов показало, что все Klebsiella phage являются профагами бактерий Klebsiella pneumoniae, относящихся к изолятам, принадлежащим к клональной группе ST 307 (по данным NCBI), продуцирующих карбапенемазу (табл. 5). Показано, что геном ST 307 кодирует генетические особенности, которые могут обеспечить преимущество в адаптации к больничной среде и человеку-хозяину. Все изоляты ST 307 являются капсу-
лированными и, следовательно, обладают более высокой устойчивостью к уничтожению, опосредованному комплементом. Всё это обеспечивает распространение и преобладание штаммов с данной генетической последовательностью по всему миру [24]. Как известно, профаги остаются латентными в геноме в течение нескольких клеточных делений, но под воздействием внешних факторов переходят в вирулентные формы и лизируют бактериальную клетку. Таким образом, исследуемые нами антибиотико-резистентные штаммы имеют генетическую память о данных бактериофагах в виде спейсеров их СШБРК-кассет.
Данный анализ исследуемых штаммов показал достаточно широкий спейсерный состав их СШБРК-кассет, разнообразие бактериофагов, выявленных через спейсер-ные последовательности, что позволяет предположить, что они обладают не только антибиотикорезистентно-стью, но и устойчивостью ко многим бактериофагам. Следовательно, персонифицированный подход к комплексному подбору антибиотиков и бактериофагов в перспективе поможет решить вопрос о лечении заболеваний, вызванных данными штаммами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты проведённых исследований позволили получить информацию о строении CRISPR/Cas-систем в геномах антибиотикорезистентных штаммов Klebsiella
ТАБЛИЦА 4
РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИОФАГОВ, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИДЕНТИЧНЫМ СПЕЙСЕРАМ В ПЕРВОЙ ГРУППЕ ШТАММОВ KLEBSIELLA PNEUMONIAE С МНОЖЕСТВЕННОЙ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ
TABLE 4
DIVERSITY OF BACTERIOPHAGES CORRESPONDING TO IDENTICAL SPACERS IN THE FIRST GROUP OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS WITH MULTIPLE ANTIBIOTIC RESISTANCE
Номер доступа штамма GenBank Нуклеотидная последовательность спейсера Бактериофаг Номер доступа бактериофага GenBank Количество нуклеотидных замен
NZ_CP014004.1 NZ_CP012753.1 TTCATCACGTGTGAGCGGATTTGGCTCTATCCT Klebsiella phage 6 LV-2017 KY271400 2
NZ_CP014004.1 NZ_CP012753.1 TGCCTCCAATGCAATCACCGGCCTGCTAACCGG Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231 1
NZ_CP014004.1 NZ_CP012753.1 CGTCATCAGCGCCTTGTTCCAGCGGCGACCACC Salmonella phage FSL SP-062 KC139634 2
Klebsiella phage ST512-KPC3phi13.1 MK448235 1
Klebsiella phage ST11-VIM1phi8.1 MK448233 1
NZ_CP014004.1 NZ_CP012753.1 TCCAGTCGTCGTAGTCCTCGGTAATGTCCTCGA Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231 1
Klebsiella phage 2b LV-2017 KY271395 1
Klebsiella phage 2 LV-2017 KY271396 2
ТАБЛИЦА 5 TABLE 5
ПЕРЕЧЕНЬ ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫХ LIST OF IDENTIFIED BACTERIOPHAGES
БАКТЕРИОФАГОВ В ПЕРВОЙ ГРУППЕ ШТАММОВ IN THE FIRST GROUP OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE
KLEBSIELLA PNEUMONIAE С МНОЖЕСТВЕННОЙ STRAINS WITH MULTIPLE ANTIBIOTIC RESISTANCE АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ
Бактериофаг Номер доступа бактериофага (GenBank) Источник выделения бактериофага Место выделения бактериофага
Klebsiella phage 6 LV-2017 KY271400 Klebsiella pneumoniae ST307 Италия, Рим
Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231 Klebsiella pneumoniae ST101-KPC2 Испания, Ла-Корунья
Salmonella phage FSL SP-062 KC139634 Молочная ферма Нью-Йорк, США
Klebsiella phage ST512-KPC3phi13.1 MK448235 Klebsiella pneumoniae ST512-KPC3 Испания, Ла-Корунья
Klebsiella phage ST11-VIM1phi8.1 MK448233 Klebsiella pneumoniae ST11-VIM1 Испания, Ла-Корунья
Klebsiella phage ST101-KPC2phi6.1 MK448231 Klebsiella pneumoniae ST101-KPC2 Испания, Ла-Корунья
Klebsiella phage 2b LV-2017 KY271395 Klebsiella pneumoniae KH43 -клон Klebsiella pneumoniae ST307 Италия, Рим
Klebsiella phage 2b LV-2017 KY271396 Klebsiella pneumoniae H151440672 -клон Klebsiella pneumoniae ST307 Италия, Рим
pneumoniae и об их функциональных особенностях. Выявленное разнообразие спейсерных последовательностей свидетельствует об эволюционной истории и адаптационных возможностях данных штаммов. При этом обнаружение схожих спейсеров в CRISPR-кассетах различных штаммов может указывать на филогенетические связи между штаммами. Изучение структуры взаимодействия фагов и бактерий, основанное на спейсер-ных и протоспейсерных последовательностях, позволяет определить резистентность и чувствительность штаммов к специфицированным бактериофагам. Таким образом, была определена предполагаемая устойчивость антибиотикорезистентных штаммов к конкретным фагам. Применение механизмов изучения CRISPR/ Cas-систем в геномах бактерий с помощью биоинформационного анализа в перспективе даст возможность получать более полные сведения о свойствах возбудителя, об их эволюции и выполнять подбор высокоспецифичных бактериофагов.
Конфликт интересов
Авторы данной статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование
Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 22-25-00449 (https://rscf.ru/ project/22-25-00449).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. World Health Organization. Global action plan on antimicrobial resistance. Geneva: WHO; 2015.
2. Webale MK, Wanjala C, Guyah B, Shaviya N, Munyeke-nye GO, Nyanga PL, et al. Epidemiological patterns and antimi-
crobial resistance of bacterial diarrhea among children in Nairobi City, Kenya. Gastroenterol Hepatol Bed Bench. 2020; 13(3): 238-246.
3. Yangzom T, Tsering DC, Kar S, Kapil J. Antimicrobial susceptibility trends among pathogens isolated from blood: A 6-year retrospective study from a tertiary care hospital in East Sikkim, India. J Lab Physicians. 2020; 12(01): 3-9. doi: 10.1055/s-0040-1712814
4. Zalewska A, Wilson J, Kennedy S, Lockhart M, MacLeod M, Malcolm W. Epidemiological analysis of antimicrobial resistance in Staphylococcus epidermidis in Scotland, 2014-2018. Microbial Drug Resistance. 2021; 27(4): 485-491. doi: 10.1089/mdr.2019.0502
5. Mouiche MMM, Moffo F, Akoachere J-FTK, Okah-Nnane NH, Mapiefou NP, Ndze VN, et al. Antimicrobial resistance from a one health perspective in Cameroon: A systematic review and metaanalysis. BMC Public Health. 2019; 19(1): 1135. doi: 10.1186/s12889-019-7450-5
6. Melese A, Genet C, Andualem T. Prevalence of Vancomycin resistant enterococci (VRE) in Ethiopia: A systematic review and meta-analysis. BMC Infect Dis. 2020; 20(1): 124. doi: 10.1186/ s12879-020-4833-2
7. Cassini A, Plachouras D, Monnet D. Attributable deaths caused by infections with antibiotic-resistant bacteria in France -Authors' reply. Lancet Infect Dis. 2019; 19(2): 129-130. doi: 10.1016/ s1473-3099(19)30004-0
8. Phodha T, Riewpaiboon A, Malathum K, Coyte P. Annual relative increased in inpatient mortality from antimicrobial resistant nosocomial infections in Thailand. Epidemiol Infect. 2019; 147: 133. doi: 10.1017/s0950268818003436
9. Pessoa e Costa T, Duarte B, Joao AL, Coelho M, Formiga A, Pinto M, et al. Multidrug-resistant bacteria in diabetic foot infections: Experience from a Portuguese tertiary centre. Int Wound J. 2020; 17: 1835-1839. doi: 10.1111/iwj.13473
10. World Health Organization. Reporton surveillance of antibiotic consumption:2016-2018 early implementation. Geneva: WHO; 2018.
11. Shrestha P, Cooper B, Coast J, Oppong R, Do Thi Thuy N, Phodha T, et al. Enumerating the economic cost of antimicrobial resistance per antibiotic consumed to inform the evaluation of in-
terventions affecting their use. Antimicrob Resist Infect Control. 2018; 7(1): 98. doi: 10.1186/s13756-018-0384-3
12. Brauberg CA, Palacios M, Miller VL. Klebsiella: A long way to go towards understanding this enigmatic jetsetter. FlüüüPrime Reports. 2014; 6: 64. doi: 10.12703/P6-64
13. Хаертынов Х.С., Анохин В.А., Николаева И.В., Семенова Д.Р., Любин С.А., и др. Клебсиеллезный неонатальный сепсис. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2016; 11(1): 82-86. [Khaertynov KhS, Anokhin VA, Nikolaeva IV, Semenova DR, Lyu-bin SA, et al. Klebsiella neonatal sepsis. Medical Bulletin of the North Caucasus. 2016; 11(1): 82-86. (In Russ.)]. doi: 10.21508/1027-40652019-64-5-176-182
14. Wyres KL, Holt KE. Klebsiella pneumonia population genomics and antimicrobial-resistant clones. Trends Microbiol. 2016; 24: 944-956. doi: 10.1016/j.tim.2016.09.007
15. Makabenta J, Nabawy A, Li C, Schmidt-Malan S, Patel R, Rotello V. Nanomaterial-based therapeutics for antibiotic-resistant bacterial infections. Nature Reviews Microbiology. 2021; 19: 23-26. doi: 10.1038/s41579-020-0420-1
16. Mojica FJM, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 2005; 60: 174-182. doi: 10.1007/ s00239-004-0046-3
17. NuñezJK, Kranzusch PJ, Noeske J, Wright AV, Davies CW, Doudna JA. Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity. Nat Struct Mol Biol. 2014; 21: 528-534. doi: 10.1038/nsmb.2820
18. Nuñez JK, Harrington LB, Kranzusch PJ, Engelman AN, Doudna JA. Foreign DNA capture during CRISPR-Cas adap-
tive immunity. Nature. 2015; 527: 535-538. doi: 10.1038/ nature15760
19. Jackson SA, McKenzie RE, Fagerlund RD, Kieper SN, Fin-eran PC, Brouns SJJ. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 2017; 356: eaal5056. doi: 10.1126/science.aal5056
20. Mojica FJM, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Almendros C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 2009; 155: 733740. doi: 10.1099/mic.0.023960-0
21. Степаненко Л.А., Джиоев Ю.П., Злобин В.И., Бори-сенко А.Ю., Саловарова В.П., Арефьева Н.А., и др. Разработка подходов скрининга высокоспецифичных бактериофагов на основе биоинформационного анализа структур CRISPR-Cas систем Corynebacterium diphtheriae. Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2021; 11(2): 216-227. [Stepanenko LA, Dzhioev YuP, Zlobin VI, Borisenko AYu, Salovarova VP, Arefieva NA, et al. Development of screening approaches of highly specific bacteriophages based on bioinformatic analysis of CRISPR-Cas structures of Corynebacterium diphtheriae systems. Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2021; 11(2): 216-227. (In Russ.)]. doi: 10.21285/2227-2925-2021-11-2-216-227
22. CRISPRCasFinder. URL: https://crisprcas.i2bc.paris-saclay. fr/CrisprCasFinder/Index [date of access: 22.08.2023].
23. CRISPRone. URL: https://omics.informatics.indiana.edu/ CRISPRone/ [date of access: 22.08.2023].
24. Villa L, Feudi C, Fortini D, Brisse S, Passet V, Bonura C, et al. Diversity, virulence, and antimicrobial resistance of the KPC producing Klebsiella pneumoniae ST307 clone. Microbial Genomics. 2017; 3. doi: 10.1099/mgen.0.000110
Сведения об авторах
Степаненко Лилия Александровна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и биотехнологии, Научно-исследовательский институт биомедицинских технологий, ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, e-mail: steplia@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5792-7283 Сухов Борис Геннадьевич - кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории наночастиц, ФГБУН Институт химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского СО РАН, e-mail: boris_sukhov@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9751-6454
Конькова Татьяна Владимировна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории наночастиц, ФГБУН Институт химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского СО РАН, e-mail: konbuivol_2@yahoo.com, https://orcid.org/0009-0002-0706-8692
Бединская Виктория Владимировна - аспирант кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, e-mail: vika-2801@mail.ru, https://orcid.org/0009-0000-9536-4795
Клушина Надежда Владимировна - аспирант, ведущий инженер лаборатории наночастиц, ФГБУН Институт химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского СО РАН, e-mail: klusinanadezda677@gmail.com, https://orcid.org/0009-0008-7776-2931
Злобин Владимир Игоревич - доктор медицинских наук, академик РАН, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, e-mail: vizlobin@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-0164-5113
Information about the authors
Lilia A. Stepanenko - Cand. Sc. (Med.), Senior Research Officer at the Laboratory of Molecular Virology and Biotechnology, Research Institute of Biomedical Technologies, Irkutsk State Medical University, e-mail: steplia@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5792-7283
Boris G. Sukhov - Cand. Sc. (Chem.), Leading Research Officer at the Laboratory of Nanoparticles, Voevodsky Institute of Chemical Kinetics and Combustion, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, e-mail: boris_sukhov@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9751-6454
Tatyana V. Kon'kova - Cand. Sc. (Chem.), Senior Research Officer at the Laboratory of Nanoparticles, Voevodsky Institute of Chemical Kinetics and Combustion, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, e-mail: konbuivol_2@yahoo.com, https://orcid.org/0009-0002-0706-8692
Victoria V. Bedinskaya - Postgraduate at the Department of Microbiology, Virology and Immunology, Irkutsk State Medical University, e-mail: vika-2801@mail.ru, https://orcid.org/0009-0000-9536-4795
Nadezhda V. Klushina - Postgraduate, Leading Engineer at the Laboratory of Nanoparticles, Voevodsky Institute of Chemical Kinetics and Combustion, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, e-mail: klusinanadezda677@gmail.com, https://orcid.org/0009-0008-7776-2931
Vladimir I. Zlobin - Dr. Sc. (Med.), Member of the RAS, Head of the Department of Microbiology, Virology and Immunology, Irkutsk State Medical University, e-mail: vizlobin@mail.ru, https:// orcid.org/0000-0002-0164-5113
