CC BY-ND
30
сентябрь №9 (234) ЗНифО
17
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ НОВЫХ И ЭПИДЕМИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ШТАММОВ ЭНТЕРОВИРУСОВ С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОГО И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Е.Н. Амяга1, А.Н. Лукашев2, О.Е. Троценко1, П.В. Корита1, В.И. Резник3
IDENTIFICATION AND ANALYSIS OF NEW AND EPIDEMICALLY SIGNIFICANT STRAINS ENTEROVIRUS USING MOLECULAR BIOLOGICAL AND PHYLOGENETIC ANALYSIS
E.N. Amyaga, A.N. Lukashev, O.E. Trotsenko, P.V. Korita, V.I. Reznik
'ФБУН «Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора, 2ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН, 3ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Хабаровском крае»
В работе представлена характеристика вирусов, которые циркулировали на территориях Дальневосточного и Сибирского федеральных округов в течение последних 5 лет, идентифицированные молекулярно-биологическим методом, при этом не определявшиеся вирусологически. Проведено молекулярно-эпидемиологическое исследование вирусов Coxsackievirus В1, Coxsackievirus В5, Echovirus 11 с помощью метода молекулярных часов, основываясь на концепции Марковских цепей Монте-Карло (Markov chain Monte Carlo). В результате доказано, что на территории Дальневосточного и Сибирского федеральных округов вирусы заносятся с других территорий каждые несколько лет, а не циркулируют постоянно. Впервые на территории СССР и Российской Федерации был открыт и проанализирован новый серотип энтеровируса — энтеровирус 116 типа.
Ключевые слова: молекулярная эпидемиология, метод молекулярных часов, энтеровирусная инфекция, энтеровирус 116 типа.
The characteristics of viruses that are circulating in the territories of the Far Eastern and Siberian federal districts, over the past five years and which were identified by molecular-biological method are presented in this work. A molecular-epidemiological study of Coxsackievirus B1, Coxsackievirus B5 and Echovirus11 was performed based on the concept of Markov chain Monte-Carlo. The results of this study imply frequent introduction of new enterovirus variants from Europe and Asia. bFor the first time in the USSR and the Russian Federation was found and subsequently analyzed a new serotype of enterovirus — 116 enterovirus type.
Keywords: molecular epidemiology, molecular clocks, enterovirus infection, enterovirus type 116.
Энтеровирусные инфекции (ЭВИ) — серьезная угроза здоровью населения всего мира, ежегодно регистрируются сотни тысяч случаев заболеваний различной степени тяжести, сопровождающиеся значительным социально-экономическим ущербом. В Российской Федерации регистрируется от 6 до 10 тыс. случаев заболевания ЭВИ более чем в 60 субъектах. В ряде регионов показатели заболеваемости ЭВИ многократно превышают средние по стране [2]. Неполиомиелитные энте-ровирусы относятся к семейству Picornaviridae, роду Enterovirus, содержат одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности, кодирующую полипротеин. Геном энтеровируса окружен икосаэдрическим капсидом. Каждый протомер содержит по 1 молекуле поверхностных белков VP1,VP2, VP3 и VP4 - внутренний.
В Хабаровском НИИ эпидемиологии и микробиологии (ХНИИЭМ) Роспотребнадзора
функционирует Дальневосточный региональный научно-методический центр по изучению ЭВИ. Одним из направлений деятельности центра является анализ молекулярной эпидемиологии штаммов энтеровирусов, выделенных в Дальневосточном федеральном округе (ДФО) и Забайкалье от больных и из окружающей среды. Эта работа выполняется в сотрудничестве с коллегами из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН и ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Хабаровском крае».
Цель данной работы — проведение анализа молекулярной эпидемиологии эпидемически значимых субтипов неполиомиелитных энтеровиру-сов и дать характеристику нового штамма энтеро-вируса 116 типа.
Задачи исследования — проанализировать филогенетические взаимоотношения между штам-
18
ЗНиСО сентябрь №9 (234)
мами вирусов, выделенных в 2008—2011 гг., а также штаммами близких им вирусов, выделенных в других регионах России и мира, исследовать свойства нового энтеровируса 116 типа и определить его полную нуклеотидную последовательность.
Материалы и методы. Ежегодно в ХНИИЭМ проводится более 400 исследований на наличие энтеровирусов в материале, поступающем с территорий Дальневосточного и Сибирского федеральных округов. Из них методом молекулярного типирования (анализа нуклеотидной последовательности) за последние 2 года удалось определить серотип 80 энтеровирусов. Наиболее часто выявлялись серотипы ЕСНО 30, КВ 1, ЕСНО 11, КА 9 и ЕСНО 6.
Для молекулярного типирования энтеровирусов использовались методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Нуклеотидную последовательность фрагмента вирусного генома определяли в реакции термоциклического секве-нирования [3; 4]. Поиск гомологичных последовательностей проводился по базе данных GenBank с помощью программы BLAST. Нуклеотидные последовательности выравнивались в программе BioEdit. С помощью пакета программ Beast, рассчитывающего филогению методом Марковских цепей Монте-Карло (Markov chain Monte Carlo), была проанализирована молекулярная эпидемиология энтеровирусов, основываясь на концепции молекулярных часов. Молекулярные часы (molecular clock) — это метод датирования филогенетических событий, основанный на утверждении, что нуклеиновым кислотам присуща практически постоянная скорость эволюцион-но значимых замен [1].
Результаты и обсуждение. В работе использованы штаммы, которые циркулировали на территориях Дальневосточного и Сибирского Федеральных округов в течение последних 5 лет, были определены молекулярно-биологическим методом, но не определялись при использовании культуры тканей. На рисунках 1, 2 и 3 представлен пример молекулярно-эпидемиологических исследований на примере вирусов Coxsackievirus В1 (КВ1), Coxsackievirus В5 (КВ5) и Echovirus 11 (Е11).Два штамма Коксаки В1, выделенные в марте 2011 г. из материала от больных в детском саду г. Улан-Удэ, были практически идентичны
-CBV5 Nancy 1954
-с;
-АМ7110Э4 FRA 2006
2004
AJ417537 13 Gb 190S
AY635108 CHN Zhejiang 2G02 GQ329770 CHN2002 GQ352395 В LR 2005 I GQ250165 RUS Orenb.Uffl.200B J pKhab 1162 2008 I [ Khab 1164 2008 Khab 1163 2008 Khab 1161 2008 Khab 932 2008 г Khab 3849 2009 Khab 631 2009 г Khab 3839 2009 f Khab 3903 2009 I Khab 3812 2009 Khab 3009 2009 L AM711010 FRA20G5 GQ246513 CHN 2005 EU604661 KOR 2005
-AB268141 CHN Yunnan 20Ш
AB268142 CHN Yunnan 1997
Рис. 2. Молекулярная эпидемиология Coxsackievirus В5
Рис. 1. Молекулярная эпидемиология штаммов Coxsackievirus В1
между собой и формировали единую группу со штаммами, циркулировавшими в республике Корея в 2009 г. (рис. 1). Предшественником этих двух штаммов являлся вирус, циркулировавший в 2010 г. Общий предок Корейских и Забайкальских штаммов был зафиксирован в 2007 г. Возможно, в период с 2007 по 2010 гг. вирус КВ 1 был занесен в Улан Удэ из Кореи.
В 2008—2009 гг. на территории г. Хабаровск было выделено 11 штаммов вируса КВ 5 (рис. 2). Они сформировали единую группу и имели общего предшественника со штаммом, выделенным в Оренбурге в 2006 г. (95 % доверительный интервал составил 2 года). Штамм, выделенный во Франции в 2005 г., имеет общего предшественника с Оренбургским штаммом, близким к Хабаровскому. Этот предшественник циркулировал в 2004 г. (95 % доверительный интервал — 4 года). Возможно, вирус КВ 5 был занесен на территорию России из Европы в период с 2004 по 2006 гг., где в последующем подвергся дивергенции.
В 2009 г. в г. Хабаровск было выделено 2 штамма вируса Е 11, в 2010 г. этот вирус был идентифицирован на территории Забайкальского края (г. Чита) из фекальной пробы от больного ЭВИ (рис. 3). Все три вируса сформировали на филогенетическом дереве единый субкластер в пределах монофилетической группы, в которую вошли штаммы, выделенные в России в 2008 г. Общий предшественник Хабаровского и Читинских штаммов циркулировал в 2006 г., а общий родственный штамм всей исследуемой группы зафиксирован в 2005 г. Скорее всего, этот вирус был занесен в период с 2005 по 2006 г. на территорию России из Европы.
сентябрь №9 (234) ЗНифО
19
-AY896764 Mold2002
AY167106 Krasnoy 1982 _pAY167105 Krasnoy 1986
LAY167104|rtut 1HB7
—AY121378TX2000 —AM492435FR2002 pAM492+36 FR 2002 . j- GU393726 ES 2003 I—FJ8S8301AUS2005 I—GU 393763 RU 2004
j-AM236940FR 2005
Um492437FR2002
-GU393756 NL2007
rGU393762 F1 2006 ^—SGU393781 BY 2008 rGU393737 ES 2007 г GU393780 RU200E 164 Chita 2010
Г1
Q Khabarovsk 3550 2009 'Khabarovsk127 2009
— GU3937G3 RU200B
-GU393755 NL20ÜB
— GU393779 RU 2006 LGU393751 NL1999
Рис. 3. Молекулярная эпидемиология ЕсИоупге 11
Таким образом, исследование показывает, что вирусы, циркулирующие на территории ДФО и Забайкалья, заносятся с других территорий каждые несколько лет, а не циркулируют постоянно. Но стоит учесть, что скорость мутаций неравномерна и различна для разных видов, поэтому расчеты на основе молекулярных часов весьма приблизительны. Все вирусы, представленные в работе, занесены в международную базу данных GenBank.
Вторая часть исследования была посвящена идентификации и характеристикам энтеровируса 116 типа. В период с 2000 по 2011 гг. по всему миру было зарегистрировано 44 новых энтеровируса. Основанием для идентификации энтеровируса, как представителя серотипа, является идентичность более 75 % нуклеотидной и 85 % аминокислотной последовательности с любым штаммом известного серотипа. Основанием для идентификации нового серотипа энтеровируса является идентичность менее 75 % нуклеотидной и менее 85 % аминокислотной последовательности с любым штаммом известного серотипа.
В рамках проводимого исследования в одной из проб, поступивших в лабораторию Хабаровского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора в октябре 2010 г. из г. Южно-Сахалинск, был выявлен вирус, нуклеотидная последовательность которо-
го в области генома VP1 не могла быть однозначно идентифицирована в базе данных GenBank. Для дальнейшей идентификации образец ДНК вируса был передан в Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, где была определена нуклеотидная последовательность всей области генома VP1. Ближайшими родственниками исследуемого вируса оказался вирус Коксаки А22, с которым новый изолят имел 74,4 % сходства нуклеотидной последовательности. Полученные данные были представлены в Международную группу по изучению энтерови-русов (Picornaviridae Study Group), где было подтверждено открытие нового серотипа энтеровиру-са — энтеровируса 116 типа (ЭВ 116) [5]. Данный серотип стал первым серотипом энтеровирусов, открытым в СССР и России.
С целью проверки гипотезы о том, что новый вирус не мог быть идентифицирован ранее вирусологическим методом, была исследована цитопа-тогенная способность данного вируса на культуре клеток с проведением 4 слепых пассажев на следующие культуры клеток: RD, Нер—2, L—41 и Vero. Наличие цитопатогенного действия было только на культуре клеток RD, но оно исчезло ко второму пассажу. Вероятно, вирус в первом и втором пассаже сохранялся благодаря оптимальной температуре и поддерживающей среде, или наблюдаемый нами эффект был результатом неспецифической токсичности (см. табл.). Дополнительно было выявлено, что у ЭВ 116 отсутствуют гемагглюти-национные свойства.
Для более детальной характеристики вируса была определена полная нуклеотидная последовательность кодирующей области генома (6915 нуклеотидов). Вирус является мозаичным реком-бинантом относительно других представителей вида Human enterovirus C, что характерно для всех энтеровирусов. В частности, в области генома 3D, кодирующей вирусную полимеразу, ЭВ 116 был очень сходен и филогенетически достоверно группировался с энтеровирусом 96 типа, выделенным в 2000 г. в Бангладеш.
Заключение. В соответствии с планами развития энтеровирусного надзора на территории РФ, в ХНИИЭМ были отработаны методики молекулярного типирования и филогенетического анализа энтеровирусов.
Впервые на Дальнем Востоке с помощью современных методов исследования было подтверждено регулярное появление новых субтипов энтеровирусов. Показано, что имеют место регулярные заносы новых вариантов ЭВ из стран
Цитопатогенность энтеровируса 116 типа на культурах клеток
Тип RD Hep - 2 L - 41 Vero
Посев Номер пассажа Посев Номер пассажа Посев Номер пассажа Посев Номер пассажа
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
ЭВ 116 + + +/—
(«+» — наличие цитопатогенного действия, «-» — отсутствие цитопатогенного действия)
20
ЗНиСО сентябрь №9 (234)
Европы и Азии. Более того, неоднократно выявлена циркуляция нескольких генетических вариантов одного серотипа в течение одного года.
Впервые на территории СССР и Российской Федерации был открыт новый серотип энтерови-руса: ЭВ 116.
Применение молекулярных методов позволило получить сиквенс полного генома вируса. Дальнейшие исследования, проведенные на культуре клеток, выявили ограниченную цитопато-генную способность ЭВ 116 и отсутствие проявления гемагглютинационных свойств.Применение современных методов исследования позволяет глубже изучать молекулярную эпидемиологию энтеровирусов, что способствует совершенствованию эпидемиологического надзора за инфекциями.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Лукашев В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ. М: БИНОМ, 2009. С. 123—130.
2. Троценко О.Е., Лукашев А.Н., Сапега Е.Ю., Резник В.И., Каравянская Т.Н., Котова В.О., Бала-
хонцева Л.А., Амяга Е.Н., Корита Т.В. Научно-методические основы организации молекуярно-эпидемиологического мониторинга энтеровирус-ных инфекций //Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии. 2011. № 19. С. 5—12.
3. Усовершенствованная молекулярная идентифик-ция энтеровирусов с помощью ОТ — ПЦР и секве-нирования ампликонов //M.S. Oberst, W.A. Nix, R. Maher, M.A. Pallansh //J.Clin. Virology. 2003. Vol. 26. P. 375—377.
4. Oberste M.S, Nix WA, Maher K., Pallansch M.A. Improved molecular identification of enteroviruses by RT-PCR and amplicon sequencing //J Clin Virol. 2003. № 26. С. 375—377.
5. Picornaviridae Study Group. URL: http www. picornastudygroup.com (дата обращения: 24. 03.12).
Контактная информация:
Троценко Ольга Евгеньевна
тел.: 8 (4212) 32-52-28, 8 (909) 804-33-13,
e-mail: bovlad@email.kht.ru
Contact information: TTotsenko Olga,
phone: 8 (4212) 32-52-28, 8 (909) 804-33-13, e-mail: bovlad@email.kht.ru
