CC BY
62
УДК 61:578.7
А.А. Штыров, С.В. Орлова
ИДЕНТИФИКАЦИЯ АДЕНОВИРУСОВ РЕСПИРАТОРНОЙ ГРУППЫ МЕТОДОМ ПЦР
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь, г. Минск
Грипп и гриппоподобные заболевания по-прежнему остаются одной из важнейших медицинских и социальных проблем нашего общества в силу высокого удельного веса в инфекционной патологии, риска развития тяжелых осложнений, обострений хронических болезней [1, 2]. Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) занимают первое место по частоте и количеству случаев заболеваний в мире и составляют до 90% всех инфекционных заболеваний [3, 4]. Согласно результатам наблюдений последних лет в структуре вирусной респираторной патологии в республике ведущую роль играет аденовирусная инфекция [5].
Аденовирусы человека являются безоболочечными ДНК-содержащими вирусами и относятся к роду Mastadenovirns семейства Adenoviriedae. В настоящее время выделено 6 родов (от А до F) аденовирусов человека по генотипу, в который описано 52 серотипа. Аденовирус человека, принадлежащие к разным подродам, характеризуются разной степенью патогенности (способны поражать ткани дыхательных путей, глаз, желудочнокишечного тракта), течением инфекционного процесса, а при культивировании в тканевых культурах отличаются циклом репродукции и вызываемой или не вызываемой деструкцией клеток [6].
Цель настоящей работы состояла в определении методом ПЦР группоспецифических респираторных аденовирусов, циркулирующих в г Минске.
Материалы и методы. Материал от больных. Назофарингиальные смывы от больных с респираторной патологией верхних и нижних дыхательных путей в острой фазе инфекции, получены в соответствии с инструкцией взятия материала, любезно предоставлены сотрудниками II детской клинической инфекционной больницы г. Минска [7].
Метод флуоресцирующих антител (МФА). Детекцию антигена аденовируса проводили в культуральных пробах и в первичном материале, полученным от больных (назофарингиальные смывы), который осветляли центрифугированием и из осажденных эпителиальных клеток готовили мазки на деколированных предметных стеклах. Окрашивание стекол осуществляли в соответсвии с инструкцией, приложенная к набору производства ГУ РНПЦ Эпидемиологии и Микробиологии. Окрашенные препараты исследовали под люминесцентным микроскопом Nikon Eclipse TC100 (Германия) [7].
Полимеразная цепная реакция. Выделение ДНК проводили с помощью комплекта реагентов «ДНК-сорб-В» в соответвтвии с инструкцией
63
(АмплиСенс, Россия). В качестве праймеров для синтеза исследуемой области генома аденовируса применяли синтетические олигодезоксинуклеотиды производства «Праймтех» (Беларусь) (таблица!).
Таблица 1 - Праймеры, использованные для проведения диагностической ПЦР
Праймеры Нуклеотидные последовательности праймеров Область генома Ссылка
Adi 5’- TCCCCATGGCICAYAACAC-3’ Ad гексон [8]
Ad2 5’- CCCTGGTAKCCRATRTTGTA -3’ Ad гексон
Ad(E1A)BF 5’-CGGAGCTGCCTGGACATG -3’ AdB E1A [9]
Ad(E1A)BR 5’ -GCTTAGGCTTCACAGGAATG -3’ AdB E1A
Ad(E1A)CF 5’-GGTGATCGATCTTACCTGC -3’ AdC E1A
Ad(E1A)CR 5’ -CTCAGGAGGTGTGTTAGAAGG -3’ AdC E1A
Для постановки ПРЦ использовали реакционную смесь следующего состава: по 20 ммоль пары праймеров, 65мМ ТрисНС1 (рН8,8), 16,6mM (NH4)2SO4, 0,02% Твин 20, 1,5 mM MgCl2, 100 мкмоль dNTP, 0,5 ед Taq-polymerase (все производство ПраймТех, Беларусь) и 5 мкл ДНК. Условия проведения реакции ПЦР выполняли в следующих условиях (таблица 2).
Таблица 2 - Условия проведения полимеразной цепной реакции
Этап ПЦР Кол-во циклов Ad гексон* AdB E1A* AdC E1A*
начальная денатурация 1 3:00 (95) 3:00 (95) 3:00 (95)
денатурация 40 0:30 (95) 0:30 (95) 0:30 (95)
отжиг праймеров 40 0:30 (56) 0:30 (58) 0:30 (60)
элонгация 40 0:30 (72) 0:30 (72) 0:30 (72)
последняя элонгация 1 5:00 (72) 5:00 (72) 5:00 (72)
Примечание: * - все условия показаны, как время (температура), где время выражается в минутах, а температура в градусах Цельсия; все реакции ПЦР в конце охлаждали до 4°С.
Синтез ПЦР-продуктов анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-ацетатном буфере, рН 8,5 (0,04М трис-ацетат, 0,002М ЭДТА) с добавлением бромистого этидия (Invitrogen, Бельгия).
Результаты и обсуждение. Изоляцию вируса проводили на клетках Нер-2С, которые являются пермиссивной культурой, в течение 3 последовательных пассажей и регистрировали наличие ЦПД (таблица 3).
Показано, что первичный материал, содержал антиген аденовируса, который вызывал 100% свечение в реакции иммунофлуоресценции. При изоляции вируса из материала от больных на культуре клеток, антиген начинает выявляться на 3 сутки с последующим увеличением деструкции клеток к 7 суткам.
64
Таблица 3. Динамика накопления антигена аденовируса в культуре клеток
Исследуемый материал МФА ЦПД, сутки ПЦР
3 5 7 % положительных
первичный материал от больных (n=100) 100% н.и. н.и. н.и. н.и. 59%
культура клеток 1 пассаж н.и. + 2+ 3+ 40 92%
культура клеток 2 пассаж н.и. + 3+ 4+ 76 н.и.
культура клеток 3 пассаж 65% 2+ 4+ 4+ 80 95%
Культура клеток, зараженная вирусом гриппа А 10% н.и. н.и. н.и. н.и. 0%
Культура клеток, зараженная РС вирусом 20% н.и. н.и. н.и. н.и. 0%
Незараженная культура клеток 0% н.и. н.и. н.и. н.и. 0%
Примечание: н.и. - не исследовали
В процессе пассирования вирус выявлялся на 1, 2 и 3 пассажах с вероятностью 40%, 76% и 80% соответственно. Последний пассаж повторно подтверждали в реакции иммунофлуоресценции, где антиген аденовируса вызывал специфическое свечение в 65% случаев, что практически совпадает с выявлением вируса в клетках на 3 пассаже по цитопатическому эффекту.
Полученные результаты показали ,что при выделении вируса от больных культуральным методом в процессе пассирования происходит репродукция возбудителя в течении всех трех пассажей. Кроме этого, в первичном материале, вызывающем свечение во всех пробах (100%) ДНК аденовируса выделяли в 59% исследуемых проб. После культивирования вируса в течение 1 и 3 пассажей ДНК выделяли практически во всех пробах (92 и 95%). Гетерологичные вирусы вызывали свечение с антителами к аденовирусу в 1020% процентах случаев, что вероятно и является одной из причин гипердиагностики этой инфекции. В культуральных пробах, зараженных вирусом РС и гриппом ДНК аденовируса не выявлено, что свидетельствует о специфичности ПЦР.
В процессе репликации аденовирусов в клетке, как утверждает Филдс Б.Н. и др. [6], могут образовываться дефектные частицы, особенно среди подродов респираторной группы (группа В и С). Молекулярный дефект таких частиц состоит в неполной упаковке ДНК, но при этом такой вирион имеет полноценный капсид. Поэтому, можно предположить, что не полное совпадение результатов первичного МФА и ЦПД на культуре клеток, по-видимому, можно объяснить наличием таких частиц, которые не вызывают ЦПД на культуре клеток, но при этом могут взаимодействать с гомологичными флюоресцирующих антителами (таблица 3). Поэтому можно сказать, что при исследовании первичного материала, вероятно, происходит гипердиагностика за счет неспецифического связывания, в отличие от ПЦР.
65
В последнее время актуальным остается вопрос установления серотиповой и групповой специфичности аденовирусов, т к. зная высокое разнообразие аденовирусов по серологическому типу и способности поражать эпителий разных органов организма, было целесообразно определить долю аденовирусов группы В и С в этиологической структуре заболевания среди аденовирусной инфекции. Для подтверждения принадлежности аденовируса к группе В и С использовали праймеры описанные Metzgar D. И др. [9]. Предварительно эти праймеры проверили на специфичность (рисунок 1). В качестве контроля были взяты 3, 7 серотип (группа В) и 1, 2, 5, 6 серотипы (группа С) аденовирусов, как одни из основных серотипов вызывающие массовые заболевания в осенне-зимний период [10].
А 1 2 3 4 5 6 7 8 Б 1 2 3 4 5 6 7 8
1 — ДНК маркер молекулярной 1 — ДНК маркер молекулярной
массы, 2 — отрицательный контроль, 3 — массы, 2 — отрицательный контроль, 3 — Ad 3 серотипа, 4 - Ad 7 серотипа, 5 - Ad 1 Ad 1 серотипа, 4 - Ad 2 серотипа, 5 - Ad 5 серотипа, 6 — Ad 2 серотипа, 7 — Ad 5 серотипа, 6 — Ad 6 серотипа, 7 — Ad 3 серотипа, 8 — Ad 6 серотипа серотипа, 8 — Ad 7 серотипа
Рисунок 1 - Определение специфичности амплификации ДНК аденовируса с праймерами к группе В (А) и к группе С (Б) аденовируса
Как видно из рисунка 1, праймеры для определения аденовирусов группы В амплифицируются только с 3 и 7 серотипами аденовируса и не амплифицируются с гетерологичными серотипами. Концентрация получаемого ампликона не большая. Поэтому для увеличения количества копий ДНК в материале проводили предварительно 3 пассажа, с целью увеличения исходного титра вируса. Праймеры для определения аденовирусов группы С амплифицируются только с 1, 2, 5 и 6 серотипами аденовирус и не амплифицируются с геторологичными серотипами, что свидетельствует о специфичности выбранных праймеров.
Было получено 76 пробы с подтвержденной аденовирусной инфекцией методом МФА. Для исключения ложноотрицательных результатов пробы проверяли на наличие ДНК аденовируса всех серотипов и использовали праймеры Ad1 и Ad2 ранее нами оптимизированные [8]. При подтверждении присутствия аденовируса в пробе проводили ПЦР для определения аденовирусов группы В и С (рисунок 2).
66
□ группа В □ группа С □ не типировано
Рисунок 2 — Удельный вес вирусов группы В и С в структуре аденовирусной
инфекции
Как видно из приведенных данных, в этиологической структуре аденовирусной инфекции вирусы группы В и С составляют 32,89 и 22,37% соответственно. В общей структуре эти две группы, относящиеся к вирусам вызывающие заболевания респираторного тракта, имеют преобладающее значение среди нетипированных аденовирусов. Эти данные позволили установить соотношение группоспецифических респираторных аденовирусов, циркулирующих в г. Минске
Заключение. В процессе пассирования вируса на культуре клеток Hep-2C, аденовирус выявлялся на 1, 2 и 3 пассажах с вероятностью 40%, 76% и 80% соответственно. Диагностика аденовируса методом МФА и ПЦР в первичном материале/материале прошедшего 3 пассажа на культуре клеток составляет 100/65% и 59/95% соответственно. Серотипы группы В и С аденовирусов в структуре вызываемых ими заболевания составляли 32,89% и 22,37% соответственно
Литературные источники:
1. Гендон Ю. З. Стратегия борьбы с гриппом с помощью гриппозных вакцин / Ю. З. Гендон // Вакцинация. - 1999. - №11(5) : приложение. - С. 3-11
2. Никитина Г. Ю. Эпидемиологическая эффективность неспецифической профилактики гриппа и ОРВИ среди медицинских работников : автореф. дис. ... канд. мед. наук : 14.00.30 / Г. Ю. Никитина; [НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи]. - М.: 2001. - 33 с.
3. Зайцев, А. А. Лечение острых респираторных вирусных инфекций / А. А. Зайцев // Лечащий врач. - 2008. - № 8. - C. 42-45.
4. Климова, Ю. А. Аденовирусная и респираторно-синцитиальная инфекции у взрослых: клинико-иммунологическая характеристика / Ю. А. Климова [и др.] // Актуальные вопросы инфекционной патологии : материалы Международного Евро-Азиатского конгресса по инфекционным болезням, Витебск, 5-6 июня 2008г. / Витеб. гос. мед. ун-т ; редкол. В. М. Семенов [и др.]. - Витебск, 2008. - С. 92-93.
67
5. Орлова, С. В. Этиологическая структура заболеваемости острыми респираторными вирусными инфекциями у госпитализированных детей / С.В. Орлова [и др.] // Здравоохранение. - 2009. - № 12. - С. 14-16.
6. Benko, M. Family Adenovirideae / M. Benko [et al.] // Virus Taxonomy. Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / C.M. Fauquet [et al.]. - Elsevier Academic Ppress, New York, - 2005. - p. 213-228
7. Онищенко Г.Г. // Методические рекомендации. - Москва, 2006 г.
8. Орлова, С. В. Информативность различных методов лабораторной диагностики аденовирусной инфекции / С.В. Орлова [и др.] // Здравоохранение. - 2010. - № 12. - С. 47-51.
9. Metzgar, D. Abrupt emergence of diverse species B adenoviruses at US military recruit training centers / D. Metzgar [et al.] // J. Infect. Dis. - 2007 - p. 1465-1473.
10. Злыдников, Д. М. Острые респираторные заболевания / Д. М. Злыдников, А. А. Смородинцева. - Москва: Медицина, 1974. - 132 с.
A.A. Shtyrau, S.V. Orlova
IDENTIFICATION OF RESPIRATORY ADENOVIRUSES BY PCR
Republic research and practical centre for epidemiology and microbiology, Minsk
Summary
It’s carry out isolation of adenovirus in cells Hep-2C during 3 consecutive passages. Virus was accumulated in cells and used for identification respiratory adenoviruses by PCR, circulating in Minsk. It is shown that serotypes B and C of adenoviruses accounted for 32.8% and 22.3% respectively in the structure of diseases caused by adenoviruses.
68
