CC BY
101
Лекция
James Dekker, PhD; S. Ukraintsev
Fonterra Research Centre, Fonterra Co-operative Group Limited, Dairy Farm Road, Palmerston North, New Zealand
Probiotics revisited: new strains, new benefits, new opportunities
Author for correspondence:
Sergey Ukraintsev, M.D., Senior Research Scientist Fonterra Research Centre
Address: 11029 Palmerston North 4442, New Zealand Dairy Farm Road, Fitzherbert, Palmerston North, tel.: +64 (6) 350-46-49 ext 64691; e-mail: sergey.ukraintsev@fonterra.com Accepted: 08.12.2011 r., submitted for publication: 01.03.2012 r.
INTRODUCTION
Probiotic bacteria have become an established part of the functional food market, and are being found in a growing number of food formats with a growing number of associated health benefits. Yet challenges remain, particularly around maintaining the high consumer confidence in probiotic bacteria. Poorly characterised probiotic strains with poorly substantiated health claims mean that probiotics could lose credibility despite the wealth of evidence that specific probiotic strains can and do exert demonstrable health benefits. Thus, it is imperative that each probiotic bacterial strain is supported by clinically-relevant and peer-reviewed research.
Fonterra is the world's leading exporter of dairy products, responsible for around one third of the global dairy trade. Based in New Zealand, Fonterra is a co-operative company owned by more than 12,000 dairy farmers, and exports a wide range of dairy-based commodity and specialty products to over 140 countries. In the mid 1990's, Fonterra embarked on a program to develop proprietary probiotic strains that targeted gut health and immune enhancement benefits. Based on «classical» selection criteria, including acid and bile tolerance (to mimic conditions encountered in the human gastrointestinal tract), initial safety determination, and immune-modulating activity, a starting pool of 2000 lactic acid bacterial strains where reduced to 4 candidate probiotic bacterial strains, [1]. Of these Lactobacillus rhamnosus HN001 (trademarked as DR20) and Bifidobacterium animalis subspecies lactis HN019 (trademarked as DR10) were eventually commercialised. The on-going probiotic research and development program at Fonterra is underpinned by the FAO/WHO definition of probiotic bacteria as «live microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host» (FAO/WHO Report, 2001), [2], in that an ideal probiotic bacterial strain must be safe, provide a demonstrable health benefit, and reach the gastrointestinal tract of the consumer in a live state.
PROBIOTIC SAFETY
Safety is paramount for a functional food ingredient. While both drugs and functional foods, including probiotics, must by definition provide some kind of benefit to the consumer, the uncontrolled nature of functional food consumption means that probiotic bacteria must be shown to provide no risk to human health even when consumed in high doses. Both DR10 and DR20 have been the subject of extensive safety testing, from in vitro studies through
to randomized, double-blind placebo-controlled human clinical trials. Animal trials have consistently shown that DR10 and DR20 consumption were not associated with adverse effects on haematological, histological, and growth parameters [3-5], even at high doses, and did not show significant translocation across the gut barrier. It was also established that neither strain exacerbated the progression of an immune disease in a mouse model of experimental autoimmune thyroiditis [6], an important finding given the immune-modulating activity of the strains. Furthermore, in vitro analysis revealed that neither DR10 nor DR20 could degrade intestinal mucin or led to platelet aggregation or activation [7-8]. Both strains exhibited antibiotic resistance profiles typical of their respective species [9]. Genome sequencing of both strains found no evidence of transferable antibiotic resistance genes, or indeed any other genes commonly associated with obvious virulence or pathogenicity. Therefore, the in vitro and in vivo safety studies have consistently shown that DR10 and DR20 can be considered as non-pathogenic microorganisms and are safe for human consumption.
PROBIOTIC EFFICACY
Another important feature of probiotics is their ability to colonise, if only transiently, the human gastrointestinal tract. Human dietary intervention studies using DR10 and DR20 have shown that both strains can be recovered from the faeces, indicating that the strains can survive passage through the human gut, but do not appear to lead to permanent colonisation [10-13]. An interesting finding from the human studies was that the probiotics appeared to have prebiotic-like effects, in that both strains increased the levels of other «good» bacteria (lactobacilli and bifidobacteria). For instance, one feeding trial showed that prior to the addition of DR20 to the diet, some trial participants exhibited unstable lactobacilli populations, which were then stabilised by the presence of DR20 [10].
The Fonterra probiotic strains may also exert other benefits to the human microflora as several animal trials have provided evidence for anti-pathogen effects [14-18]. For instance, mice fed DR20 and then exposed to pathogenic E. coli strain O157:H7 showed reduced morbidity, reduced bacterial translocation, and increased markers of innate and acquired immunity compared to mice fed the pathogen only, and DR20 was able to almost completely protect mice from death due to Salmonella typhimurium infection [14]. Similarly, DR10 consumption protected weaning piglets
from rotavirus- or E. coli-associated diarrhoea associated with rotavirus or infection [16], and greatly reduced the pathogenic effects of E. coli O157:H7 and against S. typhimurium in mice [17]. While anti-pathogen effects in human subjects is more difficult to study, a recent study that provided DR20 along with Lactobacillus acidophilus to elderly subjects in a cheese format showed that the probiotic strains were able to reduce intestinal colonisation by the pathogen Clostridium difficile, an opportunistic pathogen and leading cause of antibiotic-associated diarrhoea [19].
Immune protection is seen as another important component of probiotic health benefits. Two important markers of immunity, phagocyte activity and natural killer (NK) cell function, are concerned with immune surveillance, and have been extensively studied for DR10 and DR20. Various cell types, such neutrophils, dendritic cells and macrophages, are able to engulf particulate matter such as invading pathogenic bacteria, and can alert the rest of the immune system to the presence of infectious agents or other threats [20]. In contrast, NK cells target other host cells, with their ability to recognise and kill virally-infected or tumour cells [21]. Hence both activities play vital roles in disease protection. The ability of both DR10 and DR20 to stimulate the function of both phagocytes and NK cells has been consistently shown across multiple animal studies and human feeding trials [17; 20-29]. In addition to the benefits of DR10 and DR20 on innate immunity, there is also evidence that the probiotic strains can enhance aspects of adaptive immunity, with beneficial effects on antibody responses [25]. It is interesting to note that the apparent immune effects of DR10 and DR20 are due to increased immune cell activity rather than proliferation [4-5], which suggests that the strains do not exert strong pro-inflammatory effects, as supported by some findings from human feeding trials [19].
DR10 and DR20 have both shown efficacy in gut heath outcomes. In a recent study of probiotics and intestinal barrier function, DR20 was the strongest performing probiotic from a panel of common commercial strains in an in vitro assay of gut barrier integrity [30]. There is an increasing awareness of the importance of the gut barrier function to health, and disruption to this barrier appears to have a range of detrimental effects [31-32]. Another aspect of gut health is colonic transit time. Slow transit times have been associated with irritable bowel syndrome (IBS), constipation and increased colonic cancer risk [33-35]. A recent double blind, placebo-controlled study involving DR10 in human adults has shown that DR10 can improve colonic transit time in a dose-dependent manner [36]. In addition, DR10 consumption was associated with significant improvement in self-reported gastrointestinal symptoms such as regurgitation, abdominal pain, nausea, constipation, and irregular bowel movements. These findings have important health implications as constipation and gut discomfort are common symptoms in the general population. The findings of the DR10 CTT trial are currently being confirmed in repeat human clinical trials.
The use of probiotics for paediatric applications is becoming increasingly common. This is supported by the health benefits and safety record established in adult populations, and also by the growing number of reports of lactobacilli and bifidobacteria being present in human breast milk [37-38]. This, along with studies of the infant microflora, suggests that bifidobacteria, as well as lactobacilli, are natural components of the infant microflora, and may play important roles in the neonatal gastrointestinal tract and immune system [39-40]. Even so, given the relative vulnerability
of paediatric populations, there need s to be a compelling reason to include probiotics as a normal part of the infant diet. While both DR10 and DR20 have shown consistent benefits in terms of pathogen protection, enhanced immune protection, and improved gut function and/or gut comfort in adult human populations, tangible heath benefits must still be shown in paediatric populations.
DR10 (BIFIDOBACTERIUM ANIMALIS SUBSPECIES
LACTIS HN019) HUMAN CLINICAL STUDIES
DR10 was the subject of a large randomised, double blind, and placebo-controlled study to examine the impact of DR10 and the prebiotic galacto-oligosaccharide (GOS) on measures of paediatric morbidity [41-42]. The trial involved two groups of 312 health children aged 1 to 3 years. One group received milk fortified with vitamins and minerals, while the other received the same fortified milk with added DR10 and GOS. The children received the treatments twice daily for 12 months. At the end of the 2-year follow-up period, the group fed the fortified milk with the added DR10 and GOS experienced a number of significant health benefits compared to the control group, with reduced disease risks across a range of childhood morbidities including dysentery (21%) (95% CI: 0 to 38%; p = 0.05), pneumonia (24%) (95% CI: 0 to 42%; p = 0.05), and severe-acute lower respiratory infections (35%) (95% CI: 0 to 58%; p = 0.05). This led to on overall 16% (95% CI: 5 to 26%, p = 0.004) drop in days with severe illness, a 5% (95% CI: 0 to 10%; p = 0.05) drop in febrile illness, and a 6% (95% CI: 3 to 9%; p < 0.001) in antibiotic use associated with the use of DR10 and GOS. In addition to the measures of paediatric health, the study also revealed that DR10 may also influence iron status, with the DR10 and GOS group showing a 45% (95% CI 11%, 66%; p = 0.01) reduction in the risk of anaemia and iron deficiency. Taken together, it appears that DR10 consumption can lead to several health benefits based on both improvements in gut function and immune function. While further research is required to confirm some of these findings, and to explore the underlying mechanisms of DR10's probiotic effects, there is still clear evidence of meaningful efficacy in both human adult and paediatric settings.
DR20 (LACTOBACILLUS RHAMNOSUS HN001)
HUMAN CLINICAL STUDIES
While DR10 has shown very promising efficacy in gut health, DR20 has emerged as a leading probiotic strain in the treatment or prevention paediatric allergies, especially eczema (also known as atopic dermatitis). The anti-allergy efficacy of DR20 is based mainly on a doubleblind, randomized, placebo-controlled trial that studied the role of DR10 and DR20 on infant allergy, conducted in New Zealand [43-45]. While the rates of childhood allergy have been increasing in many countries worldwide, the rates appear to be particularly high in NZ. Indeed, the incidence of eczema in 6-7 year olds measured as part of the international ISAAC study, was reported to be 27% [46-47]. The probiotic study was designed to assess eczema symptoms and severity in infants at risk of allergy (i. e. one or both parents having had a physician-diagnosed allergic disease in some point in their lives) over the first 2-years of life, and then to assess the later development of allergic disease via two follow-ups as the infants turned 4 and 6 years of age. Approximately 450 pregnant mothers were randomized to one of three groups, and received daily doses of either DR10 (9X109 CFU/day), DR20 (6X109 CFU/day), or placebo from 35 weeks gestation until birth, and for up to 6 months after birth if breastfeeding. The infants then
received the same treatment as their mother as a daily supplement from birth until 2 years of age.
For the initial 2-year study [44], eczema prevalence and severity were assessed at 3, 6, 12, 18, and 24 months according to strict diagnostic criteria, while eczema severity was assessed using the SCORAD (SCORing Atopic Dermatitis) tool. To assess atopic status, skin prick tests performed were performed on the infants at 2 years of age using common allergens (egg white, cat pelt, house dust mite, mixed grasses, peanut and cow's milk). Results of the trial revealed a dramatic drop in both eczema prevalence and severity associated with consumption of DR20. Of the infants that received DR20, only 21 out of 144 (14.6%) were diagnosed with eczema at 2 years compared with 37 out of 152 (24.3%) in the DR10 group and 40/150 (26.7%) in the placebo group. This led to an odds ratio of developing eczema in the DR20 group of 0.47 (95% CI 0.26-0.084, p = 0.01), and a number needed to treat of just 8.3. Interestingly, a beneficial effect for DR20 was also observed for eczema severity, with a significant reduction in the risk of developing a SOCRAD of at least 10 (indicating at least a mild-to-moderate level of eczema symptoms) in the DR20 group (22.9% DR20 vs. 38.7% placebo, OR = 0.47; 95% CI = 0.28-0.78) but unchanged in the DR10 group. Rates of atopic sensitisation to specific allergens as indicated by skin prick tests were not significantly different between the three groups, and proportional drop of eczema prevalence between the placebo and DR20 groups was similar between IgE- and non-IgE-associated eczema, which suggests that DR20 may act by reducing the allergic response rather than allergic sensitisation. Given this hypothesis, it was interesting to speculate whether the reduced eczema effect of DR20 could be maintained beyond the end of the treatment period, that is, whether the eczema rates in the DR20-treated group would increase back up to placebo levels after the cessation of DR20 feeding. However, results of the 4-year follow-up study clearly showed that the anti-eczema efficacy of DR20 was maintained even though the study participants had not consumed DR20 for 2 years. In the DR20 group, 27.2% (37 of 136) of children had eczema symptoms compared to 39.2% (56 of 143) of children in the placebo group (OR = 0.58; 95% CI = 0.35-0.96, p = 0.04). While the difference in the proportion of children with SCORAD & 10 between the DR20 and placebo groups was no longer statistically significant, a clear trend for reduced symptom score in the DR20 group was still evident.
As shown by several recent meta-analyses [48-49], few probiotic studies have shown significant antieczema efficacy, and even fewer studies have followed their respective study populations to examine the long term consequences of probiotic intake as infants on allergy development in childhood. A landmark study in this regard is the Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) study, which published data as the study participants reached 2, 4, and 7 years of age [50-52]. While LGG showed an initial benefit on eczema prevalence at 2 years, which was maintained at 4 and 7 years, there was a strong trend for increased rates of rhinitis and asthma in the LGG-treated group compared to controls [50-51]. While these rates did not reach statistical significance, the results are still a cause for some concern. In the case of DR20, an important part of the 4-year follow-up was the assessment of allergic disease other than eczema. The findings indicated that DR20 consumption appeared to have no affect on the
prevalence of asthma or wheeze, and resulted in reduced prevalence of rhinitis (37.5% drop in the DR20 group compared to the placebo), hay fever (42.4% drop) and rhinoconjunctivitis (61.6% drop) (results in press).
While the second follow-up study as the study participants turn 6-years of age will re-examine the rates of allergic disease, the results obtained at 2 and 4 years suggest the possibility that the benefits of DR20 for eczema prevention may extend to allergic disease in general. This hypothesis is backed up by at least three lines of evidence. First, as part of the eczema prevention trial, samples of breast milk and cord blood were taken from a subset of participants. Cord blood samples from the DR20 group had higher levels of interferon 7 than cord blood from the placebo (p = 0.03) [53]. This is significant as neonatal interferon-7 levels are associated with reduced allergy risk [54]. Second, a previous eczema treatment trial that fed a combination of DR10 and DR20 or a placebo to groups of children with pre-existing eczema showed an enhanced rate of eczema resolution for the DR10 and DR20 group, at least in the subset of children sensitized to food allergens [55]. This suggests that DR20 may have efficacy for both eczema prevention and treatment, but this will need to be supported by future human clinical trials. Third, a recent study in a pig model of allergic disease showed that DR20 treatment effectively reduced the severity of both asthma and eczema symptoms [56].
The extension of the anti-eczema benefit of DR20 beyond the initial feeding period did not appear to be due to the permanent colonisation of the infant microbiota by DR20. While there was evidence of enhanced Lb. rhamnosus colonisation in theDR20-ed group during the treatment period, the rates of colonisation by DR20-like Lb. rhamnosus stains were between the three treatment groups at 4 years.
CONCLUSIONS
A feature of the paediatric eczema study involving DR10 and DR20 was the strong focus on probiotic safety. Consumption of significant amounts of either probiotic daily from birth until 2-years of age was not associated with any increase in reported adverse events compared to the placebo group, and did not affect measures of growth even up to 4-years of age. These findings are important as the detailed analysis of probiotic safety in paediatric populations is comparatively rare. Partly based on these results, DR20 has been recognised as having «generally regarded as safe» (GRAS) status by the United States Food and Drug Administration (USFDA) for use in both adult and infant food applications.
In conclusion, the probiotic nature of DR10 and DR20 are supported by significant studies examining both the efficacy and safety of these strains. In addition, significant work has also been carried out investigating the stability of the strains in various food formats [22; 57]. While both DR10 and DR20 have shown evidence for immune protection and ant-pathogen benefits, human clinical trials have shown efficacy for DR10 for reduced constipation through improved colonic transit time in adults, and reduced infectious disease rates in children, and efficacy for DR20 in preventing allergy. It is clear from these and other studies that all probiotic strains are not equal, and that specific probiotic strains have specific benefits. On-going studies are continuing to confirm and extend the known benefits of the DR10 and DR20 probiotic strains.
nEflMATPMHECKAfl ^APMAKOflOrMfl /2012/ TOM 9/ № 2
Лекция
Дж. Деккер, С.Е. Украинцев
Научно-исследовательский центр компании Fonterra, Новая Зеландия
И снова о пробиотиках: новые штаммы, новые преимущества, новые возможности
Контактная информация:
Украинцев Сергей Евгеньевич, старший научный сотрудник научно-исследовательского центра компании Fonterra Адрес: 11029 Palmerston North 4442, New Zealand Dairy Farm Road, Fitzherbert, Palmerston North, тел.: +64 (6) 350-46-49 ext 64691; e-mail: sergey.ukraintsev@fonterra.com Статья поступила: 08.12.2011 г., принята к печати: 01.03.2012 г.
Применение пробиотиков становится все более распространенным, параллельно увеличивается и число декларируемых положительных эффектов, связанных с введением пробиотических бактерий в состав продуктов. Тем не менее, существует проблема недостаточной информированности как врачей, так и пациентов об особенностях отдельных штаммов и наличии доказательной базы их положительных эффектов. Особое значение это приобретает в питании грудных детей, где применение пробиотиков в составе продуктов также становится все более распространенным. В статье приводится информация о новых пробиотических штаммах, разработанных в Новой Зеландии, а также данные научных исследований, подтверждающих эффективность и безопасность этих штаммов.
Ключевые слова: пробиотические бактерии, пробиотики, эффективность, безопасность.
ВВЕДЕНИЕ
Пробиотические бактерии стали неотъемлемой частью рынка функционального питания, их включают в состав многочисленных продуктов, сопровождая при этом возрастающим числом декларируемых потенциальных положительных свойств для здоровья человека. Тем не менее, нерешенные вопросы остаются, включая недостаточную осведомленность потребителей о пробиотических штаммах и отсутствие у них полной уверенности в эффективности пробиотиков. Недостаточно исследованные и охарактеризованные штаммы бактерий, позиционируемые как пробиотические, с отсутствием должной доказательной базы их эффективности подрывают доверие к пробиотикам, несмотря на то, что существуют надежные штаммы с хорошо доказанными в клинических исследованиях положительными эффектами. Именно поэтому необходимо, чтобы каждый
штамм, позиционируемый как пробиотик, имел доказательства декларируемых положительных эффектов, полученных в ходе серьезных контролируемых клинических исследований.
Компания «^ог^егга» (Новая Зеландия) является крупнейшим в мире экспортером молочных продуктов, контролирующим примерно 1/3 мирового оборота этой категории товара. Foгterra представляет собой кооператив, которым совместно владеют более 12 000 молочных фермеров Новой Зеландии. В середине 90-х годов прошлого столетия в научно-исследовательском центре компании было принято решение по разработке собственных пробиотических штаммов с акцентом исследований на параметрах иммунной защиты, а также состоянии желудочно-кишечного тракта. Приняв за основу «классические» критерии селекции, включая устойчивость к соляной кислоте и желчным кислотам, а так-
James Dekker, S. Ukraintsev
Fonterra Research Centre, Fonterra Co-operative Group Limited, Dairy Farm Road, Palmerston North, New Zealand
Probiotics revisited: new strains, new benefits, new opportunities
Probiotic bacteria are being used in a growing number of food formats with an increasing number of associated health benefits. Yet challenges remain, particularly around maintaining a high consumer confidence in probiotic bacteria. It is especially important for infant nutrition, where the use of probiotics in infant formulae and complementary foods is becoming more and more common. This article provides information on new probiotic strains that were developed in New Zealand, including results from in-vitro, animal and human trials confirming the safety and efficacy of these strains.
Key words: probiotic bacteria, probiotics, efficacy, safety.
же безопасность и иммуномодулирующую активность, было выделено 2000 штаммов кисломолочных бактерий, из которых в конечном результате были отобраны 4 штамма с потенциальными свойствами пробиотиков [1]. Из них Lactobacillus rhamnosus HN001 (торговая марка DR20) и Bifidobacterium animalis subspecies lactis HN019 (торговая марка DR10) к настоящему времени коммерциализированы и выведены на рынок. Работа по исследованию новых штаммов и других положительных свойств пробиотиков базируется на мнении FA0/B03, определяющих пробиотики как «живые микроорганизмы, которые при назначении в определенном количестве оказывают положительное влияние на состояние здоровья» [2]; при этом ключевыми характеристиками пробиотических штаммов должны быть безопасность, доказанная эффективность и способность сохраняться живыми в желудочно-кишечном тракте.
БЕЗОПАСНОСТЬ ПРОБИОТИКОВ
Безопасность — основополагающая характеристика любого ингредиента продуктов питания. Хотя и медикаменты, и продукты функционального питания должны по определению обладать положительными эффектами на состояние здоровья, по сути, неконтролируемый прием продуктов функционального питания означает, что пробиотики должны быть абсолютно безопасными даже при условии их потребления в высоких дозах. Оба штамма — DR10 и DR20 стали предметом пристального внимания и многочисленных исследований для оценки их безопасности, начиная с работ in vitro и заканчивая двойными слепыми плацебо контролируемыми клиническими исследованиями.
Работы на лабораторных животных с постоянством демонстрировали, что назначение DR10 и DR20 даже в высоких дозах не сопровождалось какими-либо отрицательными эффектами, включая темпы и параметры роста, гематологические показатели и исследования гистологического материала [3-5], также не было зарегистрировано и значимой транслокации бактерий через кишечную стенку. Ни один из исследованных штаммов не приводил к прогрессированию иммунной патологии на модели мышей с индуцированным аутоиммунным тиреоидитом [6], что явилось важным критерием безопасности, учитывая иммуномодулирующую активность обоих штаммов. Анализ in vitro подтвердил, что ни DR10, ни DR20 не разрушают пристеночный муцин желудочнокишечного тракта; оба штамма также не вызывают агрегации и/или активации тромбоцитов [7, 8]. Что касается антибактериальной резистентности, то оба штамма продемонстрировали результаты, характерные для соответствующих семейств бактерий [9], при этом расшифровка генотипа обнаружила отсутствие генов, которые могли бы быть ответственными за передачу устойчивости к антибиотикам другим бактериям; также не было обнаружено и других генов, связанных с патогенностью и/или вирулентностью. Таким образом, в ходе исследований безопасности с включением работ in vitro и in vivo было установлено, что оба штамма — DR10 и DR20 — являются непатогенными и могут быть использованы в питании людей.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОБИОТИКОВ
Второй важной характеристикой пробиотиков служит их способность колонизировать (но только временно) желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека. Клинические исследования с включением в продукты штаммов DR10 и DR20 установили, что оба штамма обнаруживаются в фекалиях, свидетельствуя об их способности выживать в ЖКТ. В то же время ни DR10, ни DR20 не колонизируют желудочно-кишечный тракт перманентно [10-13]. Еще одним интересным фактом, полученным в ходе клинических исследований, стала способность исследуемых штаммов оказывать своего рода «пребиотический» эффект — применение обоих штаммов приводило к росту числа других «полезных» бактерий в кишечнике (бифидобактерий, лактобацилл) [10].
Пробиотики DR10 и DR20 способны оказывать и другие положительные эффекты на состояние ЖКТ человека. В исследованиях на лабораторных животных было установлено, что оба штамма обладают антагонистической активностью по отношению к некоторым патогенным бактериям [14-18]. Например, в группе мышей, которым давали DR20, а затем инфицировали патогенной Escherichia coli (O157:H7), животные имели более низкие показатели летальности, частоты бактериальной транслокации и повышенные показатели иммунной защиты по сравнению с группой мышей, не получавших пробиотик. В другом исследовании была установлена способность DR20 практически полностью предотвращать летальность у мышей, инфицированных Salmonella typhimurium [14]. Пробиотический штамм DR10 предотвращал у поросят развитие диареи, ассоциированной с ротавирусной инфекцией или эшерихиозом [16], а также значительно снижал патогенность E. coli (O157: H7) и S. typhimurium у мышей. Изучение антагонистической активности пробиотиков у людей — несомненно, более сложная задача. Тем не менее, в недавнем исследовании, в ходе которого пожилые люди получали сыр, обогащенный DR20 и Lactobacillus acidophilus, была установлена более низкая колонизация Clostridium difficile — оппортунистического патогена, являющегося ведущей причиной развития антибиотик-ассоциированной диареи [19].
Иммунная защита, или способность пробиотиков улучшать показатели иммунного ответа, рассматривается как еще одно важное положительное свойство пробиотиков. Два важнейших параметра иммунной защиты — фагоцитарная активность и функция клеток — натуральных киллеров (NK) — тщательно изучались в плане влияния на эти показатели пробиотических штаммов DR10 и DR20. Различные типы клеток, такие как ней-трофилы, дендритные клетки и макрофаги, способны захватывать патогенные бактерии, активизируя впоследствии иммунную систему в целом в ответ на внедрение патогена [20]. Натуральные клетки-киллеры действуют иначе — мишенью для них являются клетки собственного организма, инфицированные вирусами, или же опухолевые клетки [21]. Таким образом, оба механизма являются важными в процессе защиты организма от инфекций. Способность обоих штаммов (DR10 и DR20) усиливать фагоцитарную активность и функцию натуральных клеток-киллеров была подтверждена в многочисленных работах,
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ /2012/ ТОМ 9/ № 2
как в экспериментах на лабораторных животных, так и в клинических исследованиях [17, 20-29]. В дополнение к способности пробиотиков DR10 и DR20 улучшать показатели врожденного иммунного ответа существуют доказательства их положительного влияния на параметры приобретенного иммунитета, в частности усиление продукции антител [25]. Интересно, что иммуномоду-ляторные эффекты DR10 и DR20 связаны с усилением активности иммунных клеток, а не их пролиферацией [4, 5], что свидетельствует об отсутствии у обоих штаммов избыточной провоспалительной активности — это было подтверждено и в ходе клинических исследований [19].
И DR10, и DR20 оказывают положительное влияние на функции ЖКТ. В недавнем исследовании in vitro, посвященном изучению влияния пробиотиков на состояние барьерной функции кишечника, DR20 оказался штаммом, оказывающим наиболее выраженное положительное влияние по сравнению с другими существующими на сегодняшний день пробиотическими штаммами [30]. Важность этих данных связана с тем, что в последние годы возрастает интерес к изучению барьерной функции кишечника, поскольку установлено, что нарушение этой функции может приводить к разнообразным неблагоприятным последствиям для здоровья [31, 32]. Другим важным аспектом функции ЖКТ служит время кишечного транзита. Увеличение времени кишечного транзита связывают с развитием синдрома раздраженной толстой кишки, запорами и повышением риска развития онкологических болезней толстой кишки [33-35]. В ходе недавнего двойного слепого плацебо контролируемого исследования с применением штамма DR10 была продемонстрирована его способность дозозависимо ускорять кишечный транзит [36]. В дополнение к этому, применение DR10 приводило к достоверному улучшению симптоматики со стороны ЖКТ — установлено снижение частоты таких симптомов, как отрыжка, боль в животе, тошнота и запоры. Эти данные имеют большое практическое значение, учитывая широкую распространенность в общей популяции симптомов, связанных с нарушением функции ЖКТ. В настоящее время компанией проводятся дополнительные клинические исследования в этой области.
Использование пробиотиков у детей становится все более распространенным. Эта практика основывается не только на истории безопасного применения пробиотиков у взрослых, но и на результатах исследований, обнаруживающих бифидобактерии и лактобациллы в составе грудного молока [37, 38]. Все это вкупе с результатами изучения состава кишечной микробиоты у младенцев позволяет предположить, что бифидобактерии и лактобациллы, являясь естественными представителями кишечной микробиоты у детей, оказывают важное влияние на состояние желудочно-кишечного тракта и иммунного гомеостаза [39, 40]. Тем не менее, учитывая высокую «чувствительность» детей первого года жизни, должны быть обеспечены веские доводы для включения пробиотиков в рацион здоровых детей первого года жизни. Несмотря на доказанную эффективность DR10 и DR20 в отношении защиты от патогенов, улучшении функции ЖКТ и показателей иммунного ответа у взрослых, подобные результаты должны быть продемонстрированы и для детей.
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ DR10
(BIFIDOBACTERIUM ANIMALIS SUBSPECIES
LACTIS HN019)
DR10 был предметом изучения крупномасштабного рандомизированного двойного слепого плацебо контролируемого исследования, изучающего влияние комбинации DR10-пребиотика — галактоолигосахаридов (ГОС) на показатели заболеваемости здоровых детей [41, 42]. В исследование были включены две группы детей в возрасте от 1 до 3 лет — по 312 детей в каждой группе. Дети группы сравнения получали молоко, обогащенное витаминами и минералами; дети из группы исследования — такое же обогащенное молоко, но с дополнительным включением DR10 и ГОС. Дети обеих групп получали молоко дважды в день на протяжении 12 мес. По окончании 2-летнего периода наблюдения было установлено, что дети, получавшие молоко с DR10 и ГОС, имели достоверно более низкие показатели заболеваемости по сравнению с детьми группы сравнения, включая такие заболевания, как дизентерия — 21% (95% CI 0-38; p = 0,05), пневмония — 24% (95% CI 0-42; p = 0,05), тяжелые острые инфекционные заболевания нижних дыхательных путей — 35% (95% CI 0-58; p = 0,05). Это привело к достоверному снижению на 16% (95% CI 5-26; p = 0,004) общего числа дней с заболеваниями, на 5% — числа дней с лихорадкой (95% CI 0-10; p = 0,05), на 6% (95% CI 3-9; p < 0,001) — необходимости назначения антибактериальных препаратов в группе детей, получавших молоко с пробиотиком и ГОС. Дополнительно в ходе исследования было установлено, что DR10 может также оказывать положительное влияние на процессы всасывания из ЖКТ и усвоение железа, поскольку в группе исследования риск развития анемии и дефицита железа был снижен на 45% (95% CI 11%, 66%; p = 0,01). Таким образом, включение молока с пробиотиком и ГОС в рацион детей раннего возраста сопровождается рядом положительных эффектов на функции ЖКТ и параметры иммунной защиты. И хотя необходимы дополнительные исследования для подтверждения некоторых из полученных положительных результатов и более глубокое изучение механизмов, ответственных за их развитие, имеющиеся данные позволяют рекомендовать DR10 к применению у детей.
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ DR20
(LACTOBACILLUS RHAMNOSUS HN001)
В то время как DR10 оказывает выраженное положительное влияние на функции ЖКТ, DR20 демонстрирует эффективность в области лечения и/или профилактики аллергических болезней у детей, особенно экземы, атопического дерматита. Эффективность DR20 в отношении лечения и профилактики аллергических болезней базируется в основном на данных двойного слепого плацебо контролируемого рандомизированного исследования. Исследование проводилось в Новой Зеландии с применением обоих штаммов — DR10 и DR20 [43-45]. Частота аллергических болезней среди детей высока во всем мире, но особенно тревожные эти показатели в Новой Зеландии. Так, по результатам международного исследования ISAAC, частота встречаемости экземы сре-
ди детей в возрасте 6-7 лет в Новой Зеландии составляет 27% [46, 47]. В соответствии с дизайном нашего исследования изучалась частота и тяжесть симптомов экземы у детей из группы риска по развитию аллергии (один или оба родителя имели в течение жизни аллергические болезни, подтвержденные врачом). На первом этапе работы дети наблюдались в течение двух лет, затем частота и тяжесть аллергических болезней оценивались на четвертый и шестой годы исследования. 450 беременных женщин были рандомизированы на три группы и получали ежедневно или DR10 (9Х109 CFU/сут), или DR20 (6Х109 CFU/сут), или плацебо — с 35-й нед гестации до рождения ребенка, а затем в течение 6 мес после родов в случаях, когда дети вскармливались грудью. Дети получали такие же пробиотики или плацебо, как их матери, до возраста 2 лет.
В ходе начального этапа наблюдения в течение 2 лет [44] частота экземы оценивалась в 3, 6, 12, 18 и 24 мес с использованием строгих общепринятых диагностических критериев; тяжесть симптомов оценивалась с помощью шкалы SCORAD. Для оценки атопического статуса в возрасте 2 лет детям проводились кожные пробы (skin prick tests) с использованием наиболее распространенных аллергенов (белок куриного яйца, эпидермальный антиген кошки, клещи домашней пыли, аллергены трав, арахис, белки коровьего молока). Результаты исследования обнаружили связь потребления DR20 со значительным снижением частоты и тяжести симптомов экземы. В этой группе детей только у 21 из 144 (14,6%) был установлен диагноз «Экзема» в возрасте 2 лет по сравнению с 37 из 152 (24,3%) в группе DR10 и 40 из 150 (26,7%) — в группе плацебо. Показатель вероятности развития экземы в группе DR20 составил 0,47 (95% CI 0,26-0,084; p = 0,01), а важный статистический показатель «число детей, которым нужно назначить пробиотик, чтобы получить эффект», составил всего 8,3. Интересно, что применение DR20 ассоциировалось также с достоверным снижением тяжести симптомов экземы у детей — риск развития тяжести симптомов & 10 по шкале STORAD составил в группе DR20 22,9%, в то время как в группе плацебо — 38,7% (OR = 0,47; 95% CI 0,28-0,78). Применение DR10 не оказало значимого влияния на тяжесть симптомов экземы у детей. Частота формирования атопической сенсибилизации к отдельным аллергенам, изученная с помощью постановки кожных проб в возрасте 2 лет, не выявила существенных различий между тремя группами. В то же время пропорциональное снижение частоты встречаемости экземы между группами, получавшими DR20 или плацебо, было одинаковым как для IgE-, так и не-^Е-опосредованных вариантов экземы. Эти данные позволяют предположить, что механизм положительного влияния пробиотического штамма DR20 связан со снижением выраженности аллергического ответа, а не с риском развития сенсибилизации. Особый интерес для исследователей составляла проверка этого предположения в отдаленном наблюдении: что произойдет с частотой экземы в группе детей после того, как они перестанут получать DR20? Сохранится ли у них низкая частота заболеваемости экземой, или же показатели сравняются с группой плацебо? Результаты исследо-
вания детей в возрасте 4 лет четко продемонстрировали, что профилактический эффект штамма DR20 сохраняется и через 2 года после того, как дети перестали его получать. В группе DR20 27,2% (37 из 136) детей имели симптомы экземы в возрасте 4 лет по сравнению с 39,2% (56 из 143) — из группы плацебо ^ = 0,58; 95% С1 0,35-0,96; p = 0,04). Несмотря на то, что вероятность развития симптомов с тяжестью & 10 по шкале SCORAD в этом возрасте уже не была статистически достоверной, сохранялась четкая и выраженная тенденция к снижению тяжести симптомов экземы у детей, получавших пробиотик.
В ходе недавних метаанализов установлено [48, 49], что очень немногие пробиотические штаммы имеют доказанную достоверную профилактическую эффективность в отношении развития аллергических болезней, но еще меньшее количество штаммов исследовались в отдаленной перспективе с целью изучения их профилактической эффективности у детей в более старшем возрасте. Показательным в этой связи является исследование, в котором изучалась профилактическая эффективность L. rhamnosus GG (LGG) в отношении риска развития аллергических болезней у детей. Опубликованы результаты исследования у детей в возрасте 2,4 и 7 лет [50-52]. Первоначально была продемонстрирована эффективность LGG в отношении риска развития экземы у детей в возрасте 2 лет, сохранявшаяся в возрасте 4 и 7 лет, но также была зарегистрирована стойкая тенденция к увеличению частоты аллергического ринита и бронхиальной астмы среди детей, получавших LGG, по сравнению с группой контроля [50, 51]. И хотя различия в частоте развития аллергического ринита и бронхиальной астмы не достигли статистически значимых величин, эти результаты настораживают.
В случае с DR20 важной частью исследования детей в возрасте 4 лет было определение частоты не только экземы, но и других аллергических болезней. В результате было установлено, что применение штамма DR20 не влияло на частоту встречаемости бронхиальной астмы, но снижало (по сравнению с группой плацебо) частоту аллергического ринита на 37,5%, сенной лихорадки — на 42,4%, аллергического риноконъюнктиви-та — на 61,6% (результаты в печати).
В ходе дальнейшего анализа заболеваемости детей в возрасте 6 лет будут установлены новые данные, но результаты наблюдения за детьми в возрасте 2 и 4 лет позволяют сделать вывод, что профилактическая активность DR20 не ограничивается только экземой, а распространяется и на другие аллергические заболевания, характерные для детей более старшего возраста. Эта уверенность исследователей базируется как минимум на трех линиях доказательств.
Во-первых, в ходе обсуждаемого исследования были отобраны образцы грудного молока и пуповинной крови от матерей из всех трех групп. В пуповинной крови матерей, получавших DR20, была обнаружена достоверно более высокая концентрация интерферона у (^ у) по сравнению с группой плацебо ф = 0,03) [53]. Это чрезвычайно важно, поскольку более высокие уровни ^ у в пуповинной крови ассоциируются
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ /2012/ ТОМ 9/ № 2
со снижением риска развития аллергии у детей [54]. Во-вторых, в другом исследовании, в ходе которого комбинация штаммов DR10 и DR20 или плацебо назначались детям с уже существующей экземой, было установлено более быстрое разрешение симптомов экземы в группе пробиотиков по сравнению с группой плацебо, по крайней мере, среди детей, сенсибилизированных к пищевым аллергенам [55]. Необходимы дополнительные исследования с целью подтверждения эффективности DR20 не только для профилактики, но и для лечения аллергических болезней.
В-третьих, в недавнем исследовании на модели лабораторных животных была установлена эффективность DR20 в отношении снижения тяжести симптомов бронхиальной астмы и экземы [56].
Профилактическая эффективность штамма DR20, сохраняющаяся и после окончания приема детьми этого пробиотика, не связана с перманентной колонизацией им ЖКТ, что было подтверждено изучением микробиоты у детей в возрасте 4 лет из всех трех групп, принимавших участие в исследовании.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Одним из важнейших аспектов в исследовании профилактической эффективности штаммов DR10 и DR20 у детей была безопасность исследуемых штаммов. Применение значительных доз пробиотиков с рождения и до 2-летнего возраста не сопровождалось увеличением частоты каких-либо побочных эффектов по сравнению с группой плацебо, а параметры роста детей из групп исследования сохранялись в пределах физиологических норм и в возрасте 4 лет. Эти результаты крайне важны,
учитывая тот факт, что данные по исследованию безопасности пробиотиков у детей встречаются в литературе относительно редко. Благодаря достаточной доказательной базе, United States Food and Drug Administration (USFDA) присвоили штамму DR20 статус GRAS (безусловно безопасный) для использования и у взрослых, и у детей.
Оба штамма — и DR10, и DR20 имеют все основания называться пробиотиками, учитывая мощную современную научную доказательную базу их эффективности и безопасности. Дополнительно ведутся серьезные исследования по изучению стабильности обоих штаммов в различных форматах продуктов (жидкие, сухие, йогурты, сыры и т. д.) [22, 57]. Оба штамма (DR10 и DR20) обладают доказанной способностью улучшать параметры иммунного ответа и антагонистической активностью в отношении патогенов. В ходе клинических исследований установлена способность DR10 ускорять время кишечного транзита у взрослых, снижая частоту запоров, а также снижать частоту некоторых инфекционных заболеваний у детей. Изучение штамма DR20 выявило его способность достоверно снижать риск аллергических болезней у детей. Совершенно очевидно из этих и других данных, что не существует одинаковых пробиотических штаммов, и каждый отдельный штамм имеет особые, только ему присущие положительные свойства. Продолжающиеся в компании «Fonterra» исследования направлены на детальное изучение уже имеющихся и открытие других положительных свойств пробиотических штаммов DR10 и DR20 — новых для российского рынка и, безусловно, заслуживающих внимания специалистов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Prasad J., Gill H. S., Smart J., Gopal P. K. Selection and characterisation of Lactobacillus and Bifidobacterium strains for use as probiotics. International Dairy Journal. 1998; 8: 993-1002.
2. FAO/WHO. 1-34 Joint food and agriculture organization of the united nations and world health organization working group. Cordoba, Argentina. 2001.
3. Zhou J. S. et al. Acute oral toxicity and bacterial translocation studies on potentially probiotic strains of lactic acid bacteria. Food Chem Toxicol. 2000; 38: 153-161.
4. Zhou J. S. et al. Safety assessment of potential probiotic lactic acid bacterial strains Lactobacillus rhamnosus HN001, L. acidophilus HN017 and Bifidobacterium lactis HN019 in BALB/c mice. Int J Food Microbiol. 2000; 56: 87-96.
5. Shu Q. et al. Probiotic lactic acid bacteria (Lactobacillus acidophilus HN017, Lactobacillus rhamnosus HN001 and Bifidobacterium lactis HN019) have no adverse effects on the health of mice. International Dairy Journal. 1999; 9: 831-836.
6. Zhou J. S., Gill H. S. Immunostimulatory probiotic Lactobacillus rhamnosus HN001 and Bifidobacterium lactis HN019 do not induce pathological inflammation in mouse model of experimental autoimmune thyroiditis. International Journal of Food Microbiology. 2005; 103: 97-104.
7. Zhou J. S., Gopal P K., Gill H. S. Potential probiotic lactic acid bacteria Lactobacillus rhamnosus (HN001), Lactobacillus acidophilus (HN017) and Bifidobacterium lactis (HN019) do not degrade gastric mucin in vitro. Int J Food Microbiol. 2001; 63: 81-90.
8. Zhou J. S., Rutherfurd K. J., Gill H. S. Inability of probiotic bacterial strains Lactobacillus rhamnosus HN001 and Bifidobacterium lactis HN019 to induce human platelet aggregation in vitro. J Food Prot. 2005; 68: 2459-2464.
9. Zhou J. S., Pillidge C. J., Gopal P K., Gill H. S. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. International Journal of Food Microbiology. 2005; 98: 211-217.
10. Tannock G. W. et al. Analysis of the fecal microflora of human subjects consuming a probiotic product containing Lactobacillus rhamnosus DR20. Applied and Environmental Microbiology. 2000; 66: 2578-2588.
11. Gopal P K., Sullivan P A., Smart J. B. Utilisation of galacto-oligosaccharides as selective substrates for growth by lactic acid bacteria including Bifidobacterium lactis DR10 and Lactobacillus rhamnosus DR20. International Dairy Journal. 2001; 11: 19-25.
12. Walter J. et al. Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella species in human feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol. 2001; 67: 2578-2585.
13. Gopal P. K., Prasad J., Gill H. S. Effects of the consumption of Bifidobacterium lactis HN019 (DR10TM) and galacto-oligosaccharides on the microflora of the gastrointestinal tract in human subjects. Nutrition Research. 2003; 23: 1313-1328.
14. Gill H. S., Shu Q., Lin H. et al. Protection against translocating Salmonella typhimurium infection in mice by feeding the immuno-enhancing probiotic Lactobacillus rhamnosus strain HN001. Med Microbiol Immunol (Berl). 2001; 190: 97-104.
15. Gopal P K., Prasad J., Smart J., Gill H. S. In vitro adherence properties of Lactobacillus rhamnosus DR20 and Bifidobacterium lactis DR10 strains and their antagonistic activity against an enterotoxigenic Escherichia coli. Int J Food Microbiol. 2001; 67: 207-216.
16. Shu Q., Qu F., Gill H. S. Probiotic treatment using Bifidobacterium lactis HN019 reduces weanling diarrhea associated with rotavirus and Escherichia coli infection in a piglet model. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001; 33: 171-177.
17. Shu Q., Gill H. S. A dietary probiotic Bifidobacterium lactis (HN019) reduces the severity of Escherichia coli O157: H7 infection in mice. Medical Microbiology and Immunology. 2001; 189: 147-152.
18. Shu Q., Gill H. S. Immune protection mediated by the probiotic Lactobacillus rhamnosus HN001 (DR20) against Escherichia coli O157: H7 infection in mice. FEMS Immunol Med Microbiol. 2002; 34: 59-64.
19. Lahtinen S. et al. Probiotic cheese containing Lactobacillus rhamnosus HN001 and Lactobacillus acidophilus NCFM modifies subpopulations of fecal lactobacilli and Clostridium difficile. AGE. 2011; 1-11.
20. Gill H. S., Rutherfurd K. J., Cross M. L. Dietary probiotic supplementation enhances natural killer cell activity in the elderly: an investigation of age-related immunological changes. J Clin Immunol. 2001; 21: 264-271.
21. Sheih Y. H., Chiang B. L., Wang L. H. et al. Systemic immunity-enhancing effects in healthy subjects following dietary consumption of the lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus HN001. J Am Coll Nutr. 2001; 20: 149-156.
22. Ibrahim F. et al. Probiotics and immunosenescence: cheese as a carrier. FEMS Immunology Medical Microbiology. 2010; 59: 53-59.
23. Chiang B. L., Sheih Y. H., Wang L. H. et al. Enhancing immunity by dietary consumption of a probiotic lactic acid bacterium (Bifidobacterium lactis HN019): optimization and definition of cellular immune responses. Eur J Clin Nutr. 2000; 54: 849-855.
24. Arunachalam K., Gill H. S., Chandra R. K. Enhancement of natural immune function by dietary consumption of Bifidobacterium lactis (HN019). Eur J Clin Nutr. 2000; 54: 263-267.
25. Gill H. S., Rutherfurd K. J., Prasad J., Gopal P K. Enhancement of natural and acquired immunity by Lactobacillus rhamnosus (HN001), Lactobacillus acidophilus (HN017) and Bifidobacterium lactis (HN019). British Journal of Nutrition. 2000; 83: 167-176.
26. Gill H. S., Rutherfurd K. J. Viability and dose-response studies on the effects of the immunoenhancing lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus in mice. Br J Nutr. 2001; 86: 285-289.
27. Gill H. S., Rutherfurd K. J. Immune enhancement conferred by oral delivery of Lactobacillus rhamnosus HN001 in different milk-based substrates. Journal of Dairy Research. 2001; 68: 611-616.
28. Gill H. S., Rutherfurd K. J. Probiotic supplementation to enhance natural immunity in the elderly: effects of a newly characterized immunostimulatory strain Lactobacillus rhamnosus HN001 (DR20 (TM)) on leucocyte phagocytosis. Nutrition Research. 2001; 21: 183-189.
29. Gill H. S., Rutherfurd K. J., Cross M. L., Gopal P K. Enhancement of immunity in the elderly by dietary supplementation with the probiotic Bifidobacterium lactis HN019. Am J Clin Nutr. 2001; 74: 833-839.
30. Anderson R. C., Cookson A. L., McNabb W. C. et al. Lactobacillus plantarum DSM 2648 is a potential probiotic that enhances intestinal barrier function. FEMS Microbiology Letters. 2010; 309: 184-192.
31. Rescigno M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 2011; 32: 256-264.
32. Cereijido M. et al. New diseases derived or associated with the tight junction. Archives of Medical Research. 2007; 38: 465-478.
33. Maruti S. S., Lampe J. W., Potter J. D. et al. Prospective study of bowel motility and related factors on breast cancer risk. Cancer Epidemiology Biomarkers Prevention. 2008; 17: 1746-1750.
34. Lewis S. J., Heaton K. W. The metabolic consequences of slow colonic transit. Am J Gastroenterol. 1999; 94: 2010-2016.
35. Rao S. S. C. et al. Evaluation of gastrointestinal transit in clinical practice: position paper of the american and european neurogastroenterology and motility societies. Neurogastroenterology Motility. 2011; 23 (1): 8-23.
36. Waller P A. et al. Dose-response effect of Bifidobacterium lactis HN019 on whole gut transit time and functional gastrointestinal symptoms in adults. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 2011; 46: 1057-1064.
37. Collado M. C., Delgado S., Maldonado A., Rodriguez J. M. Assessment of the bacterial diversity of breast milk of healthy women by
quantitative real-time PCR. Letters in Applied Microbiology. 2009; 48: 523-528.
38. Martin R., Heilig G. H. J., Zoetendal E. G. et al. Diversity of the Lactobacillus group in breast milk and vagina of healthy women and potential role in the colonization of the infant gut. Journal of Applied Microbiology. 2007; 103: 2638-2644.
39. Sjogren Y. M. et al. Influence of early gut microbiota on the maturation of childhood mucosal and systemic immune responses. Clinical Experimental Allergy. 2009; 39: 1842-1851.
40. Penders J. et al. Factors influencing the composition of the intestinal microbiota in early infancy. Pediatrics. 2006; 118: 511-521.
41. Sazawal S. et al. Prebiotic and probiotic fortified milk in prevention of morbidities among children: community-based, randomized, double-blind, controlled trial. PLoS ONE. 2010; 5 (8): 12164.
42. Sazawal S. et al. Effect of fortification of milk with probiotic Bifidobacterium lactis Hn019 (Dr-10) and galacto-oligosaccharides on growth and development of children 1-4 years — a double masked randomized controlled trial. Journal Pediatric Gastroenterology Nutrition. 2004; 39: 479.
43. Dekker J. W. et al. Safety aspects of probiotic bacterial strains Lactobacillus rhamnosus HN001 and Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 in human infants aged 0-2 years. International Dairy Journal. 2009; 19: 149-154.
44. Wickens K. et al. A differential effect of 2 probiotics in the prevention of eczema and atopy: a double-blind, randomized, placebo-controlled trial. Journal Allergy Clinical Immunology. 2008; 122: 788-794.
45. Prescott S. L. et al. Supplementation with Lactobacillus rhamnosus or Bifidobacterium lactis probiotics in pregnancy increases cord blood interferon-gamma and breast milk transforming growth factor-beta and immunoglobin A detection. Clinical Experimental Allergy. 2008; 38: 1606-1614.
46. Asher M. I. et al. Worldwide time trends in the prevalence of symptoms of asthma, allergic rhinoconjunctivitis, and eczema in childhood: ISAAC phases one and three repeat multicountry crosssectional surveys. Lancet. 2006; 368: 733-743.
47. Williams H. et al. Worldwide variations in the prevalence of symptoms of atopic eczema in the international study of asthma and allergies in childhood. Journal Allergy Clinical Immunology. 1999; 103: 125-138.
48. Joohee L., David S., Leonard B. Metaanalysis of clinical trials of probiotics for prevention and treatment of pediatric atopic dermatitis. Journal Allergy Clinical Immunology. 2008; 121: 116-121.
49. Boyle R. J., Bath-Hextall F. J., Leonardi-Bee J. et al. Probiotics for the treatment of eczema: a systematic review. Clinical Experimental Allergy. 2009; 39: 1117-1127.
50. Kalliomaki M., Salminen S., Poussa T., Isolauri E. Probiotics during the first 7 years of life: A cumulative risk reduction of eczema in a randomized, placebo-controlled trial. Journal Allergy Clinical Immunology. 2007; 119: 1019-1021.
51. Kalliomaki M., Salminen S., Poussa T. et al. Probiotics and prevention of atopic disease: 4-year follow-up of a randomised placebo-controlled trial. Lancet. 2003; 361: 1869-1871.
52. Kalliomaki M. et al. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial. Lancet. 2001; 357: 1076-1079.
53. Prescott S. L. et al. Supplementation with Lactobacillus rham-nosus or Bifidobacterium lactis probiotics in pregnancy increases cord blood interferon-g and breast milk transforming growth factor-b2 and immunoglobin A detection. Clin Exp Allergy. 2008; 38 (10): 1606-1614.
54. Herberth G. et al. Reduced IFN-y- and enhanced IL-4-producing CD4+ cord blood T cells are associated with a higher risk for atopic dermatitis during the first 2 yr of life. Pediatric Allergy Immunology. 2010; 21: 5-13.
55. Sistek D. et al. Is the effect of probiotics on atopic dermatitis confined to food sensitized children? Clinical Experimental Allergy. 2006; 36: 629-633.
56. Thomas D. J. et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 attenuates allergy development in a pig model. PLoS ONE. 2011.
57. Shah N. P, Ding W. K., Fallourd M. J., Leyer G. Improving the stability of probiotic bacteria in model fruit juices using vitamins and antioxidants. Journal Food Science. 2010; 75: 278-282.
nEflMATPMHECKAfl ^APMAKOflOrMfl /2012/ TOM 9/ № 2
