CC BY
52
ХР0Н0ИН0ТР0ПНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОЛИРОВАННОГО ПО ЛАНГЕНД0РФ1 СЕРДЦА КРЫСЫ
УДК 616.12.001.57-07 Поступила 1.02.2012 г.
А.В. Дворников, к.б.н., старший научный сотрудник ЦНИЛ НИИ ПФМ1; Ч.К. Чан, профессор, научный сотрудник лаборатории сложных систем2
Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород, 603005, пл. Минина и Пожарского, 10/1;
2Институт физики, Академия Синика, Тайпей, Тайвань, Китайская народная республика, 11529, Academia Rd. Sec. 2, 127
Если здоровое сердце на ускорение ритма отвечает увеличением сократимости, то при сердечной недостаточности развивается отрицательная зависимость сила-частота. В экспериментальных условиях на изолированном сердце крысы можно получить как отрицательную, так и положительную хроноинотропную зависимость. Переходному процессу при переключении частот ранее не уделялось должного внимания, а зависимость сила-частота рассматривалась преимущественно с позиций стационарного состояния.
Цель исследования — изучить хроноинотропную зависимость на перфузируемом сердце крысы с точки зрения переходного процесса и изменений экспериментальных условий, выявить влияние концентрации кальция в перфузируемом растворе на динамику переходного процесса и, как следствие, на знак зависимости сила-частота.
Материалы и методы. На изолированных сердцах 15 самцов крыс линии Wistar, перфузируемых по Лангендорфу раствором Креб-са-Хензелейта (КХ) с разной концентрацией кальция ([Ca2+]o), продемонстрировано влияние экспериментальных условий на зависимость сила-частота.
Результаты. Установлено, что переходный период при переключении частот стимуляции имеет двухфазную структуру, где выделяют первый (B1) и экстремальный (Bex) удары (сокращения). Переходный период при переключении частот может быть достаточно долгим (иногда более 180-300 с), поэтому длительность стимуляции часто имеет решающее значение. При перфузии раствором КХ для сердца крысы отрицательная хроноинотропия (для сократимости на 60-й секунде — B60c) модулируется внешним [Ca; параметры сократимости во время переходного периода B1 и Bex более чувствительны к экспериментальным условиям. Увеличение уровня внутриклеточного Са2+ с помощью уабаина (50 мкмоль) не приводит к изменениям отношений сила-частота.
Заключение. В перфузируемом растворе в зависимости от концентрации кальция меняется динамика переходного процесса при переключении частот и, как следствие, знак частотно-силовых взаимоотношений. Внутриклеточный кальций незначительно влияет на частотно-силовые взаимоотношения.
Ключевые слова: сердечная сократимость, хроноинотропная зависимость, изолированное сердце, динамика переходного процесса.
English
Chronoinotropic effects in Langendorff perfused rat heart
A.V. Dvornikov, PhD, Senior Research Worker, Central Scientific Research Laboratory of Scientific Research Institute
of Applied and Fundamental Medicine1;
C.K. Chan, Professor, Research Fellow, Laboratory of Complexity2
1Nizhny Novgorod State Medical Academy, Minin and Pozharsky Square, 10/1, Nizhny Novgorod, Russian Federation, 603005;
institute of Physics, Academia Sinica, Academia Rd. Sec. 2, 127, Taipei, Taiwan, Republic of China, 11529
Для контактов: Дворников Алексей Викторович, тел. раб. 8(831)465-43-33, факс 8(831)465-42-81, тел. моб. +7 950-352-82-51; e-mail: alexey.dvor@gmail.com
If healthy heart responds by an increase of contractility to the acceleration of rhythm then negative force-frequency relationship (FFR) is developed in failed heart. In experimental conditions in perfused rat heart it is possible to obtain the positive as well as negative FFR. Transient force response has been poorly described in details, but FFR have been considered mostly as steady state phenomenon.
The aim of the investigation was to study FFR in whole rat heart under different experimental conditions using analysis of force transient response; to study the effect of different extracellular calcium concentrations on force transition dynamics, and hence the resulting sign of chrono-inotropic relation.
Materials and methods. On total of 15 Langendorff perfused hearts obtained from Wistar rats, we demonstrated different calcium concentrations ([Ca2+]o) in Krebs-Henseleit buffer to be able to affect FFR in these hearts.
Results. There was found that the transient responses have biphasic structure, where first beat (B,) and extremum beat (Bex) can be found. The transient response after step pacing period change can be rather long (sometimes more than 180-300 s); and one should be careful when choosing the duration of pacing protocols. The negative FFR (at 60 s — B60s) is easily modulated by external [Ca2+]o and the parameters of force transient response B, and Bex are more sensitive (then B60s) to experimental conditions. The increase of intracellular Ca2+ with the help of Ouabain (50 uM) does not affect chrono-inotropic relations in perfused heart of rats.
Conclusion. Calcium concentration in perfusion solution was found to be able to affect the dynamics of force transient response after step change in pacing frequency and change the resulting sign of FFR. Intracellular calcium does not significantly change the sign of chrono-inotropic relations.
Keywords: cardiac contractility, force-frequency relationships, isolated heart, force transient response.
Здоровое сердце на увеличение частоты ритма отвечает увеличением силы сокращений, т.е. проявляет положительную зависимость сила-частота. При сердечной недостаточности увеличение ритма сокращений ведет к прогрессивному снижению сократимости — отрицательной зависимости сила-частота [1, 2]. В условиях физической нагрузки или эмоционального напряжения больное сердце не способно адекватно поддерживать высокий уровень насосной функции.
Положительная хроноинотропная зависимость, или так называемая лестница, была впервые продемонстрирована Боудичем в 1871 г. на сердце лягушки, а впоследствии показана на препаратах кролика, собаки, морской свинки. Препараты сердца крысы, наоборот, во многих экспериментальных работах проявляли отрицательную зависимость сила-частота [3, 4]. Есть мнение [5, 6], что сердца мелких млекопитающих в состоянии покоя демонстрируют высокий ритм вследствие присущей только им особенности циркуляции кальция. Неадекватная перфузия при высокой частоте стимуляции в эксперименте может приводить к ишемии тканей и отрицательной зависимости [7, 8]. В ряде работ на препаратах сердца крысы и на целом сердце получена положительная зависимость [9-12].
Внешний кальций сильно влияет на силу сокращений сердца и способен менять знак частотно-силовых взаимоотношений [4, 12]. Ряд авторов [13, 14] свидетельствуют о насыщении кальцием и даже о перегрузке сердечного ритма при высоком уровне внешнего Са2+ (от 2,5 ммоль) и в результате — об отрицательной хроноинотропии. Другие авторы [4] получили доказательства повышения способности сердечного ритма к аккумуляции кальция при снижении [Са2+]0.
Ответ сократимости сердца на изменение частоты стимуляции всегда сопровождается кратковременным колебанием как силы сокращений, так и концентрации внутриклеточного кальция, что отмечено во многих работах [5, 7, 12]. Однако самому переходному процессу никогда не уделялось должного внимания, а зависимость сила-частота рассматривалась преимущественно с позиций стационарного состояния.
Цель исследования — изучить хроноинотропную зависимость на перфузируемом сердце крысы с точки зрения переходного процесса и влияния изменений экспериментальных условий, выявить, как концентрация кальция в перфузируемом растворе меняет динамику переходного процесса и, как следствие, знак зависимости сила-частота.
Материалы и методы. Настоящее исследование выполнено в соответствии с нормами этических комитетов Нижегородской государственной медицинской академии (Россия) и Академии Синика (Тайвань), а также с Рекомендациями по работе с лабораторными животными Национального института здоровья США
[15].
Установка Лангендорфа. 15 самцов крыс линии Wistar (250-300 г) были наркотизированы Золети-лом (10 мг/кг, внутрибрюшинно), гепаринизированы (500 МЕ, внутрибрюшинно), сердца были быстро извлечены и помещены в холодный раствор (0°С) Кребса-Хензелейта (КХ). Раствор КХ содержал (в миллимолях): NaCl — 18; KCl — 4,7; CaCl2 — 2,4; MgSO4-7H2O — 1,5; KH2PO4 — 1,2; NaHCO3 — 20 и глюкозы — 10. Изолированные сердца перфузировались на установке Лангендорфа (Radnoti, США) оксигенированным (95% O2, 5% CO2) раствором КХ при 37°C и pH=7,3-7,4. Осуществлялась гравитационная ретроградная перфузия под постоянным гидростатическим давлением 80 см вод. ст. Для снижения автоматии сердца предсердия (и синоат-риальный узел) удаляли, а атриовентрикулярный узел разрушали инъекцией формалина (0,05 мл 10% раствора). Для воспроизведения кальциевой перегрузки
[16] в экспериментах использовали уабаин производства Sigma (США).
Запись внутрижелудочкового давления. Латекс-ный баллончик, заполненный водой, помещали в полость левого желудочка, при этом конечно-диастоли-ческое давление устанавливалось на уровне 10-20 мм рт. ст. Изменения внутрижелудочкового давления (LVP) при изоволюмическом режиме регистрировали при помощи датчика давления модели MPX5050D (Freescale, США). По кривой LVP подсчитывали максимальное
(систолическое) давление в левом желудочке (LVPmax), а по производной сигнала рассчитывали максимальную скорость сокращения левого желудочка (+dP/dTmax) как основной параметр сократимости изолированного сердца. Сигналы записывали на АЦП NI-6221 (National Instruments, USA) при помощи программы PowerGraph Professional (версия 3.3.7, Россия).
Стимуляция. Сердца стимулировали биполярными электродами-крючками из нержавеющей стали, размещенными на межжелудочковой перегородке со стороны эндокарда правого желудочка. Программируемую стимуляцию выполняли с помощью изолированного стимулятора модели 2100 (A-M Systems, США) и программного обеспечения IDL. Стимуляцию производили электрическими прямоугольными импульсами длительностью 1 мс и силой, в два-три раза превышающей пороговую. Для получения лестницы использовали повышающие и понижающие протоколы. В каждом цикле (обычно 60 с) период стимуляции (Т) увеличивался или уменьшался с шагом 20 мс.
Обработка данных. Данные выражались как среднее±SEM. Сравнение групп велось с использованием теста ANOVA, для внутригрупповых сравнений применяли критерий Вилкоксона. Отличия считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты.
Ответ сократимости на изменение ритма сердца (переходныйпериод). Получено два противоположных ответа нормализованного давления в левом желудочке сердца на замедление и ускорение ритма стимуляции (рис. 1). При изменении периода стимуляции сократимость не сразу устанавливается на определенном уровне, всегда наблюдается двухфазный переходный период. Например, при увеличении периода сила первого сокращения B1 после изменения частоты во всех случаях выше в сравнении с предшествующим уровнем B0. После усиленного первого удара наблюдается быстрое
Рис. 1. Типичные примеры ответов сократимости изолированного сердца на переключение периодов стимуляции Т; [Са2+]0=2,5 ммоль. Нормализованное систолическое давление LVPmax относительно ударов; переключение со 150 мс на 10, 20 и 30% в обе стороны
уменьшение сократимости: LVPmax падает к некоторому минимальному (экстремальному) уровню (Вех), который обычно ниже предшествующего В0 и затем возрастает опять. Падение силы ниже предшествующего значения В0 характеризует отрицательный овершут (Вех-В0). После переходного периода сократимость стремится к некоему стационарному уровню В33, характерному для нового периода стимуляции. Для укорочения периода стимуляции (ускорение) картина переходного периода симметрична вышеописанной (см. рис. 1).
Зависимость от длительности стимуляции. Для оценки влияния длительности стимуляции на хро-ноинотропную зависимость мы провели ряд экспериментов при стимуляции сердца с разной длительностью протоколов (рис. 2). Установлено, что даже при стимуляции длительностью 180-300 с (5 мин) одной частотой при [Са2+]0=1 ммоль в сократимости наблюдается некий тренд. Если же переключать частоты каж-
о
£ £ 5
х ч Е
-и
■о Q.
1800-
1200
В180с В240с В300с
80-
60-
40-
20-
280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 мс
20
40 60 б
80
100
t, с
Рис. 2. Влияние длительности стимуляции I на сократимость: а — максимальная скорость сокращения в левом желудочке ^РМтах); переключение — 120-140 мс, длительность стимуляции — 300 с, [Са2+]0=1 ммоль; б — лестница левожелудоч-кового давления ^Р), переключения — 280-100 мс с шагом 20 мс каждые 10 с; стрелками показаны моменты переключений
а
дые 10 с, то каждое переключение будет совпадать с переходным периодом и результат может быть как положительным, так и отрицательным, в зависимости от частоты (рис. 2, а). Это наглядно демонстрирует рис. 2, б: при переключении периодов стимуляции в сторону ускорения очень легко получить лестницу положительной хроноинотропной зависимости в диапазоне 280-160 мс (шаг — 20 мс). При стимуляции с периодом 140-100 мс падение сократимости после Вех становится быстрее, что приводит к отрицательной хроноинотропии. Если же посмотреть результаты 60-секундных протоколов, хроноинотропная зависимость будет отрицательной во всем диапазоне (рис. 3, а). Исходя из этого мы посчитали целесообразным использовать в качестве параметра сократимости не В33 (стационарное состояние), а сократимость сердца на определенной секунде после смены периода стимуляции, например В60с.
Влияние концентрации кальция в растворе. Для оценки влияния концентрации внеклеточного кальция на зависимость сила-частота мы использовали растворы КХ с разной концентрацией Са2+. Известно, что концентрация кальция в растворе КХ является завы-
шенной (2,5 ммоль), в плазме крови крыс она колеблется около 1 ммоль [17]. Рис. 3, а демонстрирует результаты применения протоколов стимуляции в виде отрицательной хроноинотропной зависимости В60с, которая не чувствительна к направлению изменения периода стимуляции. Следует отметить, что величина dP/dtmax изменяется почти линейно с изменением периода. Так, значение В60с падало в сумме на 27% (р<0,001) при уменьшении периода стимуляции с 180 до 100 мс. При увеличении периода со 100 до 180 мс (замедлении) сила сокращений повышалась и значение dP/dtmax возрастало на 48% (р=0,0002). При использовании теста ANOVA не отмечено статистически значимых отличий между протоколами. В ходе анализа хроноинотропной зависимости изолированного сердца при перфузии стандартным раствором КХ во время переходного периода после изменения периода стимуляции, а именно первого удара В1 и экстремального удара Вех (рис. 3, б), выявлено, что для всех параметров сократимости сохраняется отрицательная зависимость сила-частота.
На рис. 3, в изображены хроноинотропные зависимости для раствора КХ, который содержит 1 ммоль
Рис. 3. Зависимость сила-период при перфузии изолированного сердца крысы стандартным раствором Кребса-Хензелейта с [Са2+]0=2,5 ммоль и 1 ммоль при изменении периодов стимуляции Т в диапазоне 100-180 мс: а — сократимость (СРМтах) на 60-й секунде стимуляции (В60с), [Са2+]0=2,5 ммоль; б — сократимость первого (В,) и экстремального (Вех) ударов, [Са2+]0=2,5 ммоль; в — сократимость (СРМтах) на 60-й секунде стимуляции, [Са2+]0=1 ммоль; г — сократимость первого (В1) и экстремального (Вех) ударов, [Са2+]0=1 ммоль; стрелками показаны направления изменения периодов
Са2+. Сердце на фоне сниженного уровня кальция в растворе развивает меньшую силу, что является вполне закономерным результатом. Например, значение сократимости B60c снижено на 40% в сравнении с группой 2 ммоль Са2+ при периоде стимуляции 180 мс (р<0,0001). Хроноинотропная зависимость в данной серии экспериментов была близкой к нулю. В переходном периоде выявлена более сложная зависимость (рис. 3, г). При ускорении ритма (стрелка влево) хроноинотропная зависимость для Bex близка к нулю, тогда как значение В1 проявляет отрицательную зависимость. Во время замедления ритма величина Bex проявляла независимость от периода стимуляции, а зависимость B1 от него становилась положительной. Таким образом, параметры переходного периода являются более чувствительными к уровню внешнего кальция.
Влияние уабаина. При перфузии сердца крысы раствором КХ с уабаином (50 мкмоль) наблюдалась отрицательная зависимость сила-частота (рис. 4, а), как и в случае с обычным раствором КХ. Перфузия с уабаином сопровождалась повышенной восприимчивостью сердца к желудочковым тахиаритмиям, что наблюдалось почти во всех препаратах в условиях электрической стимуляции. ANOVA-тест не выявил статистически значимых отличий параметров хроноинотропной зависимости для контрольного раствора КХ и перфузии с уабаином. Однако, если рассмотреть переходный период в деталях (рис. 4, б), можно заметить, что уабаин изменяет относительную величину овер-шута для обоих протоколов и замедляет сам переходный процесс.
обсуждение. Несмотря на то, что открытие Бо-удича было сделано более 140 лет назад, механизмы отрицательных частотно-силовых взаимоотношений до сих пор остаются предметом дискуссий. Наши эксперименты на изолированных сердцах крыс и перфузии по Лангендорфу показали, что при использовании стандартного раствора Креб-са-Хензелейта с [Са2+]о=2,5 ммоль наблюдается отрицательная хроноинотропия (см. рис. 3, а). Изменение знака возможно при уменьшении содержания кальция в растворе (см. рис. 3, в), что согласуется с данными других авторов [4, 12].
Нами установлено, что при сниженном уровне кальция переходный период после переключения частоты может длиться 3-5 мин и более, в результате чего давление, развиваемое в левом желудочке, не достигает стационарного состояния к 120-й и даже к 180-й секунде (см. рис. 2, а). Другими авторами показано меньшее время для сердечных препаратов крыс и кроликов, соответственно 5-15 и 45 с [12]. Отсюда могут быть потенциальные ошибки, которые обусловлены выбором длительности стимуляции. Так, в работе Henry [9] переключение частот производилось каждые 10 с, результатом чего была положительная лестница в изолированном сердце крыс. Мы повторили этот эксперимент, получив также положительную
1500-
1000-
Уабаин 1
КХ;
-уабаин 50 мкмоль
100
120
140
160
180 Т, мс
0,5 -
о. ^
0 0,0
1 X
га m о со
1-0,5
я
s
О. О X
-1,0-
Т=150 мс; Т=150 мс+уабаин 50 мкмоль; Т=333 мс
50 100 150
Количество ударов
б
Рис. 4. Влияние перфузии с уабаином (50 мкмоль): а — зависимость сила-частота для контрольного раствора Кребса-Хензелейта и раствора с уабаином; б — давление в левом желудочке относительно ударов, показан переходный период при переключении 150-105 мс
лестницу (см. рис. 2, б), хотя при более длительной стимуляции (60 с) наблюдались отрицательные взаимоотношения. Важно отметить, что в нашей работе не происходило неадекватной перфузии и ишемии сердца, так как коронарный ток во время экспериментов находился в нормальном диапазоне — 8-15 мл/мин. Причем нестабильность параметров сократимости усиливалась при сниженном уровне кальция, а именно в таких условиях коронарный ток, наоборот, увеличивался (данные не представлены).
Классическое представление о хроноинотропной зависимости связано с поиском стационарного состояния при стимуляции. На наш взгляд, использование параметров сократимости, первого удара В1 или экстремального удара Вех может дать дополнительную информацию о регуляторных процессах в сердце. Нами впервые отмечено, что в случае перфузии стандартным раствором КХ изменение В1 и Вех подчиняется тем же закономерностям, что и «квазистационарная»
а
сократимость B60c (см. рис. 3, б). Интересно заметить, что при сниженном уровне кальция в растворе КХ наблюдается разносторонняя динамика поведения сократимости в переходном периоде, а именно B1 и Bex. Например, B1 начинает демонстрировать как положительную, так и отрицательную зависимость сила-частота при замедлении и ускорении, в то время как Bex сохраняет независимость от периода стимуляции и направления изменения периода (см. рис. 3, г). Если при перфузии стандартным КХ [Са2+]о=2,5 ммоль наблюдаются симметричные ответы на разносторонние изменения периодов (см. рис. 1), то при уменьшении концентрации Са2+ до 1 ммоль переходный период отличается при разных протоколах стимуляции. Очевидно, системы, регулирующие гомеостаз кальция внутри клетки, связаны с внеклеточной [Са2+], возможно через работу Na+/Ca2+-обменника, который чувствителен к концентрации [Ca2+]o [19].
Наконец, мы предположили, что, увеличивая содержание кальция внутри клетки, можно также менять хроноинотропную зависимость. Однако эксперименты с уабаином показали, что кальциевая перегрузка (о чем можно судить по увеличенной восприимчивости к желудочковым аритмиям [16]) не сопровождается статистически значимым изменением знака зависимости сила-частота (см. рис. 4, а). Таким образом, увеличение внутриклеточного кальция не оказывает существенного влияния на хроноинотропные эффекты.
Заключение. В перфузируемом растворе в зависимости от концентрации кальция меняется динамика переходного процесса при переключении частот и, как следствие, знак частотно-силовых взаимоотношений. Внутриклеточный кальций незначительно влияет на частотно-силовые взаимоотношения.
Источник финансирования: грант National Science Council of Taiwan.
Литература/References
1. Endoh M. Force-frequency relationship in intact mammalian ventricular myocardium: physiological and pathophysiological rele-European Journal of Pharmacology 2004; 500(1-3): 73-86.
2. Palomeque J., Petroff M.V. et al. Multiple alterations in Ca2+ handling determine the negative staircase in a cellular heart failure model. J Card Fail 2007; 13(2): 143-154.
3. Hoffman B.F., Kelly J.J.Jr. Effects of rate and rhythm on contraction of rat papillary muscle. Am J Physiol 1959; 197: 1199-1204.
4. Bouchard R.A., Bose D. Analysis of the interval-force relationship in rat and canine ventricular myocardium. Am J Physiol 1989; 257(6 Pt 2): H2036-H2047.
5. Lewartowski B., Pytkowski B. Cellular mechanism of the relationship between myocardial force and frequency of contractions. Prog Biophys Mol Biol 1987; 50(2): 97-120.
6. Noble M.I.M., Seed W.A. Part II. The General Process. In: The Interval-force relationship of the heart: Bowditch revisited. New York: Cambridge University Press; 1992.
7. Colbert C.M. A circuit within a circuit? The Journal of Physiology 2007; 579(2): 289.
8. Janssen P.M., Periasamy M. Determinants of frequency-dependent contraction and relaxation of mammalian myocardium. J Mol Cell Cardiol 2007; 43(5): 523-531.
9. Henry P.D. Positive staircase effect in the rat heart. Am J Physiol 1975; 228(2): 360-364.
10. Frampton J.E., Harrison S.M. et al. Ca2+ and Na+ in rat myocytes showing different force-frequency relationships. Am J Physiol 1991; 261(5 Pt 1): C739-C750.
11. Frampton J.E., Orchard C.H. et al. Diastolic, systolic and sarcoplasmic reticulum [Ca2+] during inotropic interventions in isolated rat myocytes. J Physiol 1991; 437: 351-375.
12. Layland J., Kentish J.C. Positive force- and [Ca2+] i-frequency relationships in rat ventricular trabeculae at physiological frequencies. Am J Physiol 1999; 276(1 Pt 2): H9-H18.
13. Fabiato A. Myoplasmic free calcium concentration reached during the twitch of an intact isolated cardiac cell and during calcium-induced release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of a skinned cardiac cell from the adult rat or rabbit ventricle. J Gen Physiol 1981; 78(5): 457-497.
14. Fabiato A. Calcium-induced release of calcium from the cardiac sarcoplasmic reticulum. Am J Physiol 1983; 245(1): C1-C14.
15. Guide for the care and use of laboratory animals. National Academy Press; 2011.
16. Vassalle M., Lin C.I. Calcium overload and cardiac function. J Biomed Sci 2004; 11(5): 542-565.
17. Forester G.V., Mainwood G.W. Interval dependent inotropic effects in the rat myocardium and the effect of calcium. Pflugers Arch 1974; 352: 189-196.
18. Janssen P.M.L., Varian K.D. Frequency-dependent acceleration of relaxation involves decreased myofilament calcium sensitivity. Am J Physiol-Heart Circul Physiol 2007; 292: H2212-H2219.
19. Bers D.M. Sarcolemmal Na/Ca exchange and Ca pump. In: Excitation-contraction coupling and cardiac contractile force. Dordrecht, Boston: Kluwer Academic Publishers; 2001.
ymmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmimift
