Хроническое ультрафиолетовое облучение индуцирует развитие устойчивой резистентности клеток меланомы к противоопухолевым препаратам Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

m сч о сч

DOI: 10.17650/2313-805X-2023-10-3-50-58

Хроническое ультрафиолетовое облучение § индуцирует развитие устойчивой резистентности клеток меланомы к противоопухолевым препаратам

>-

о

и

о

ОС «£

з Ю.Ю. Щеголев1, М.А. Карпухина1, Д.В. Сорокин1, 2, А.М. Щербаков1, 2, О.Е. Андреева1, В.Е. Разуваева1,

У Т.А. Богуш1, И.Н. Михайлова1, 3, Л.В. Демидов1, М.В. Гудкова1, М.А. Красильников1, 2

О 1ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия,

^ 115522 Москва, Каширское шоссе, 24;

2 2ФГАОУВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»;

to Россия, 603022 Нижний Новгород, проспект Гагарина, 23;

о 3ФГБОУВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России; Россия, 660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1

< >

О

<

о

о.

Контакты: Михаил Александрович Красильников krasilnikovm1@yandex.ru

Введение. Меланома относится к группе наиболее злокачественных новообразований, отличающихся агрессивным ростом и активным метастазированием. При этом эффективность терапии, в первую очередь таргетной терапии, во многом ограничена быстрым развитием резистентности к препаратам. i Цель исследования - изучить влияние хронического ультрафиолетового (УФ) облучения на формирование субпо-

пуляции устойчивых к УФ клеток меланомы, а также особенности клеточного сигналинга и чувствительность УФ-резистентных клеток меланомы к действию противоопухолевых препаратов.

Материалы и методы. Эксперименты проводились на культивируемых in vitro клетках меланомы А375. Клетки культивировали в стандартной среде DMEM + 10 % FBS, анализ скорости роста клеток проводили с помощью МТТ-теста; К выживаемость клеток после облучения анализировали с использованием колониеобразующего теста. Транскрип-

ционную активность рецептора эстрогенов (ER) определяли методом репортерного анализа при трансфекции ^ в клетки плазмиды, содержавшей ген-репортер люциферазы под контролем промотора с эстроген-респонсивным

^ элементом. Для анализа экспрессии клеточных белков использовали метод иммуноблоттинга; сравнительный ана-

лиз экспрессии ERa и ERP проводили с помощью иммунофлуоресцентного метода. s Результаты. Длительное УФ-облучение приводит к формированию УФ-резистентной субпопуляции клеток мелано-

>< мы А375, отличающейся пониженной чувствительностью к таргетным (вемурафенибу) и гормональным (тамоксифе-

с ну) препаратам на фоне повышенной экспрессии Snail - активатора эпителиально-мезенхимального перехода

> и при отсутствии заметных изменений в экспрессии белков PI3K (фосфоинозитид-3-киназы)/mTOR (мишень рапа-

мицина млекопитающих) сигналинга. Метформин снижает экспрессию Snail как в родительских, так и в УФ-резис-тентных клетках А375 и усиливает цитостатический эффект в комбинации с вемурафенибом или тамоксифеном. Заключение. Полученные данные свидетельствуют о снижении чувствительности к таргетным препаратам клеток меланомы на фоне длительной экспозиции с УФ. Способность метформина потенцировать действие таргетных препаратов и ингибировать Snail позволяет рассматривать это лекарственное стредство не только как противоопухолевый агент, но и как потенциальный ингибитор эпителиально-мезенхимального перехода.

Ключевые слова: клетки меланомы, ультрафиолетовое облучение, вемурафениб, тамоксифен, резистентность

Для цитирования: Щеголев Ю.Ю., Карпухина М.А., Сорокин Д.В. и др. Хроническое ультрафиолетовое облучение индуцирует развитие устойчивой резистентности клеток меланомы к противоопухолевым препаратам. Успехи молекулярной онкологии 2023;10(3):50-8. DOI: 10.17650/2313-805X-2023-10-3-50-58

BY 4.0

Continuous ultraviolet irradiation induces the development of irreversible resistance of melanoma cells to anticancer drugs

Yu. Yu. Shchegolev1, M.A. Karpukhina1, D. V. Sorokin1,2, A.M. Scherbakov1,2, O.E. Andreeva1, V.E. Razuvaeva1, T.A. Bogush1, I.N. Mikhailova1,3, L. V. Demidov1, M. V. Gudkova1, M.A. Krasil'nikov1,2

1N.N.. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoye Shosse, Moscow 115522, Russia;

2National Research Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod; 23 Gagarin Prospekt, Nizhny Novgorod 603022, Russia; 3Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University, Ministry of Health of Russia; 1 Partizan Zheleznyak St., Krasnoyarsk, Russia

Contacts: Mikhail Alexandrovich Krasil'nikov krasilnikovm1@ya.ru

Introduction. Melanoma belongs to the group of the most malignant tumors characterized by aggressive growth and active metastasis. At the same time, the effectiveness of therapy, primarily targeted therapy, is largely limited by the rapid development of drug resistance.

Aim. To study the effect of chronic ultraviolet (UV) irradiation on the formation of a population of radiation-resistant melanoma cells; to study the features of cell signaling and the sensitivity of UV-resistant melanoma cells to the antitumor drugs.

Materials and methods. The experiments were carried out on in vitro cultured A375 melanoma cells. Cells were cultured in a standard DMEM + 10 % FBS medium; cell growth rate was analyzed using the MTT assay; cell survival after irradiation was analyzed using a colony-forming test. Determination of the transcriptional activity of the estrogen receptor (ER) was performed by reporter analysis upon transfection into cells of a plasmid containing the luciferase reporter gene controlled by estrogen responsive element. The immunoblotting method was used to analyze the expression of cellular proteins; comparative analysis of ERa and ERP expression was performed by immunofluorescent method. Results. Long-term UV irradiation leads to the formation of a UV-resistant subpopulation of A375 melanoma cells, which is characterized by decreased sensitivity to targeted (vemurafenib) and hormonal (tamoxifen) drugs, increased expression of Snail, an activator of the epithelial-mesenchymal transition, and in the absence of noticeable changes in the expression of PI3K/mTOR signaling. Metformin reduces Snail expression in both parental and UV-resistant A375 cells and enhances the cytostatic effect in combination with vemurafenib or tamoxifen.

Conclusion. The data obtained demonstrate a decrease in the sensitivity of melanoma cells to targeted drugs under the long-term exposure to UV. The ability of metformin to potentiate the action of targeted drugs and inhibit Snail allows us to consider metformin not only as an antitumor agent, but also as a potential inhibitor of the epithelial-mesenchymal transition.

Keywords: melanoma cells, ultraviolet irradiation, vemurafenib, tamoxifen, resistance

For citation: Shchegolev Yu.Yu., Karpukhina M.A., Sorokin D.V. et al. Continuous ultraviolet irradiation induces the development of irreversible resistance of melanoma cells to anticancer drugs. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2023;10(3):50-8. (In Russ.). DOI: 10.17650/2313-805X-2023-10-3-50-58

m сч о

СЧ

>-

(J

о

—I

о и z о

ОС <

о ж.

to

< >

а

<

о

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день меланома рассматривается как одно из наиболее агрессивных злокачественных новообразований кожи, отличающихся высоким риском развития рецидивирования и метастазирования. Меланома характеризуется выраженной генетической нестабильностью и высоким уровнем мутаций, среди которых наиболее распространенной является мутация в гене BRAF, расположенная на 600-м кодоне 15-го экзо-на (BRAFVШE). В настоящее время в клиническую практику активно внедряются новые таргетные препараты, тропные к мутантному эпитопу BRAF, однако эффективность таргетной терапии во многом ограничена возникновением резистентности к препаратам — врожденной или приобретенной в процессе терапии.

Одним из основных внешних факторов, способствующих злокачественной трансформации меланоци-тов кожи и развитию меланомы, является ультрафиолетовое (УФ) облучение, длительное воздействие которого вызывает целый каскад мутаций в ДНК ме-ланоцитов, приводящих в итоге к трансформации клеток. Собственно, роль УФ-облучения в инициации злокачественного роста довольно хорошо изучена, идентифицированы мутации, вызванные облучением, получившие общее название УФ-сигнатуры, в том числе драйверные мутации таких генов, как Р53, PTEN, p14ARF, p16INK4a, ARID2, РРР6С, SNX31, некоторые

варианты BRAF и ряд других [1]. Менее исследован вопрос о влиянии УФ-облучения на клетки, прошедшие злокачественную трансформацию. Установлено, что оно вызывает каскад апоптотических реакций в клетках меланомы, сопровождающийся остановкой клеточного деления и гибелью клеток; идентифицированы отдельные белки, участвующие в развитии УФ-индуцированного апоптоза [2]. Вместе с тем практически не изучен вопрос о воздействии хронического УФ-облучения на клетки меланомы, в том числе возможность и механизм формирования клонов клеток меланом, устойчивых к данному облучению. Продемонстрировано участие р53-сигналинга в реализации УФ-индуцированного апоптоза [3], выявлены отдельные белки, в частности MEK-ERK-STAT3-ct^ налинга, ассоциированные с резистентностью клеток меланом к УФ-облучению [4], однако особенности формирования УФ-резистентных клонов и взаимосвязь УФ-резистентности и чувствительности клеток меланом к противоопухолевым препаратам, в первую очередь таргетным, остаются малоисследованными.

В настоящей работе в условиях хронического УФ-облучения культивируемых in vitro клеток меланомы А375 была получена сублиния клеток, отличающаяся частичной резистентностью к УФ-облучению. Резистентные к УФ клетки характеризовались пониженной чувствительностью к таргетным (вемурафенибу)

а.

в;

£

о ж.

и >

m сч о сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о

а. те

о ж.

и >

и гормональным (тамоксифену) препаратам на фоне повышенной экспрессии Snail — активатора эпители-ально-мезенхимального перехода (ЭМП). Метформин усиливал цитостатический эффект препаратов и снижал экспрессию Snail, что свидетельствует об активности этого лекарственного средства не только как противоопухолевого агента, но и как потенциального ингибитора ЭМП.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились на культивируемых in vitro клетках меланомы А375. В работе использовались методы, представленные ниже.

Культивирование клеток. Клетки меланомы А375 культивировали в стандартной среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержавшей 4,5 г/л глюкозы, 10 % эмбриональной сыворотки телят (FBS HyClone, США) и ген-тамицин (50 ед./мл) («ПанЭко», Россия), при 37 °С и 5 % СО2. Культивирование клеток выполняли в инкубаторе NU-5840E (NuAire, США). При анализе скорости роста количество клеток определяли с использованием МТТ-теста, основанного на восстановлении живыми клетками реагента МТТ (3-(4,5-диметилтиа-зол-2)-2,5-дифенилтетразол бромида) в кристаллы формазана (нерастворимые в культуральных средах).

Репортерный анализ. Для определения транскрипционной активности рецептора эстрогенов (ER) проводили трансфекцию клеток плазмидой, содержавшей ген-репортер люциферазы под контролем промотора с эстроген-респонсивным элементом, любезно предоставленной George Reid и Frank Gannon [5]. Для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции применялась котрансфекция клеток плазмидой, содержавшей ген ß-галактозидазы. Активность люциферазы измерялась по стандартному протоколу (Promega, США) на люминометре Tecan Infinite M200 Pro (США). Расчет активности люцифе-разы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактози-дазы в исследованных образцах).

Иммуноблоттинг. Клетки на стадии формирования 80 % монослоя дважды промывали на чашках (60 мм; Corning, США) 2 мл фосфатного буфера. Для получения тотального клеточного экстракта к образцам добавляли по 130 мкл буфера следующего состава: 50 мМ Трис-HCl pH 7,4; 1 % Igepal CA-630, 150 мМ NaCl, 1 мМ тетраацетата этилендиамина, 1 мМ дитиотреитола, 1 мкг/мл апротинина, леупептина и пепстатина, 1 мМ фторида натрия и ортованадата натрия ^eick, США). Образцы клеточных экстрактов центрифугировали (10 000 g, 10 мин, 4 °C, центрифуга Eppendorf 5417R) и проводили стандартный электрофорез и иммуно-блоттинг, как описано ранее [6]. В цитозольных экстрактах исследовали содержание расщепленной формы PARP, phospho-p53, p53, Snail, мишень рапамицина млекопитающих (mTOR), phospho-mTOR, phospho-S6K, S6K, phospho-Akt, Akt, Slug, ERa (Cell Signaling

Technology, США). Для контроля эффективности им-муноблоттинга использовали антитела к а-тубулину (Cell Signaling Technology, США).

Анализ экспрессии рецепторов эстрогенов а и р им-мунофлуоресцентным методом. В работе использовались первичные моноклональные антитела к ERa и ERp и вторичные антикроличьи антитела, конъюги-рованные с флуоресцентным красителем DyLight650 (Abcam, ab98510). Клетки А375 инкубировали с первичными антителами 14—16 ч при +37 °С в темноте, со вторичными — 1,5 ч при +4 °С в темноте. Интенсивность флуоресценции клеток оценивали на проточном цитометре Beckman Coulter Navios. Специфическая флуоресценция клеток рассчитывалась в программе FlowJo 10.0.8 с помощью критерия Колмогорова— Смирнова.

Ультрафиолетовое облучение и отбор устойчивых к ультрафиолетовому облучению клеток. Облучение проводили с помощью УФ-лампы Vilber Lourmat (Франция) мощностью 6 Вт модели VL-6. LC. На клетки А375 воздействовали УФ-излучением диапазона C с длиной волны 254 нм и интенсивностью 50 Дж/м2. Для отбора УФ-резистентных клеток клетки А375 подвергали воздействию УФ 1 раз в неделю в течение 12 нед с последующим поддержанием роста клеток в течение не менее 40 дней после последнего раунда облучения.

Колониеобразующий тест. Клетки А375 рассеивали на культуральные чашки диаметром 60 мм (Corning, США) в среде DMEM, содержавшей 10 % FBS. На следующий день культуральную среду удаляли, клетки облучали УФ (длина волны 254 нм) и рассеивали на 6-луночный культуральный планшет (Corning, США) в стандартной культуральной среде с образованием 50—2000 колоний на лунку. Колонии фиксировали и окрашивали 20 % метанолом и 0,2 % кристаллическим фиолетовым после 10-дневного периода инкубации в инкубаторе с 5 % СО2, 37 °С. Любую колонию, состоящую из более чем 50 клеток, оценивали как выживший клон.

Статистическую обработку полученных данных проводили в программе Microsoft Excel. Во всех случаях статистические критерии считали достоверными приp <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние однократного ультрафиолетового облучения на клетки меланомы А375. Основной целью работы явилось исследование возможных изменений чувствительности клеток меланомы к противоопухолевым препаратам под действием УФ-облучения. Эксперименты проводились на культивируемых in vitro клетках меланомы А375, несущих мутацию BRAFV600E и чувствительных к ингибитору BRAF вемурафенибу.

Клетки А375 облучали под лампой 6W Vilber Lourmat (Франция) VL-6. LC, интенсивность 25—50 Дж/м2, как было описано выше. Однократное УФ-облучение

клеток меланомы А375 в диапазоне 254 нм приводит к выраженной гибели клеток (рис. 1, а), сопровождающейся повышением уровня апоптотических маркеров: накоплением фосфорилированной формы р53, расщеплением PARP и повышением экспрессии маркера ЭМП Snail (рис. 1, б).

Разработка модели хронического ультрафиолетового облучения культивируемых in vitro клеток меланомы А375. Для моделирования хронического облучения проведены 12 раундов облучения клеток в диапазоне УФ 254 нм с интенсивностью 50 Дж/м2 с частотой 1 раз в неделю, последующие эксперименты с выжившими клетками (сублиния А375/ЦУГЯ) выполняли в стандартной среде в течение 2 мес после последнего раунда облучения. Сравнительный анализ чувствительности

100

80

о -о ^ -S

Ii ^ 8 3

60

40

20

Контроль/ Control

Клетки А375 / A375 cells

1s IRR 3s IRR

а-тубулин / a-tubulin

Расщепленная форма PARP / Cleaved PARP

p53

phospho-p53

Snail

Контроль / Control + УФ / + UV

Рис. 1. Влияние ультрафиолетового (УФ) облучения на клетки меланомы линии А375: а — клетки А375облучали УФ 1 и 3 с, 1s IRR и 3s IRR, как описано в тексте, через 48 ч с помощью МТТ-теста определяли количество выживших клеток. Представлены средние значения ± стандартное отклонение двух независимых экспериментов; б — имму-ноблоттинг образцов клеток А375 через 24 ч после УФ-облучения проводили, как описано в тексте. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Антитела к а-тубулину использовали для контроля загрузки образцов в гель

Fig. 1. Influence of ultraviolet (UV) irradiation on A375 melanoma cells: a — A375 cells were irradiated with UV 1—3 s, 1s IRR and 3s IRR, respectively, as described in the text of the article, and after 48 h the amount of viable cells was assessed by the MTT-test. Data represent the mean value ± standard deviation of two independent experiments; б — A375 cells exposed to UV irradiation, and after 24 h were subjected to immunoblotting. Protein loading was controlled by membrane hybridization with а-tubulin Abs. The blot represents the results of one of the three similar experiments

i§

л о К

25

20

15

10

А375

А375 / UVR

а-тубулин / a-tubulin phospho-mTOR

^^ mTOR

phospho-S6K S6K

phospho-AKT AKT

Snail SLUG

А375

А375 / UVR

Рис. 2. Сравнительный анализ клеток А375 и резистентной к ультрафиолетовому (УФ) излучению сублинииÂ375/UVR: а — колониеобразу-ющий тест. Клетки облучали УФ и рассеивали на 6-луночный планшет с образованием 50—2000колоний на лунку. Окраску колоний проводили через 10—14 сут, как описано в тексте; б — иммуноблоттинг образцов клеток А375 и А375/UVR. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов

Fig. 2. Comparative analysis of A375 and resistant to ultraviolet (UV) irradiation A375/UVR cells: a — colony-forming test. The cells were exposed to UV and seeded on 6-well plates for growing 50—2000 colonies per well. The colonies were stained after 10—14 days as described in the text of the article; б — immunoblotting of A375 and A375 cells. The blot represents the results of one of the three similar experiments

клеток к УФ-облучению с использованием теста на ко-лониеобразование показал существенное увеличение эффективности этого процесса в клетках А375/ЦУЯ по сравнению с родительскими клетками, что свидетельствует о развитии частичной резистентности к облучению в клетках А375/UVR (рис. 2, a). Исследование основных белков ростового сигналинга в клетках А375 и А375/UVR не выявило существенных различий

m сч о сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж.

ю

< >

а

<

о m

а.

в;

£ m

о ж.

U >

а

5

0

б

а

0

б

m сч о сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о

а. те

о ж.

и >

в экспрессии белков, за исключением Snail, ключевого активатора ЭМП, экспрессия которого оказалась существенно выше в резистентных клетках (рис. 2, б).

Чувствительность клеток меланомы А375 к вемура-фенибу; комбинированный эффект вемурафениба и мет-формина. Сравнительный анализ чувствительности родительских и УФ-резистентных клеток меланомы А375 к ингибитору BRAF вемурафенибу показал снижение чувствительности УФ-резистентных клеток Ä375/UVR к антипролиферативному действию вемурафениба (рис. 3, а). Как отмечалось выше, резистентные клетки А375/Ц\ГЯ сохраняют практически неизменным уровень экспрессии белков Akt- и mTOR-сигна-линга (см. рис. 2, б), что свидетельствует о потенциальной возможности усиления цитостатического эффекта при комбинированном воздействии на клетки вемурафениба и ингибиторов mTOR. В дальнейших экспериментах в качестве последнего использовался метформин — антидиабетический препарат с минимальными побочными эффектами, обладающий ши-

120

100

80

g"§ 60

2

о Ö 40

20

□ А375 □ А375 / UVR

Ii ■ 1 I. I П;

а

0,125

0,25 0,5

ВФ, мкМ / VF, VМ

-О

и ^

0 -Q

1 .2 О = у U

О CJ

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

□ VF □ MF □ VF + MF

лЛш

А375

А375 / UVR

Рис. 3. Влияние вемурафениба (VF) в концентрации 0,125—2 мкМ (а) и вемурафениба в концентрации 0,25 мкМ в комбинации с 2 мМ мет-формина (MF) (б) на рост клеток А375 и A375/UVR. Клетки культивировали с указанными препаратами в течение 72 ч, количество выживших клеток определяли с помощью МТТ-теста. Представлены средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов

Fig. 3. Influence of 0,125—2^Мvemurafenib (VF) (a) and 0,25^Мvemu-rafenib in combination with 2 mM metformin (MF) (б) on the growth of A375 and A375/UVR cells. The cells were cultured with indicated drugs within 72 h, and the amount of viable cells was assessed by the MTT-test. Data represent the mean value ± standard deviation of three independent experiments

роким спектром действия, в том числе являющийся непрямым ингибитором mTOR-сигналинга. Мы показали, что комбинация вемурафиниба с сублетальными дозами метформина усиливает цитостатический эффект на родительские и УФ-резистентные клетки меланомы (рис. 3, б). Анализ влияния этого препарата на основные белки клеточного сигналинга выявил выраженное снижение экспрессии Snail в присутствии метформина, в том числе в УФ-резистентных клетках (рис. 4), что позволяет рассматривать его в качестве одного из соединений, не только обладающих анти-пролиферативной активностью, но и препятствующих активизации ЭМП.

Эстрогеновый сигналинг в клетках меланомы А375; чувствительность клеток меланомы к антипролиферативному действию антиэстрогена тамоксифена. Использование тамоксифена в качестве дополнительной линии терапии меланом активно обсуждается в литературе, однако результаты как экспериментальных, так и клинических исследований носят довольно противоречивый характер [7, 8].

Проведенный в наших экспериментах анализ содержания ER в клетках меланомы А375 методом

a-тубулин / a-tubulin

phospho-mTOR

mTOR

phospho-S6K S6K

phospho-AKT

AKT

Snail

SLUG

Контроль + MF / Control + MF

А375

Контроль + MF / Control + MF

А375 / UVR

Рис. 4. Влияние метформина (MF) на экспрессию белков в клетках А375 и A375/UVR. Клетки культивировали в присутствии 2мМ метформина 24 ч и проводили иммуноблоттинг образцов, как описано в тексте. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов

Fig. 4. Metformin (MF) influence on the protein expression in A375 and A375/UVR cells. The cells were treated with 2 mM metformin for 24 h, and the cells were subjected to immunoblotting as described in the text of the article. The blot represents the results of one of the three similar experiments

а

0

2

б

проточной цитометрии показал присутствие в клетках а- и p-форм этого рецептора, при этом содержание ERp практически в 3 раза превышает содержание ERa (см. таблицу). Определение транскрипционной активности ERa с использованием репортерной плазмиды, содержавшей ген люциферазы под контролем эстро-ген-респонсивного элемента, не выявило изменений его активности под действием эстрогенов или антиэстрогенов, что свидетельствует о низкой транскрипционной активности ERa в клетках меланомы А375 (рис. 5).

Сравнительный анализ экспрессии и активности ERa в родительских и УФ-резистентных клетках ме-ланомы не показал существенных различий в уровне ERa; однократное УФ-облучение клеток приводило к снижению содержания ERa, при этом транскрипционная активность менялась незначительно (рис. 6). Несмотря на низкую активность ERa, был выявлен выраженный цитостатический эффект антиэстрогена тамоксифена на клетки меланомы А375; при этом, как и в случае с вемурафенибом, мы обнаружили снижение чувствительности к тамоксифену в УФ-рези-стентных клетках A375/UVR (рис. 7, а). Комбинация тамоксифена с метформином усиливает цитостатиче-ский эффект, в большей степени — в родительских клетках А375 (рис. 7, б).

В целом полученные результаты свидетельствуют о формировании УФ-резистентной популяции клеток меланомы в условиях длительного УФ-облучения, для которой характерна пониженная чувствительность к таргетным и гормональным препаратам на фоне повышенной экспрессии активатора ЭМП Snail. Метфор-мин в комбинации с вемурафенибом или тамоксифе-ном усиливает цитостатический эффект и снижает экспрессию Snail, что свидетельствует о потенциальной перспективности использования метформина при проведении противоопухолевой терапии.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мутации в гене BRAF встречаются в 40—85 % случаев меланомы, повышенная частота мутации отмечается в метастазах и рецидивирующих меланомах [9, 10]. Чаще всего мутация локализуется в 600-м кодоне

Контроль/ E2 Control

TAM

TAM + E2

Рис. 5. Эстрогеновый сигналит в клетках А375. Репортерный анализ транскрипционной активности ERa. Клетки А375 трансфецировали плазмидой, содержавшей ген-репортер люциферазы под контролем промотора с эстроген-респонсивным элементом, и плазмидой, содержавшей ген в-галактозидазы, и культивировали в присутствии 10-8 M 17в-эстрадиола (E2) и 5х 10-6Мтамоксифена (ТАМ). Через 24 ч определяли активность люциферазы и в-галактозидазы, как описано в тексте. Расчет активности люциферазы проводили в у. е. (отношение общей активности люциферазы к активности в-галактозидазы в исследованных образцах). Представлены средние значения ± стандартные отклонения трех независимых экспериментов. Fig. 5. Estrogen signaling in A375 cells. Reporter analysis of ERa transcriptional activity. A375 cells were transfected with the plasmid containing the luciferase reporter gene under the estrogen-responsive elements, and в-galactosidase plasmid, and cells were cultured in the presence of 10-8 M 17-в estradiol (E2) and 5x 10-6 Mtamoxifen (TAM). After 24 h the luciferase and в-galactosidase activities were determined as described in the text of the article. The relative luciferase activity was calculated in arbitrary units as the ratio of the luciferase to the galactosidase activity. Data represent mean value ± standard deviation of three independent experiments

гена BRAF, в результате которой происходит замена валина на глутаминовую кислоту (V600E) [11]. Идентификация мутаций, приводящих к усиленной активации BRAF, способствовала разработке селективных ингибиторов, включая вемурафениб (PLX4032) и да-брафениб (GSK2118436), которые ингибируют передачу ростового сигнала в MAP-киназном каскаде.

Вемурафениб ^-(3-([5-(4-Хлорфенил)-1Н-пир-роло[2,3-Ь]пиридин-3-ил] карбонил)-2,4-дифторфе-нил)пропан-1-сульфонамид) является сильным ингибитором мутантной киназы BRAF [12] и проявляет высокую противоопухолевую активность в клетках меланомы с мутацией BRAFV600E [9, 13]. Ответ клеток меланомы на этот препарат может варьировать в зависимости от уровня экспрессии гена BRAF или количества

m сч о сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о m

а.

в;

£ m

о ж.

U >

Содержание рецепторов эстрогенов ERa и ERp, определенное с помощью иммунофлуоресцентного метода Level of estrogen receptors ERa and ERp determined by immunofluorescence assay

Показатель Уровень экспрессии (доля специфически флуоресцирующих клеток относительно контроля), % Интенсивность экспрессии (отношение среднего геометрического интенсивности флуоресценции в опытном образце к контролю), у. е. Индекс экспрессии (интегральный показатель, равный произведению интенсивности и уровня экспрессии, деленному на 100), у. е.

Parameter Expression level (is the proportion of specifically fluorescent cells relative to the control), % Expression intensity (is the ratio of the geometric mean fluorescence intensity in the test sample to the control), r. u. Expression index (an integral indicator equal to the product of intensity and expression level divided by 100), r. u.

ERa 59 2,2 1,3

ERP 86 6,3 5,4

m сч о сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю ш и

Z <

>

а

<

о m

а. те

£ m

о ж.

и >

а-тубулин / a-tubulin ERa

го ...

a. ■&■

п" а 2 и ^ й

о у

m —|

Контроль / Control + УФ / + UV

90 000 80 000 70 000 60 000 50 000 40 000 30 000 20 000 10 000 0

□ Контроль / Control

□ E2

U IU I И

А375

A375/UVR

A375+UV A375/UVR+UV

Рис. 6. Влияние ультрафиолетового (УФ) облучения на экспрессию и транскрипционную активность эстрогеновогорецептора ERa в клетках А375и A375/UVR. Клетки облучали УФ, через 24 ч содержание ERa в образцах клеток определяли методом иммуноблоттинга (а); активность ERa анализировали методом репортерного анализа (б). Представлены средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. E2 — 17^-эстрадиол

Fig. 6. The influence of ultraviolet irradiation (UV) on the expression of estrogen receptor a (ERa) and its transcriptional activity in A375 and A375/UVR cells. The cells were exposed to UV, and after 24 h the ERa expression was determined by immunoblotting (a); ERa activity was measured by reporter gene analysis (б). Data represent mean value ± standard deviation of three independent experiments. E2 — 17-в estradiol

матричной РНК (мРНК) BRAF. Несмотря на высокие показатели ответа на терапию в начале применения вемурафениба, у пациентов с метастатической мела-номой во многих случаях наблюдается довольно стремительное прогрессирование заболевания на фоне продолжения терапии, что указывает на развитие приобретенной резистентности к нему в клетках мелано-мы. Как правило, приобретенная резистентность к данному препарату связана с реактивацией незабло-кированных сигнальных путей, в частности путей ре-цепторной тирозинкиназы PDGFR [14], киназы CRAF (RAF1) и ряда других [15, 16]. Продемонстрирована важная роль эпигенетических факторов в формировании резистентности к вемурафенибу, в том числе метилирования ДНК [17], изменения спектра отдельных микроРНК, регулирующих ростовой сигналинг в клетках меланом [18].

Особый интерес представляет вопрос о возможных изменениях чувствительности меланомы к вемурафе-нибу под действием различных повреждающих и ге-нотоксических факторов, в том числе под действием УФ-облучения. Роль УФ-облучения в злокачественной трансформации меланоцитов и прогрессировании ме-ланомы достаточно хорошо изучена, продемонстрирована ведущая роль мутаций ДНК, индуцированных

□ Контроль / Control

□ TAM, 2 мкМ / TAM, 2 JM

□ TAM, 5 мкМ / TAM, 5 jM

А375

А375 / UVR

□ А375 □ А375 / UVR

120

100

80

-о .S

0 -Q

1 О

° ^

о Û 40

60

20

Н-| н— р-Н

À 1 1

LU

MF

TAM

MF + TAM

Рис. 7. Влияние тамоксифена (TAM) в концентрации 2—5 мкМ (а) и тамоксифена в концентрации 5 мкМ в комбинации с 2 мM метформина (MF) (б) на рост клеток A375и A375/UVR. Клетки культивировали с указанными препаратами в течение 72 ч, количество выживших клеток определяли с помощью МТТ-теста. Представлены средние значения ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов Fig. 7. Influence of 2—5^M tamoxifen (TAM) (а) and 5^Mtamoxifen in combination with 2 mM metformin (MF) (б) on the growth of A375 and A375/UVR cells. The cells were cultured with indicated drugs within 72 h, and the amount of viable cells was assessed by the MTT-test. Data represent the mean value ± standard deviation of three independent experiments

облучением, в трансформации клеток, в том числе мутаций Р53, PTEN, p14ARF, p16INK4a, BRAF и ряда других [1]. Действие УФ-облучения на трансформированные клетки меланомы сопровождается активизацией апоптотического каскада и частичной гибелью клеток [3]. Лишь в единичных работах исследовались особенности метаболизма клеток меланомы, обладающих повышенной устойчивостью к УФ-облучению. Так, в клетках, резистентных к нему, выявлены существенная реаранжировка сигнальных путей и активизация ростового/антиапоптотического сигналинга [4], продемонстрировано развитие УФ-резистентности при инактивации р53 сигнального пути [3].

В какой степени изменения клеточного сигналинга, ассоциированные с развитием УФ-резистентности, могут влиять на чувствительность клеток меланом к противоопухолевым препаратам? В настоящей работе мы исследовали чувствительность клеток меланомы А375 и УФ-резистентной сублинии A375/UVR, полученной в результате хронического облучения клеток УФ, к ингибитору BRAF вемурафенибу [13] и ингибитору

а

а

б

б

0

эстрогенового сигналинга тамоксифену, возможное использование которого в терапии меланом активно обсуждается в литературе [7, 8]. Было показано, что развитие резистентности клеток меланомы к УФ-об-лучению сопровождается снижением чувствительности клеток к обоим препаратам; дополнительное воздействие на клетки метформина, относящегося к группе активаторов АМРК и непрямых ингибиторов mTOR, приводит к усилению их цитостатического эффекта. Сравнительный анализ белков клеточного сигналинга выявил конститутивную активацию Snail — основного активатора ЭМП, в УФ-резистентных клетках; при этом метформин приводил к существенному подавле-

нию экспрессии Snail в родительских и УФ-резистент-ных клетках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом полученные результаты свидетельствуют о формировании в условиях длительного УФ-облучения клона УФ-резистентных клеток, характеризующихся пониженной чувствительностью к вемурафенибу и та-моксифену, а также активацией белков, ассоциированных с ЭМП. Метформин усиливает цитостатический эффект в комбинации с обоими препаратами, что позволяет рассматривать его в качестве потенциального противоопухолевого препарата в терапии меланом.

m сч о сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Hodis E., Watson I.R., Kryukov G.V. et al. A landscape of driver mutations in melanoma. Cell 2012;150(2):251-63. DOI: 10.1016/ j.cell.2012.06.024

2. Ouhtit A., Gupta I., Gaur R.L. et al. Deregulation of cell growth and apoptosis in UV-induced melanomagenesis. Front Biosci (Elite ed.) 2020;12(2):223-36. DOI: 10.2741/e868

3. Awais R., Spiller D.G., White M.R. et al. p63 is required beside p53 for PERP-mediated apoptosis in uveal melanoma. Br J Cancer 2016;115(8):983-92. DOI: 10.1038/bjc.2016.269

4. Fukumoto T., Iwasaki T., Okada T. et al. High expression of Mcl-1L via the MEK-ERK-phospho-STAT3 (Ser727) pathway protects melanocytes and melanoma from UVB-induced apoptosis. Genes Cells 2016;21(2):185-99. DOI: 10.1111/gtc.12330

5. Reid G., Hubner M.R., Metivier R. et al. Cyclic, proteasome-mediated turnover of unliganded and liganded ERalpha on responsive promoters is an integral feature of estrogen signaling. Mol Cell 2003;11(3):695-707. DOI: 10.1016/s1097-2765(03)00090-x

6. Shchegolev Y., Sorokin D., Scherbakov A. et al. Upregulation of Akt/Raptor signaling is associated with rapamycin resistance of breast cancer cells. Chem Biol Interact 2020;330:109243. DOI: 10.1016/j.cbi.2020.109243

7. Kanter-Lewensohn L., Girnita L., Girnita A. et al. Tamoxifen-induced cell death in malignant melanoma cells: possible involvement of the insulin-like growth factor-1 (IGF-1) pathway. Mol Cell Endocrinol 2000;165(1-2):131-7. DOI: 10.1016/s0303-7207(00)00253-7

8. Lens M.B., Reiman T., Husain A.F. Use of tamoxifen in the treatment of malignant melanoma. Cancer 2003;98(7):1355—61. DOI: 10.1002/cncr.11644

9. Forschner A., Niessner H., Bauer J. et al. Successful treatment with vemurafenib in BRAF V600K-positive cerebral melanoma metastasis. JAMA Dermatol 2013;149(5):642-4. DOI: 10.1001/ jamadermatol.2013.372

10. Spathis A., Katoulis A.C., Damaskou V. et al. BRAF mutation status in primary, recurrent, and metastatic malignant melanoma and its relation to histopathological parameters. Dermatol Pract Concept 2019;9(1):54-62. DOI: 10.5826/dpc.0901a13

11. Flaherty K.T., McArthur G. BRAF, a target in melanoma: implications for solid tumor drug development. Cancer 2010;116(21):4902-13. DOI: 10.1002/cncr.25261

12. Wellbrock C., Arozarena I. The complexity of the ERK/MAP-KINASE pathway and the treatment of melanoma skin cancer. Front Cell Dev Biol 2016;4:33. DOI: 10.3389/fcell.2016.00033

13. Chapman P.B., Hauschild A., Robert C. et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.

N Eng J Med 2011;364(26):2507-16. DOI: 10.1056/ NEJMoa1103782

14. Sullivan R.J., Flaherty K.T. Resistance to BRAF-targeted therapy in melanoma. Eur J Cancer 2013;49(6):1297-304. DOI: 10.1016/ j.ejca.2012.11.019

15. Chan X.Y., Singh A., Osman N. et al. Role played by signalling pathways in overcoming BRAF inhibitor resistance in melanoma. Int J Mol Sci 2017;18(7):1527. DOI: 10.3390/ijms18071527

16. Nelson B.E., Roszik J., Janku F. et al. BRAF v600E-mutant cancers treated with vemurafenib alone or in combination with everolimus, sorafenib, or crizotinib or with paclitaxel and carboplatin (VEM-PLUS) study. NPJ Precis Oncol 2023;7(1): 9. DOI: 10.1038/s41698-022-00341-0

17. Zakharia Y., Monga V., Swami U. et al. Targeting epigenetics for treatment of BRAF mutated metastatic melanoma with decitabine in combination with vemurafenib: a phase lb study. Oncotarget 2017;8(51):89182-93. DOI: 10.18632/oncotarget.21269

18. Vergani E., Di Guardo L., Dugo M. et al. Overcoming melanoma resistance to vemurafenib by targeting CCL2-induced miR-34a, miR-100 and miR-125b. Oncotarget 2016;7(4):4428-41.

DOI: 10.18632/oncotarget.6599

< >

a

<

о m

a.

в;

Ii

m

о ж.

и >

О

ж

<4 Благодарность. Авторы выражают особую благодарность за предоставление плазмид для экспериментов. ^ Acknowledgment. Authors express special thanks to George Reid и Frank Gannon and for the providing plasmids for experiments. ® Вклад авторов

Ю.Ю. Щеголев: проведение исследований на клеточных культурах, МТТ-анализа и колониеобразующего теста; М.А. Карпухина: проведение исследований на клеточных культурах и МТТ-анализа; Д.В. Сорокин: иммуноблоттинг;

А.М. Щербаков: статистическая обработка данных, анализ полученных данных, подготовка иллюстративного материала; 15 О.Е. Андреева: репортерный анализ;

® В.Е. Разуваева: отбор клеток с устойчивостью к облучению, проведение колониеобразующего теста; О Т.А. Богуш: анализ экспрессии ERa и ERp иммунофлуоресцентным методом, редактирование;

И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов: обзор литературы по теме статьи, редактирование; О М.В. Гудкова: руководство проектом, написание текста статьи; ОС М.А. Красильников: идея и организация исследования, написание текста статьи. ^ Authors' contributions

3 Yu.Yu. Shchegolev: conducting research on cell cultures, MTT assay and colony-forming test; M.A. Karpukhina: conducting research on cell cultures and MTT assay; D.V. Sorokin: immunoblotting;

A.M. Shcherbakov: statistical data processing, analysis of the obtained data, preparation of illustrative material; O.E. Andreeva: reporter gene assays; V.E. Razuvaeva: selection of UV-resistant cells, colony-forming test; l/j T.A. Bogush: analysis of ERa and ERJ3 expression using immunofluorescence method, editing; Jj I.N. Mikhailova, L.V. Demidov: literature review on the topic of the article, editing; Z M.V. Gudkova: project management, article writing;

M.A. Krasil'nikov: idea and organization of the research, article writing.

о

< ORCID авторов/ ORCID of authors

Ю.Ю. Щеголев / Yu.Yu. Shchegolev: https://orcid.org/0000-0002-1490-6781 s М.А. Карпухина / M.A. Karpukhina: https://orcid.org/0000-0002-3202-2293 s О.Е. Андреева / O.E. Andreeva: https://orcid.org/0000-0002-6015-6619 Д.В. Сорокин / D.V. Sorokin: https://orcid.org/0000-0002-1264-7405 А.М. Щербаков / A.M. Scherbakov: https://orcid.org/0000-0002-2974-9555 О Т.А. Богуш / T.A. Bogush: https://orcid.org/0000-0002-7673-4284 ^ М.В. Гудкова / M.V. Gudkova: https://orcid.org/0000-0003-2694-5232 О И.Н. Михайлова / I.N. Mikhaylova: https://orcid.org/0000-0002-7659-6045 >S Л.В. Демидов / L.V. Demidov: https://orcid.org/0000-0002-8562-6082 О М.А. Красильников / M.A. Krasil'nikov: https://orcid.org/0000-0002-5902-7633 X O.

ос Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. 5 Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-25-00368). О Funding. This research was funded by the Russian Scientific Foundation (grant No. 22-25-00368). Ж

U >

Статья поступила: 01.06.2023. Принята к публикации: 04.07.2023. Article submitted: 01.06.2023. Accepted for publication: 04.07.2023.