CC BY
32УДК 616.992.28:616,34,
ХРОНИЧЕСКИЙ ИНВАЗИВНЫЙ АСПЕРГИААЕЗ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНОЙ ПАЗУХИ (МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
1 Байдик О.Д. (докторант)*, 2Сысолятин П.Г. (профессор кафедры)
'Кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России; 2Кафедра госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России
© Байдик О.Д., Сысолятин П.Г., 2011
При хроническом инвазивном аспергиллезе слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи (СО ВЧП) отмечали выраженную клеточную инфильтрацию собственной пластинки, обширные геморрагии, зоны фокального некроза. При этом обнаружили преобладание воспалительных изменений над некротическими. Эпителиоциты характеризовались интенсивными белок-синтетической и пластической функциями, что может указывать на высокиерепаративные возможности эпителия.
Ключевые слова: инвазивный аспергиллез, морфология, синусит, ультраструктура
CHRONIC INVASIVE ASPERGILLOSIS OF MUCOUS MEMBRANE MAXILLARY SINUS (MORPHOLOGICAL STUDY)
BaydikO. D. (doctoral students), Sysolyatin P.G. (professor of chair)
'Chair of histology, cytology and embryology of GOU VPO Siberian State Medical University of Health Ministry of Russia; 2Chair of hospital oral surgery and maxillofacial surgery of GOU VPO Novosibirsk State Medical University of Public Health Ministry of Russia
© Baydik O.D., Sysolyatin P.G., 2011
At chronic invasive aspergillosis of mucous membrane maxillary sinus (MM of MS) expressed cellular infiltration own plate, extensive hemorragia and zones focal necrose have been marked. Thus prevalence of inflanitnalnry changes over necrotic was revealed. Epithelial cells were characterisedfiber-synthetic and plastic functions that can specify on high intensive reparative possibilities of epithelium.
Key words: invasive aspergillosis, morphology, sinusitis,
ultrastructure
* Контактное лицо: Байдик Ольга Дмитриевна Тел.: 8-(382-2)-52-74-04
Хронический инвазивный аспергиллез придаточных пазух носа - наименее изученная форма грибковых риносинуситов [1]. Заболевание характеризуется внедрением грибов в слизистую оболочку с последующим разрушением стенок пазухи, а затем -и окружающих структур. Выделяют две формы хронического инвазивного грибкового синусита - хронический некротизирущий синусит и хронический гранулематозный (аспергиллезная гранулема) [1-3]. Хронический гранулематозный синусит встречается в тропическом климате - в Индии, Пакистане, Судане и нескольких штатах США [1, 4]. Заболевание вызывается исключительно Aspergillus flavus [3, 5]. Хронический инвазивный некротизирующий аспергиллез околоносовых пазух чаще всего развивается из неинвазивной формы. Как правило, поражаются верхнечелюстные пазухи и передние клетки решетчатого лабиринта [5]. Основную категорию больных составляют люди зрелого и пожилого возраста с наличием предрасполагающих факторов, таких как сахарный диабет, длительный прием антибиотиков, кортикостероидов, иммунодефициты [5-7]. На ранних стадиях развития заболевания клиническая картина сходна с таковой при хроническом синусите. Проводимое консервативное лечение не эффективно. Спустя несколько лет, происходит разрушение костной стенки, сопровождающееся отеком, асимметрией лица, болями на пораженной стороне, экзофтальмом [1, 5]. При компьютерной и магниторезонансной томографии наблюдают воспалительные изменения слизистой оболочки с рентгенологическими симптомами грибкового синусита. Однако единственно надежным методом верификации диагноза является гистологическое исследование с обнаружением мицелия грибов в слизистой оболочке пазухи, кровеносных сосудах или кости [5]. В научной литературе имеются отрывочные сведения, касающиеся патогистологической картины хронического инвазивного некротизирующего аспергиллеза верхнечелюстных пазух.
Цель исследования - изучить морфологические изменения слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи (СО ВЧП) при хроническом инвазивном аспергиллезе.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В период с 2005 по 2010 гг. обследовано 23 больных с диагнозом «хронический инвазивный аспергиллез верхнечелюстной пазухи» в возрасте от 43 до 55 лет (средний - 48,3 ± 3,42 год). Диагноз ставили на основе клинических, лучевых, эндоскопических, микологических и гистологических методов исследования. Из 23 больных у 11 в анамнезе имел место длительный прием антибиотиков (в течение 7-9 лет), 12 пациентов страдали сопутствующими заболеваниями: 6 - сахарным диабетом I типа, б - бронхиальной астмой среднетяжелой степени. При культуральном исследовании во всех случаях выделяли гриб рода Aspergillus. IgE-антитела к A. fumigatus в сыворотке
крови определяли у всех больных (они находились в диапазоне от 1,3 до 14,6 ЕД RAST), наличие галакто-маннана в сыворотке крови (оптическая плотность более 1,0) выявили у 21 пациента (91,3%). При анализе компьютерных томограмм ни в одном случае деструкции костных стенок пазух не наблюдали. У 8 пациентов с хроническим инвазивным аспергилле-зом верхнечелюстных пазух проводили комплексное морфологическое исследование СО ВЧП. Контрольную группу составили биоптаты визуально неизмененной СО ВЧП, полученные в ходе оперативных вмешательств по поводу ретенционных кист у 6 пациентов. Возраст больных от 17 до 26 лет (средний
- 23,83±2,51 год). Биопсийный материал был взят в соответствии с требованиями этического комитета и письменного согласия пациентов.
Для световой микроскопии фрагменты СО фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение
I суток и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, ставили PAS-реакцию. В полученных препаратах изучали состояние эпителия, с помощью окуляр-микрометра измеряли толщину базальной мембраны. В 1 мм2 собственной пластинки СО ВЧП определяли численную плотность клеточных элементов (лимфоцитов, макрофагов, плазмоцитов).
Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике. Использовали антитела фирмы «Dako» (Дания) - CD3, CD8, CD20, murami-dase (Mur), фирмы «Novocastra» (Великобритания)
- CD4. Применяли высокочувствительную полимерную систему визуализации фирмы «BioGenex». В качестве хромогена использовали диаминобензидин. Срезы докрашивали гематоксилином. Высчитывали относительное содержание клеток (%) CD3, CD4, CD8, CD20 по отношению к окрашенным клеткам в собственной пластинке СО ВЧП в 10 полях зрения при увеличении х 400. Экспрессию рецепторов к Mur оценивали по трехбалльной шкале (слабая, средняя, выраженная степень). Для оценки выраженности экспрессии рецепторов к Mur определяли процент клеток, имеющих рецепторы, показатель экспрессии
[В]. " 1
Изучение ультраструктуры слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи проводили методом трансмиссионной электронной микроскопии [9]. Материал фиксировали в 4% растворе параформальдегида, дофиксировали в 1% растворе 0s04, дегидратировали в этиловых спиртах восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Полутон-кие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме «Ultrotome III» (LKB, Швеция). Полутонкие срезы толщиной 1 мкм окрашивали 1% раствором азура
II и исследовали под световым микроскопом. Ультратонкие срезы толщиной 60-100 нм наносили на сетки-подложки с формваровой пленкой-подложкой и контрастировали 2% раствором уранилацета-та и цитратом свинца. Препараты просматривали в электронном микроскопе «JEM-100 CXII» («JEOL»,
Япония) с апертурной диафрагмой 25-30 мкм при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Статистическую обработку проводили при помощи пакета программ Statistica 6.0 for Windows. Данные анализировали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Результаты представлены в виде М ± ш, где М - среднее значение, m
- ошибка среднего значения. Для оценки взаимосвязи между параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В контрольной группе СО ВЧП была выстлана многорядным реснитчатым эпителием [10]. Слизистая оболочка выстлана однослойным кубическим или призматическим эпителием (Рис. 1).
Рис. 1. Слизистая оболочка верхнечелюстной пазухи пациентки с хроническим инвазивным аспергиллезом СО ВЧП, (Э - эпителий, СП - собственная пластинка,
Г- геморрагии, С - сосуды). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400
Цитоплазма эпителиоцитов отличалась резкой базофилией. Ядра клеток зачастую выглядели как неправильные многоугольники. На некоторых участках слизистой оболочки эпителий имел типичное строение. При Этом наблюдали увеличение высоты эпителия до 5-7 рядов за счет расширения средней его трети. На таких участках выявили значительное увеличение ШИК-позитивных бокаловидных клеток. Зачастую секрет заполнял всю цитоплазму клеток, оттесняя ядро в базальную часть. Соотношение реснитчатых и бокаловидных клеток составило 3,3:1 (в контроле - 5:1).
Собственная пластинка богато диффузно инфильтрирована лимфоцитами, плазматическими клетками, макрофагами и тучными клетками (табл.).
Таблица
Содержание клеточных элементов, CD 3, CD 4, CD 8, CD 20 и экспрессия Mur в собственной пластинке СО ВЧП при грибковых синуситах (М ± т)
Показатель Инвазивный аспергиллез (п=8) Контрольная группа (п=6)
Макрофаги,-103 11,7 ±0,4* 0,22 ±0,04*
Лимфоциты, Ю3 12,4 ± 0,8 0,69 ±0,07*
Плазмоциты, -103 12,8 ±0,6* 0,57 ±0,08*
Тучные клетки, 103 13,3 ±1,2* 0,12 ±0,01*
CD 3, % 48,29 ±5,16 21,90 ± 6,71*
CD 4,% 27,67 ±4,2 17,20 ±4,50*
CD 8,% 23,20 ±3,1 6,38 ±2,21*
CD 20,% 39,39 ±4,14 7,39 ±3,71*
Mur, ед. 110,13 ±12,10 57,31 ±17,10*
Примечание: * — различие статистически значимо (р < 0,05).
Среди клеточных элементов преобладали лимфоциты и плазмоциты. Тучные клетки локализовались подэпителиально и периваскулярно, некоторые из них содержали ШИК-позитивные гранулы. В глубоких отделах собственной пластинки обнаруживали множественные крупные и мелкие очаги фокального некроза ткани и грибковый мицелий (Рис. 2).
Рис. 2. Мицелий Aspergillus sp. (Мц), окруженный лимфо-плазмоцитарным валом (КИ) и зоной фокального некроза (Н) в собственной пластинке СО ВЧП. ШИК-реакция с до-краской гематоксилином. Ув. 400
Последний был окружен клеточным валом, состоящим, в основном, из лимфоцитов и плазматических клеток. Мицелий септированный с разветвлениями под острым углом (40-45°) (Рис. 3).
Рис. 3. Гифы Aspergillus sp., ветвящиеся под острым углом. (Мц - мицелий, f- септы мицелия, Эр - эритроциты). ШИК-реакция сдокраской гематоксилином. Ув. 400
На отдельных участках между гифами визуализировались множественные эритроциты, что может быть как результатом взятия биопсии, так и васку-лопатией, возникающей в ходе воспаления СО ВЧП. Сосуды в 82,3±2,1% - с признаками сладжа и тромбоза эритроцитов (в контроле - 1,2±0,2%, р < 0,05).
При исследовании субпопуляций лимфоцитов выявили незначительное увеличение CD3 над CD20 и CD4+ над CD8+ клетками (табл.). Соотношение CD4:CD8 составило 1,2 : 1. Мананновые компоненты клеточной стенки грибов обладают иммуномодулирующим действием и способны угнетать функцию лимфоцитов [11]. Высокое содержание CD8 свидетельствует о снижении местного иммунитета СО ВЧП и способствует тканевой диссеминации грибов. Как указывают K. V. Clemons с соавторами [12], развитие инвазивных форм аспергиллеза связано с недостаточной активацией Т-хелперов 1-го типа и доминированием Т-хелперов 2-го типа. Последние, в свою очередь, вызывают дегрануляцию тучных клеток, что приводит к высвобождению вазоактивных веществ (гистамина, гепарина, лейкотриенов и др.) [13]. С одной стороны, это способствует усилению клеточной инфильтрации собственной пластинки СО ВЧП, с другой - повышению тромбообразования и выходу форменных элементов крови за пределы сосудистой стенки. Подтверждением этому явились свежие геморрагии и плазморрагии в собственной пластинке СО ВЧП (Рис. 1) и положительная корреляционная зависимость между содержанием CD 4+ и тучных клеток (г=0,57, р=0,009).
При электронно-микроскопическом исследовании обнаружили эпителиоциты разнообразной формы: кубической, призматической, уплощенной, многоугольной формы. Зачастую клетки не образовывали контактов друг с другом (Рис. 4 а, б).
Рис. 4 а, б. Нарушение межклеточных контактов в эпителии СО ВЧП у пациента с инвазивной формой одонтогенного синусита (Я - ядро, М - митохондрии, Бм - базальная мембрана, Нф - нейтрофил, Эр - эритроцит, СП - собственная пластинка, ЭПС - эндоплазматическая сеть)
Цитоплазма формировала многочисленные длинные отростки. На апикальной поверхности эпи-телиоцитов наблюдали цитоплазматические выросты, напоминающие микроворсинки. Гетерохромные ядра располагались в центральной или апикальной частях клеток. Вследствие множественных инвагинаций оболочки ядра приобретали лопастную или двудольчатую форму. Ядрышко крупное с преобладанием гранулярного компонента, расположено эксцентрично. Клетки о тличались высоким ядерноцитоплазматическим отношением. В осмиофильной цитоплазме эпителиоцитов отчетливо определялись митохондрии, короткие, диффузно расположенные цистерны гранулярной эндоплазматической сети (ЭПС). Митохондрии имели электронно-плотный гомогенный матрикс. Кристы не визуализировались. Перинуклеарно и в базальном отделе клеток отчетливо определялись толстые пучки спирально ориентированных тонофиламентов. Все это свидетельствовало об интенсивных белок-синтетической и пластической функциях эпителиоцитов и, как след-
ствие, высоких репаративных возможностях эпителия. В связи с этим можем предполагать, что такие «темные» клетки являются предшественниками специализированных эпителиоцитов. Это согласуется с данными К. 1ика/а\\га е1 а1. [14].
Базальная мембрана на всем протяжении образовывала множественные глубокие складки. Ее светлая часть была неравномерно утолщена на всем протяжении. Непосредственно под базальной мембраной располагались нейтрофильные лейкоциты (Рис. 4 а). В собственной пластинке около 2/3 лимфоцитов находились в активированном состоянии, о чем свидетельствовало наличие множественных псевдоподий и глубокие инвагинации ядра. В цитоплазме большинства плазмоцигов визуализировались тельца Русселя на разных стадиях их формирования, часть из которых находилась в состоянии активной секреции (Рис. 5).
Рис. 5. Фрагмент плазматической клетки (Пл) с активной секрецией иммуноглобулинов (ТР - тельце Русселя, ЭПС -эндоплазматическая сеть)
Эпителиоидные клетки везикулированного типа (тип В) зачастую располагались в непосредственной близости к фибробластам (Рис. 6).
Рис. 6. Фрагмент эпителиодной клетки (ЭпК) и фибробласта (Фб) в собственной пластинке СО ВЧП (Кв - коллагеновые волокна)
Коллагеновые волокна теряли свою правильную ориентацию. Нередко визуализировались участки их фибриноидных изменений.
В глубоких отделах собственной пластинки СО ВЧП выявляли вегетативный мицелий Aspergillus sp. Клетки вегетативного мицелия находились на разных стадиях своего развития - от молодых до стареющих (Рис. 7).
Рис. 7. Клетки мицелия Aspergillus sp. в собственной пластинке СО ВЧП (С - септа, В - вакуоли, КС - клеточная стенка, Я - ядро, М - митохондрии)
Подробное описание ультраструктуры Aspergillus sp. дано в работах А.А. Степановой, ИА. Синицкой ¡15-17]. По периферии мицелий окружен нейтро-фильными лейкоцитами, лимфоцитами, фибробла-стами и участками лизиса ткани. Нейтрофилы находились в активированном состоянии, о чем свидетельствовало наличие большого числа псевдоподий, содержащих специфические гранулы. Зачастую наблюдали проникновение нейтрофилов между клетками вегетативного мицелия (Рис. 8).
Рис. 8. Проникновение нейтрофилов между клетками мицелия Aspergillus sp. (Я - ядро, Мц - мицелий, Нф - нейтро-фил).
Ни в одном случае явления фагоцитоза не зарегистрировали. Некоторые фибробласты, расположенные по периферии мицелия, находились в стадии активного коллагеногенеза. Тем не менее, на отдельных участках ограничивающая фиброзная капсула отсутствовала.
Существенные изменения обнаружили в ультра-структурной организации микрососудов СО ВЧП. Ядра эндотелия имели продолговатую форму с глубокими инвагинациями нуклеолеммы. Отростки эндотелиальных клеток утолщены. Умеренной плотности цитоплазма содержала в околоядерной зоне митохондрии с хлопьевидным матриксом и разрушающимися кристами. Цистерны ЭПС не определялись. Апикальная плазмалемма преимущественно имела ровный контур, иногда - с единичными инвагинациями. Микропиноцигозные везикулы не наблюдали.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При хроническом инвазивном аспергиллезе СО ВЧП имеют место следующие особенности: выраженная клеточная инфильтрация собственной пластинки, обширные геморрагии, зоны фокального некроза. При этом обнаружили преобладание воспалительных изменений над некротическими. Несмотря на выявленную однослойную метаплазию, в эпите-лиоцигах наблюдали интенсивные белок-синтетиче-ские и пластические процессы, что может указывать на высокие репаративные возможности эпителия.
ЛИТЕРАТУРА
1. (Malta S., Uppin S. G., Hanumanthu S. et al. Fungal rhinosinusitis: a clinicopathological study from South India // Eur. Arch. Otorhinolaryngol. - 2010. - Vol. 267. - P. 1239-1245.
2. Stringer P. S., Ryan M. W. Chronic invasive fungal rhinosinusitis 11 Otolaryngol. Clin. North Am. - 2000. - Vol. 33. - P.
375-387. ~
3. Chakrabarthi A., Das A., Panda W. K. Overview of fungal rhinosinusitis // Indian J. Otolaryngol. Head Neck Surg. - 2004.
- Vol. 56. - P. 251-258.
4. Michael R. C., Michael J. S., Ashbee R. H., Mathews M. S. Mycological profile of fungal sinusitis: an audit of specimens over a 7-year period in a tertiary care hospital in Tamil Nadu. Indian fj J. Pathol. Microbiol. - 2008. - Vol. 51. - P. 493-496.
5. Сергеев А. Ю., Сергеев Ю. В. Грибковые инфекции: Руководство для врачей. - М: БИНОМ, 2008. - 480 с.
6. Клясова Г. А. Инвазивные микозы в онкогематологии: современное состояние проблемы // Современная онкология. - 2001. - Т. 3, № 2. - С. 61-65.
7. Gupta А. К., Ghosh S. Sinonasal aspergillosis in immunocompetent Indian children: an eight-year experience // Mycoses.
- 2003, - Vol. 46. - P. 455-461.
8. Эллиниди В. H„ Аникеева Н. В., Максимова Н. А. Практическая иммуногистоцитохимия: Методические рекомендации. — СПб: ВЦЭРМ МЧС России, 2002. - 36 с.
9. Карупу В. Я. Электронная микроскопия. - Киев: «Вища школа», 1984. - 208 с.
10. Байдик О■ Д., Долгун Д. А., Логвинов С. В. Бирицкая Е. В. Особенности структурной организации слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи в юношеском возрастном периоде (по данным электронной микроскопии) // Медицина в Кузбассе. - 2009. - № 2. Спецвыпуск. - С. 13-14.
11. Клиническая иммунология и аллергология /Под ред. А. В. Караулова./ М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 651 с,
12. Clemons К. V, Calkh V. L., Burger Е. et al. Pathogenesis I: interactions of host and fungi 11 Med. Mycol. - 2000. - Vol. 38. - Suppl. 1. - P. 99-111.
IB. Яглова H. В. Тучные клетки и врожденный иммунитет // Иммунология. - 2009. - № 2. - С. 139-143.
14. Fukazawa К., Ogasawara Н., Umemoto М. et al. Regeneration of epithelial cells of the maxillary sinus mucosa in chronic sinusitis II Med. Electron Microsc. - 1998. - Vol. 31. - P. 10-15.
15. Степанова А. А., Синицкая И. А. Ультраструктура клеток Aspergillus niger van Thieghem. Вегетативный мицелий /f Пробл. мед. микологии. - 2003. — Т. 5, № 4. - С, 32-39.
16. Степанова А. А., Синицкая И. А. Субмикроскопическое изучение клеток вегетативного мицелия Aspergillus flavus Fres. 11 Пробл. мед. микологии. - 2004. - Т. 6,№ 3. - С- 34-40.
17. Степанова А. А., Синицкая И. А. Ультраструктура клеток вегетативного мицелия Aspergillus flavus Link, выращенного in vitro // Пробл. мед. микологии. - 2006. - Т. 8, № 1. - С. 40-45.
Поступила в редакцию журнала 27.06.2011
Рецензент: А.А. Степанова
