CC BY
33
Статья поступила в редакцию 05.06.2012 г.
ХРОМОСОМНЫЕ АБЕРРАЦИИ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК У ДЕТЕЙ КУЗБАССА, ПРОЖИВАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНОЙ ГЕНОТОКСИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ
CHROMOSOMAL ABERRATIONS AND DNA REPAIR GENES POLYMORPHISM IN CHILDREN LIVING IN DIFFERENT GENOTOXIC CONDITIONS OF KEMEROVO REGION
Соболева О.А. Soboleva ОЛ.
Минина В.И. Minina V.I.
Дружинин В.Г. Druzhinin V.G.
Тимофеева А.А. Timofeeva АЛ.
Ларионов А.В. Larionov А.У.
Институт экологии человека СО РАН, Institute of Human Ecology,
Кемеровский государственный университет, Kemerovo State University,
г. Кемерово, Россия Kemerovo, Russia
Цель - анализ хромосомных аберраций и полиморфизма генов репарации ДНК (hOGGl Ser326Cys, ADPRT Val762Ala) среди детского населения, проживающего на территориях Кемеровской области, характеризующихся разной степенью генотоксической нагрузки.
Материалы и методы. Был обследован 141 подросток из Таштагольского района (опытная группа) и 190 детей-подростков из экологически благополучных территорий Кузбасса (контрольная группа). Учет хромосомных аберраций проводили с помощью микроскопа Axioskop 2 plus. Генотипирование полиморфизмов генов репарации ДНК проводили методом «SNP-экспресс». Результаты. У детей из Таштагольского района выявлено увеличение частоты хромосомных аберраций, снижение частоты встречаемости мажорного аллеля hOGG1 Ser326, а также повышение частоты хромосомных аберраций у носителей генотипа Ala/Ala utyf ADPRT .
Выводы: Полученные различия между контрольной группой и группой сравнения свидетельствуют о перспективности методики анализа хромосомных аберраций и полиморфизма данных генов в системе исследования индивидуальной токсико-генетической чувствительности на территории Кузбасса. Ключевые слова: хромосомные аберрации; полиморфизм генов репарации ДНК; генотоксическая нагрузка.
Objective - to analyze chromosomal aberrations and DNA repair genes polymorphism (hOGGl Ser326Cys, ADPRT Val762Ala) in young people living in different conditions of genotoxic of Kemerovo region.
Materials and methods. Experimental group included 141 adolescents of Tashtagol region, control group - 190 adolescent from ecologically successful areas of Kuzbass. Chromosomal aberration was registered by microscope Axioskop 2 plus. DNA repair genes typing was realized by PCR method.
Results. The children of Tashtagol region showed: increase of frequency of chromosome aberrations, decrease of incidence of hOGGl Ser326 major allel, and increase of frequency of chromosome aberrations in the carriers of the Ala/Ala utyf ADPRT genotype.
Conclusion: The different results between patient and control groups are indicative about availability of chromosomal aberrations and genes polymorphism methods at individual toxicogenetic sensitivity research in Kuzbass region.
Key words: chromosomal aberrations; DNA repair gene polymorphisms; toxicogenetic stress.
Исследования, направленные на изучение токсико-генети-ческой чувствительности, приобретают особую актуальность в регионах с ярко выраженным производственным сектором, одним из представителей которых является Кузбасс.
Таштагольский район, структура промышленности которого носит моноотраслевой характер, является сырьевой базой металлургической промышленности Кузбасса с абсолютным преобладанием горнорудной отрасли (80 %). На втором месте находятся производство и распределение электроэнергии, газа и
воды (17 %). На данные отрасли приходится подавляющее количество выбросов в атмосферу (неорганическая пыль, сажа, зола углей, оксиды азота, железа, соединения марганца, а также другие вещества высокого класса опасности), несомненно, оказывающих влияние на состояние здоровья населения региона. Кроме того, за последние годы на территории района регулярно наблюдается превышение предельно-допустимого выброса (ПДВ) веществ и соединений, представляющих опасность для здоровья. Также, согласно данным, полученным в результате геофизиче-
^ 56
ского районирования, территория Таштагольского района относится к числу опасных по радону, который, по оценке Международного агентства по изучению рака, относится к первой группе канцерогенов и мутагенов [1].
Важным генотоксическим маркером мутагенного воздействия внешней среды на организм человека является повышение частоты встречаемости клеток с хромосомными нарушениями или аберрациями (ХА). Всемирной организацией здравоохранения культура лимфоцитов человека рекомендована в качестве тест-системы для оценки
ПОЛИТРАВМА
мутагенного воздействия факторов окружающей среды на организм.
Помимо экзогенных факторов, влияющих на здоровье, в том числе и на состояние генетического аппарата, существуют эндогенные факторы, к которым относится система ферментов репарации ДНК. Гены репарации ДНК способны исправлять повреждения цепи ДНК, уменьшая выраженность геноток-сического воздействия мутагенов. Особенности полиморфизма генов репарации (генетический полиморфизм населения) на сегодняшний день рассматриваются в качестве одного из важнейших факторов, определяющих индивидуальную токсико-генети-ческую чувствительность к воздействию факторов внешней среды [2].
Целью данного исследования стало изучение ХА и полиморфизма генов репарации ДНК (Hogg1 Seг326Cys, ADPRT Val7-62А1а) среди жителей территорий Кузбасса, характеризующихся различным уровнем генотоксической нагрузки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проводилось в соответствии с этическими стандартами, разработанными в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. На каждого обследуемого был оформлен протокол информированного согласия, подписанный родителями либо лицами, осуществляющими опеку несовершеннолетних.
Исследуемая выборка включала 331 человека. Опытную группу составили 141 человек — дети и подростки (средний возраст 13,5 лет) из Таштагольского района. Группу сравнения составили 190 условно здоровых детей-подростков от 8 до 19 лет, не контактирующих с химическими или радиационными мутагенами в быту, из сел Зарубино Топкинского района, Пача Яшкин-ского района, Красное Ленинск-Кузнецкого района — территорий
области, характеризующихся незначительным уровнем загрязнения окружающей среды.
Выбор детей-подростков в качестве объекта исследования обоснован тем, что в этом случае минимизируется воздействие таких факторов, как вредные привычки, хронические болезни и профессиональный контакт с производственными вредностями. Для того, чтобы нивелировать вклад межэтнических различий полиморфизма генов репарации ДНК в формирование резистентности к тому или иному заболеванию, в когорту обследуемых были включены только представители европеоидной расы.
В качестве документального источника информации были взяты данные Государственного комитета природных ресурсов и Роспотреб-надзора по Кемеровской области за 2006-2009 гг., в частности, формы статистической отчетности № 2-ТП (воздух) (в том числе разделы: 2.1. «Выбросы загрязняющих веществ в атмосферу, их очистка и утилизация», 2.2. «Выброс в атмосферу специфических загрязняющих веществ» [3]), а также информация Государственных докладов «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Кемеровской области» за 2006-2010 гг., касающаяся состояния окружающей природной среды и здоровья населения Таштагольского района [4].
Использовались результаты измерений удельной объемной активности (УОА) радона, полученные кафедрой генетики КемГУ в ходе экспедиционных выездов в Таштаголь-ский район в 2007-2011 гг. Для измерений использовался радиометр радона РРА-01М-01 «Альфарад» в режиме Air 1, предусматривающем забор пробы воздуха встроенной воздуходувкой — 3 мин., анализ пробы на содержание радона с последующей выдачей интегрального значения — 20 мин. [5].
Материалом для цитогенети-ческих исследований послужила цельная периферическая кровь, забиравшаяся в период медицинских осмотров. Культивирование клеток осуществлялось по стандартному полумикрометоду [6]. Готовились препараты для микроскопического анализа ХА. Регистрировали абер-
рации хромосомного и хроматидно-го типов в соответствии с общепринятыми нормами [7].
Для типирования полиморфизмов генов репарации ДНК (hOGG1 Seг326Cys, ADPRT Val762Ala) использовали коммерческую тест-систему «SNP-ex-pгess». Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофо-ретически в горизонтальном 3 % агарозном геле. Гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0.». Для основных показателей рассчитывались средние значения и их стандартные ошибки. Сравнение групп проводилось с использованием рангового и-теста Манна-Уитни. Сравнение частот генотипов проводилось с помощью четырехпольной таблицы с поправкой Йетса на непрерывность вариации (х2).
РЕЗУЛЬТАТЫ
И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе исследования, при анализе документальных материалов, был обнаружен ряд веществ, выбросы которых в атмосферу Таштагольского района превышают предельно-допустимые нормы, и их источники, а именно: неорганическая пыль, источником которой являются горно-рудные предприятия ОАО «Евразруда», сажа и зола углей — результат деятельности предприятий электроэнергетики и др. Перечень основных веществ и соединений, превышающих нормы ПДВ на территории Таштагольско-го района за 2006-2009 гг., представлен в таблице 1.
Помимо этого, на территории района на протяжении 20062009 гг. стабильно наблюдалось превышение ПДВ предельных углеводородов, основными источниками выброса которых являются транспорт и добыча металлических руд. В 2006 и 2008 гг. выявлено превышение ПДВ бензо[а]пирена, канцерогенная опасность которого подтверждена эпидемиологическими исследованиями, а также аце-
№ 1[март]2013
Таблица 1
Среднегодовые выбросы основных загрязняющих агентов на территории
Таштагольского района за 2006-2009 гг.
Наименование 2006 г. 2007 г. 2008 г. 2009 г.
Зола углей 20-70 %) 1655,3 3094,2* 2786,9* 2732,0*
Углерод (сажа) 391,5* 224,0* 436,4* 535,3*
Пыль неорганическая < 20 %) 31,4 209,5 178,3* 161,9*
Азота оксид 76 103,6 109,8 113
Пыль каменноугольная 24,8* 11,3* 13,3 23,6
Примечание: приведены данные по пяти загрязняющим агентам с наибольшим годовым уровнем выброса в атмосферу; * - показатели, превышающие нормы ПДВ за отчетный период.
тальдегида и бензола, источником которых являются выхлопные газы автотранспорта.
По данным замеров УОА радона, проведенных в 2007-2011 гг., на территории Таштагольского района в месте проживания обследованных детей (школа-интернат г. Таш-тагол) были зарегистрированы превышения его сверхнормативных доз. В среднем показатель УОА радона составлял 409 Бк/м3, а в отдельные периоды исследования его величина достигала 1143 Бк/м3, что превышает нормативы содержания радона в воздухе (200 Бк/м3), установленные Международным комитетом радиационной защиты [5].
Поскольку качество атмосферного воздуха, несомненно, определяет состояние здоровья населения, были проанализированы показатели заболеваемости населения Таштагольского района. Обнаружены повышенные (по сравнению со среднеобластными) показатели первичной и общей заболеваемости, заболеваемость кожи и подкожной клетчатки среди всех возрастных групп населения, а также крови и кроветворных органов. Более подробно динамика заболеваемости различных возрастных групп населения Таштагольского района описана нами ранее [8].
В результате проведенных цито-генетических исследований было обнаружено, что средняя частота аберрантных метафаз у детей из Таштагольского района значимо выше, чем в группе сравнения (4,40 ± 0,23 % против 2,80 ±
0,13 %; р = 0,0000001). Уровень хромосомных нарушений у детей-подростков, проживающих на территории Таштагольского района, превышает как региональный фоновый уровень хромосомных нарушений — 2,86 % [9], так и спонтанный уровень ХА — 2,13 %, рассчитанный на основании базы данных Медико-генетического научного центра РАМН, что может служить подтверждением факта генотоксического воздействия на данную группу лиц. Уровень ХА, выявленный в группе сравнения, не выходит за рамки базового фонового уровня, установленного для Кузбасского промышленного региона.
В ходе анализа полиморфизма генов репарации ДНК (табл. 2) было выявлено, что распределение частот генотипов гена hOGG1 в группе сравнения согласуется с данными, полученными для европеоидов [10].
Распределение частот генотипов гена ADPRT в группе сравнения
отличается от данных по частотам генотипов, полученных для групп европеоидов. У жителей Кемеровской области наблюдается повышенная частота встречаемости генотипа Ala/Ala (8,8 %) по сравнению с литературными данными (2,8 % (х2 = 10,46; р = 0,001), 1,63 % (х2 = 15,57; р = 0,0001), 2,2 % (х2 = 12,07; р = 0,0005) для групп европеоидов США, Мексики и Нидерландов, соответственно). Для того, чтобы выяснить, не являются ли данные отличия статистическим артефактом, необходимо дополнительное увеличение объема выборки.
Анализ полиморфизма генов репарации ДНК в изученных группах (табл. 2) позволил выявить статистически значимые отличия частоты встречаемости генотипов hOGG1 Ser/Ser и Ser/Cys у детей из Таштагольского района по сравнению с контрольной группой (х2 = 10,9; р = 0,001 для hOGG1 Ser/Ser; х2 = 8,74; р = 0,03 для hOGG1 Ser/Cys).
Таблица 2
Распределение частот встречаемости генотипов (%) и уровня ХА (%) у доноров с различными генотипами системы репарации
ДНК
Полиморфизм Генотип Опытная группа Контрольная группа
N % XA (%) N % XA (%)
hOGG1 Ser326Cys Ser/Ser 29 45,3# 3,90 ± 0,49 108 70,1 2,81 ± 0,24
Ser/Cys 30 46,9# 3,74 ± 0,54 39 25,3 2,59 ± 0,18
Cys/Cys 5 6,8 4,60 ± 0,56* 7 4,14 3,14 ± 0,28
ADPRT Val762Ala Val/Val 37 55,2 3,15 ± 0,31** 106 62 2,58 ± 0,16
Val/Ala 26 38,8 4,76 ± 0,695 50 29,2 3,23 ± 0,27
Ala/Ala 4 6,9 5,50 ± 1,5* 15 8,8 2,47 ± 0,26
Примечание: N - объем выборки; # р < 0.05 - статистически значимое отличие частоты встречаемости указанного генотипа в опытной группе по сравнению с контролем; * р < 0.05 - статистически значимое отличие частоты ХА в опытной группе по сравнению с контролем; ** р < 0.05 - статистически значимое отличие частоты ХА у носителей генотипа ADPRT Val/Val по сравнению с ADPRT Ala/Ala в опытной группе;
ПОЛИТРАВМА
Частота встречаемости аллелей Ser и Cys hOGGl у детей из Ташта-гольского района составила 68,8 % и 31,2 % против 82,8 % и 17,2 % в контрольной группе.
Ген hOGGl (human 8-oxogua-nine DNA glycosylase) кодирует ключевой фермент эксцизионной репарации оснований, удаляющий из ДНК остатки 8-оксогуани-на, образующегося под действием активных форм кислорода. Один из полиморфизмов гена hOGGl, приводящий к замене Ser^Cys в 326 положении, ассоциирован со сниженной активностью фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы, что, в свою очередь, приводит к снижению индивидуальной способности к репарации повреждений ДНК и повышению чувствительности организма к мутагенам и канцерогенам.
Повышение частоты встречаемости у детей из Таштагольского района минорного аллеля Cys hOGGl, кодирующего ферменты со сниженной активностью репарации ДНК, может приводить к формированию повышенной чувствительности к ге-нотоксическому воздействию окружающей среды и, как следствие, к росту заболеваемости.
Для гена ADPRT статистически значимых различий частот встречаемости генотипов и аллелей между группами выявлено не было.
При анализе частоты ХА в зависимости от различных комбинаций аллельных генов системы репарации ДНК в опытной группе были выявлены значимые различия частоты ХА для носителей генотипов Val/Val и Ala/Ala гена ADPRT (3,15 ± 0,31 % для генотипа Val/ Val; 5,50 ± 1,5 % для генотипа Ala/Ala; р = 0,037). Ген ADPRT (adenosine diphosphate ribosyl transferase) кодирует ассоциированный с хроматином фермент поли-АДФ-рибозилполимеразу (PARP). Данный фермент вовлечен в реакции репарации ДНК, поврежденной химическими мутагенами, активными формами кислорода и ионизирующей радиацией. Аллель гена ADPRT, который несет замену Т^ С в локусе 2285, приводящую к аминокислотной замене Val^Ala в кодируемом белке, ассоциирован с пониженной способностью связывать белки репарации, что уменьшает эффективность всего процесса репарации ДНК. У детей из Таштагольского района — носителей генотипа ADPRT Ala/Ala, обнаружено наибольшее количество хромосомных нарушений (5,5 ± 1,5 %).
Таким образом, значимое повышение частоты ХА у гомозигот по минорному аллелю (у носителей генотипа Ala/Ala) по сравнению с гомозиготами по мажорному ал-лелю (носители генотипа Val/Val)
может свидетельствовать о вкладе данного генотипа в индивидуальную чувствительность к мутационному воздействию средовых факторов на здоровье человека.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
У детей, проживающих в условиях высокой генотоксической нагрузки, по сравнению с детьми из экологически благополучных территорий:
- повышен уровень структурных аберраций хромосом, что может приводить к повышению общей и онкологической заболеваемости;
- снижена частота мажорного ал-леля Ser326 гена hOGGl, что способно приводить к снижению эффективности репарации ДНК;
- повышена частота ХА у обладателей генотипа ADPRT Ala/Ala по сравнению с ADPRT Val/Val, что свидетельствует о существовании генетически детерминированной повышенной чувствительности к данным факторам среды.
Полученные данные свидетельствуют о целесообразности и перспективности проведения комплексных исследований: структурных нарушений хромосом и полиморфизма генов в эколого-генетиче-ской оценке различных территорий Кузбасса.
ЛИТЕРАТУРА: 7.
1. Смыслов, А.А. Радон в земной коре и риск радоноопасности /А.А. Смыслов, В.А. Максимовский, М.Г. Харламов //Разведка и 8. охрана недр. - 1994. - № 4. - С. 25-27.
2. Григорьева, С.А. Изучение генетически обусловленной чувствительности к действию мутагенов окружающей среды
в индуцированном мутагенезе у человека: Дис. ... канд. мед. 9. наук /С.А. Григорьева; НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН. - М., 2007. - 124 с.
3. Оценка влияния факторов среды на здоровье населения Кемеровской области: справочник /УправлениеРоспотребнадзора 10. по Кемеровской области. - Кемерово, 2009. - 230 с.
4. О санитарно-гигиенической обстановке в Кемеровской области в 2010 году: государственный доклад. - Кемерово, 2011. - 230 с.
5. Влияние полиморфизмов генов репарации ДНК на показатели нестабильности генома детей и подростков в условиях повышенной концентрации радона /А.В. Мейер [и др.] 1. //Медицинская генетика. - 2010. - № 2. - С. 3-7.
6. Hungerford, P.A. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the preparation of metaphase chromosomes by treat- 2. ment with hypotonic KCl /P.A. Hungerford //Stain Techn. - 1965.
- Vol. 40. - P. 333-338.
Хромосомы человека (атлас) /А.Ф. Захаров [и др.]. - М.: Медицина, 1982. - 263 с.
Дудкина, О.А Оценка влияния промышленных выбросов на окружающую среду и здоровье населения Таштагольского района Кемеровской области /О.А. Дудкина, В.И. Минина, К.Г. Громов //Экология промышленного производства. - 2011. - № 4. - С. 46-50. Дружинин, В.Г. Количественные характеристики частоты хромосомных аберраций в группе жителей крупного промышленного региона Западной Сибири /В.Г. Дружинин //Генетика. - 2003. - Т. 39, № 10. - С. 1373-1380. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов hOGG1 и ADPRT у коренного и пришлого населения Таштагольского района Кемеровской области /В.И. Минина [и др.] //Вестник КемГУ. - 2011. - № 3(47). - С. 6-9.
REFERENCES:
Smyslov A.A., Maksimovskiy V.A., Kharlamov M.G. Radon in earth crust and risk of radiation hazard. Razvedka i okhrana nedr. 1994; 4: 25-27 (In Russian).
Grigor'eva S.A. Study of the genetic sensitivity to action of the environment mutagens in human induced mutagenesis. Kand. med. sci. Diss. Moscow; 2007 (In Russian).
№ 1[март] 2013
3. The estimation of influence of the environment factors on health of population in Kemerovo region: the information book. Upravle-nie Rospotrebnadzora po Kemerovskoy oblasti. Kemerovo; 2009 (In Russian).
4. About sanitary-hygiene environment in Kemerovo region in 2012: state report. Kemerovo; 2011 (In Russian).
5. Meyer A.V. i dr. The influence of DNA repair gene polymorphism on the values of genome instability in children and adolescents in conditions of increased levels of radon. Meditsinskaya genetika. 2010; 2: 3-7 (In Russian).
6. Hungerford P.A. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl. Stain Techn. 1965; 40: 333338.
7. Zakharov A.F. i dr. Human chromosomes (atlas). Moscow: Medit-sina; 1982 (In Russian).
8. Dudkina O.A., Minina V.I., Gromov K.G. The evaluation of the influence of industrial emissions on the environment and the population health in Tashtagol district by Kemerovo region. Ekologiya promyshlennogo proizvodstva. 2011; 4: 46-50 (In Russian).
9. Druzhinin V.G. The quantitative characteristics of frequency of chromosome aberrations in the population group of the large industrial region in the Western Siberia. Genetika. 2003; 39 (10): 1373-1380 (In Russian).
10. Minina V.I. i dr. Molecular genetic analysis of hOGG1 and ADPRT gene polymorphism in indigenous and academic population of Tashtagol district by Kemerovo region. Vestnik KemGU. 2011; 3: 6-9 (In Russian).
Работа поддержана государственным контрактом ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» № 16.512.11.2062 и грантом РФФИ, 10-04-00497-а.
Сведения об авторах:
Соболева О. А., аспирант, м.н.с., лаборатория цитогенетики, ФГБУН Институт экологии человека СО РАН, г. Кемерово, Россия.
Минина В. И., к.б.н., доцент, заведующая лабораторией цитогенетики, ФГБУН Институт экологии человека СО РАН, г. Кемерово, Россия.
Дружинин В. Г., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой генетики, ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет», г. Кемерово, Россия; ведущий научный сотрудник, ФГБУН Институт экологии человека СО РАН, г. Кемерово, Россия.
Тимофеева А. А., инженер, лаборатория цитогенетики, ФГБУН Институт экологии человека СО РАН; аспирант, ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет», г. Кемерово, Россия.
Ларионов А. В., инженер, кафедра генетики, ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет», г. Кемерово, Россия.
Адрес для переписки:
Соболева О.А., ул. Спортивная, 22-43, г. Кемерово, Россия, 650066
Тел: +7-960-915-51-16
E-mail: [email protected]
Information about authors:
Soboleva О.A., postgraduate, junior research scientist, cytogenetic laboratory, Institute of Human Ecology, Kemerovo, Russia.
Minina V.I., candidate of biological sciences, docent, head of cytogenetic laboratory, Institute of Human Ecology, Kemerovo, Russia.
Druzhinin V.G., doctor of biological sciences, professor, head of chair of genetics, Kemerovo State University; leading research worker, Institute of Human Ecology, Kemerovo, Russia.
Timofeeva А.A., engineer, cytogenetic laboratory, Institute of Human Ecology; postgraduate, Kemerovo State University, Kemerovo, Russia.
Larionov А.V., engineer, chair of genetics, Kemerovo State University, Kemerovo, Russia.
Address for correspondence:
Soboleva N.A., Sportivnaya St., 22-43, Kemerovo, Russia, 650066
Tel: +7-960-915-51-16
E-mail: [email protected]
■
ПОЛИТРАВМА
