CC BY
55
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 613.6:311.22]:575.08
Я.А. Савченко, В.И. Минина, М.Л. Баканова
ХРОМОСОМНЫЕ АБЕРРАЦИИ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕнОБИОТИКОВ И Репарации днК У РАБОТнИКОВ
теплоэнергетики
'ФГБУН Институт экологии человека Сибирского отделения Российской академии наук, Кемерово
В статье представлены результаты исследования хромосомных аберраций и генов ферментов детоксикации ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1) и репарации ДНК (hOGG1, XPD) у работников теплоэнергетического комплекса г. Кемерово. Показано, что в группе рабочих частота метафаз с аберрациями (3,9 ± 0,2%; n = 288) статистически значимо выше, чем в группе сравнения (2,1 ± 0,2%; n = 141). В группе рабочих, выполняющих основные производственные операции, отмечено повышение частоты встречаемости генотипов: Ser/Cys гена hOGG1 и «0/0» гена GSTT1. Однако влияние генотипов GSTM1, GSTT1, hOGG1, XPD на частоту хромосомных аберраций у рабочих выявлено не было, что свидетельствует о приоритетной роли экологических факторов в повреждении хромосом.
Ключевые слова: теплоэнергетика, хромосомные аберрации, полиморфизм генов GSTM1, GSTT1, hOGG1, XPD
Ya. A. Savchenko, V I. Minina, M. L. Bakanova — CHROMOSOMAL ABERRATIONS AND GENETIC POLYMORPHISM IN THE XENOBIOTICS DETOXIFICATION AND DNA REPAIR ENZYMES GENES IN FUEL AND Energy complex EMpLOYERS.
Federal State Budgetary Institution of Science Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Kemerovo, Russia
The results of the investigation of the interrelationship between frequency of chromosomal aberrations and detoxification enzymes (GSTM1, GSTT1) and DNA repair (hOGG1, XPD) genes in the employees of fuel energy complex in Kemerovo are presented. In the group of the workers frequency of metaphases with aberrations (3,9 ± 0,2%; n = 288) was shown to be significantly higher than in the comparison group (2,1 0,2%; n =± 141). In the group of workers and control donors statistically significant differences were revealed in the frequency of distribution of the GSTT1 and hOGG1 genes. The level of chromosomal aberrations was established to be higher in patients with GSTM1 genotype "0/0" in the group of control donors.
Key words: fuel and energy complex, chromosomal aberrations, polymorphisms gene GSTM1 and GSTT1, hOGG1, XPD
Современное производство характеризуется многообразием контактов работающих с потенциальными мутагенами и канцерогенами, действие которых проявляется различными генотоксическими эффектами [1]. Одна из наиболее неблагоприятных в экологическом отношении отраслей промышленности - теплоэнергетика. Согласно данным литературы, рабочие, занятые на предприятиях теплоэнергетики, подвержены воздействию целого комплекса негативных физических и химических факторов, вследствие чего могут появляться нарушения в генетическом аппарате человека [4]. Важнейшую роль в защите генома клетки от воздействия канцерогенов играют системы ферментов детоксикации ксенобиотиков и репарации ДНК. В настоящее время в литературе имеются указания на возможность использования генотипов генов II фазы биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1) в качестве биомаркеров чувствительности в группах инвалидов, подвергающихся воздействию вредных химических веществ [2, 8]. Накоплен также определенный экспериментальный материал по изучению роли отдельных аллельных вариантов генов репарации в формировании индивидуальной чувствительности к широкому спектру наиболее распространенных мутагенов [2].
В связи с вышесказанным целью нашего исследования явилось изучение хромосомных аберраций (ХА) у
Савченко Я.А. - аспирант, мл. науч. сотр. группы цитогенетики (yasavchenko@ya.ru); Минина В.И. - канд. биол. наук, доц., ст. науч. сотр. группы цитогенетики; Баканова М.Л. - аспирант, мл. науч. сотр. группы цитогенетики.
рабочих теплоэнергетического комплекса (ТЭК) с учетом полиморфизма генов ферментов детоксикации ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1) и репарации ДНК (hOGG1, XPD).
Материалы и методы
Было обследовано 429 работников ТЭК г. Кемерово. Исследуемую группу составили 288 рабочих основных производственных цехов со стажем работы во вредных условиях труда 14,7 ± 0,5 года (средний возраст 41,9 ± 0,5 года). В контрольную группу вошел 141 человек, не занятый на основном производстве (работники заводоуправления и центра здоровья «Энергетик») со стажем работы 14,8 ± 0,7 года (средний возраст 43,9 ± 0,7 года).
Материалом для исследования послужила цельная периферическая кровь, забиравшаяся в период медицинских осмотров. Культивирование клеток крови осуществляли по стандартному полумикрометоду [7]. Питательную смесь готовили из расчета: среда RPMI-1640 (4,5 мл), сыворотка крупного рогатого скота (1 мл) и 0,1 мл фитогемагглютинина (ПанЭко). Смесь помещали в стерильные культуральные флаконы и добавляли 0,5 мл гепаринизированной крови. Культуральные флаконы выдерживали при 37°С в течение 48 ч. За 2 ч до фиксации в культуры вводили колхицин (0,5 мкг/мл). После гипотонической обработки и фиксации клеток суспензию раскапывали на охлажденные чистые предметные стекла и высушивали над пламенем спиртовки. Препараты окрашивали 1% красителем Гимзы и анализировали под микроскопом Axioskop 2 plus («Carl Zeiss», Германия). Для учета ХА у каждого индивида проанализировано от 100 до 200 метафаз. Долю аберрантных метафаз определяли путем подсчета частоты метафаз c ХА.
73
[гиена и санитария 6/2012
Для анализа полиморфизма генов из периферической крови выделяли геномную ДНК с помощью метода фенол-хлороформной экстракции. Для типирования нулевых аллелей генов GSTM1 и GSTT1 использовали метод амплификации специфических участков исследуемых генов с флюоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени (real-time PCR), разработанный в Институте химической биологии и фундаментальной медицины CО РАН (Новосибирск). Амплификацию проводили с помощью амплификатора iCycler iQ5 («BioRad», США). Для типирования полиморфизмов генов репарации ДНК hOGGl Ser326Cys, XPD Lys75l-Gln использовали метод аллельспецифической ПЦР (НПФ «Литех», Москва). Амплификацию выполняли с использованием амплификатора ТЕРЦИК (НПФ «ДНК-Технология», Россия) по программе, рекомендованной производителем набора. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в горизонтальном 3 % агарозном геле. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
Статистическую обработку материалов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для основных показателей рассчитывали средние значения и их стандартные ошибки. Распределение всех использованных показателей сравнивалось с нормальным (методом Колмогорова-Смирнова). По результатам анализа установлено, что распределение всех изучаемых цитогенетических параметров отличалось от нормального. На основании этого в дальнейшем для сравнения групп использовали ранговый U-тест Манна-Уитни. Сравнение частот генотипов проводили с помощью четырехпольной таблицы сопряженности с поправкой Йетса на непрерывность вариации (%2). Нулевую гипотезу отвергали при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
В результате проведенного анализа ХА было установлено, что частота ХА в исследуемой группе составила 3,9 ± 0,2%, что статистически значимо выше, чем у контрольных доноров - 2,1 ± 0,2% (UM-W = 11298,00;
р < 0,001).
На следующем этапе исследования изучали полиморфизм генов ферментов детоксикации ксенобиотиков (GSTMl, GSTT1) и репарации ДНК (hOGGl, XPD) в исследуемых группах.
Анализ генотипов GSTM1 и GSTT1 в изученных группах показал, что частота GSTM1 «0/0» в исследуемой группе составила 44,5%, в группе контроля - 50,4% (х2 = 1,07; p = 0,3003). Частота гомозигот по делеции гена GSTT1 в исследуемой группе равнялась 31,8%, в группе контрольных доноров - 22,1% (х2 = 4,28; p = 0,038б). Таким образом, было выявлено статистически значимое отличие в распределении делеционных вариантов гена GSTT1, что может свидетельствовать о селективных процессах в производственной группе.
Статистически достоверно значимые различия частот генотипов гена XPD в изученных группах не выявлены. Частота минорного генотипа Gln/Gln в исследуемой группе составила 14,9%, в группе контрольных доноров - 16,7%. Частота генотипов Lys/Lys и Lys/Gln генаXPD была равна 36,5 и 48,6% в исследуемой группе и 37,7 и 45,6% в группе контроля соответственно.
Исследование полиморфизма гена hOGGl в изученных группах показало, что частота генотипа Ser/Ser со-
ставила 42,6% в исследуемой группе и 62,4% в группе контроля. Минорный генотип Cys/Cys гена hOGGl в группе рабочих встречался с частотой 3,1%, тогда как в группе контроля обнаружен не был, что может быть связано с недостаточным объемом выборки при невысокой частоте встречаемости данного генотипа у европеоидов
- до 5,4% [13]. По результатам генотипирования hOGGl, в исследуемой группе (рабочие основных цехов) наблюдались статистически значимое повышение частоты встречаемости гетерозигот Ser/Cys (х2 = 9,17; p = 0,003) и снижение частоты гомозигот по мажорному аллелю Ser/ Ser (х2 = 6,44; p = 0,011) что потенциально способно приводить к снижению репаративных резервов организма у рабочих ТЭК.
Результаты связи хромосомных нарушений с полиморфными вариантами генов детоксикации ксенобиотиков (GSTMl, GSTT1) и репарации ДНК (hOGGl, XPD) представлены в таблице.
В ходе проведенного анализа были установлены достоверные различия между исследуемой группой и группой контрольных доноров по частоте ХА для генов GSTMl, GSTTl, генотипов Ser/Ser, Ser/Cys гена hOGGl и генотипов Lys/Lys, Lys/Gln гена XPD. Не были выявлены достоверные различия уровня ХА у лиц с разными генотипами GSTMl, GSTTl, hOGGl, XpD внутри исследуемой группы. В группе контроля наблюдались статистически значимые различия по гену GSTMl. У доноров с генотипом GSTMl «0/0» частота ХА равнялась 2,6 ± 0,3% (п = 60), а с генотипом GSTMl « + » - 1,8 ± 0,2% (п = 66; UM-W = 1548,00; р = 0,0348).
В последние годы появились публикации, посвященные выявлению связи генетического полиморфизма с различными цитогенетическими нарушениями у лиц, контактирующих с потенциальными мутагенами и канцерогенами окружающей среды. Установлено, что у рабочих с делецией по гену GSTTl увеличивается частота хромосомных повреждений при воздействии оксида этилена и дезоксибутана [5, 7]. Была установлена взаимосвязь между частотой ХА и наличием GSTTl «0/0»
- генотипа при воздействии 1,3-бутадиена [10]. При обследовании дорожных рабочих, прокладывающих туннели и подвергающихся воздействию пыли, диоксида азота, дизельных выхлопов и масел, было установлено, что полиморфизм генов CYPlAl и GSTMl не оказывал
Уровень аберрантных метафаз (в %) у доноров с различными генотипами ферментов детоксикации ксенобиотиков и репарации днк
Ген Генотип Исследуемая группа Группа контроля
n ХА, % n ХА, %
GSTMl «0/0» 110 4,0 ± 0,3* 60 2,6 ± 0,3**
«+» 137 3,7 ± 0,2* 66 1,8 ± 0,2
GSTTl «0/0» 86 4,3 ± 0,3* 31 2,6 ± 0,5
«+» 181 3,6 ± 0,2* 106 1,9 ± 0,2
hOGGl Ser326Cys Ser/Ser 46 3,1 ± 0,3* 70 1,9 ± 0,2
Ser/Cys 56 3,7 ± 0,4* 39 2,4 ± 0,4
Cys/Cys 4 3,0 ± 1,1 0 0
XPD Lys75lGln Lys/Lys 29 3,1 ± 0,4* 37 2,0 ± 0,3
Lys /Gln 42 3,5 ± 0,4* 47 1,9 ± 0,3
Gln/ Gln 14 3,3 ± 0,4 17 2,2 ± 0,5
Примечание. * - p <0,05, достоверное отличие от группы контроля; ** - p = 0,03, достоверное отличие от доноров с генотипом GSTMl «+» группы контроля.
74
значимого влияния на уровень сестринских хроматид-ных обменов и микроядер [11]. У лиц, подвергающихся интенсивному мутагенному воздействию стирола, не было обнаружено взаимосвязи делеции гена GSTM1 и GSTT1 с уровнем хромосомных нарушений [12]. В группе рабочих ТЭЦ ранее нами было показано влияние полиморфных вариантов генов GSTM1 и GSTT1 на частоту ХА у рабочих ТЭК [4]. В то же время после увеличения объема выборки рабочих основных производственных цехов, выполненного в данном исследовании, подобные ассоциации уже не наблюдались.
В ряде исследований установлено, что носитель-ство аллеля hOGGl 326Cys сопровождается сниженной функциональной активностью кодируемого им фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы [6], что сопровождается повышенной частотой аберраций в лимфоцитах крови [9]. Однако в данном исследовании влияния полиморфизма генов репарации ДНК на частоту ХА, индуцированных мутагенами ТЭК, выявлено не было.
Заключение
По результатам проведенного исследования у рабочих ТЭК установлено статистически значимое повышение уровня ХА в лимфоцитах крови и показано увеличение частоты встречаемости генотипов, связанных со снижением репаративных возможностей организма (hOGGl Ser/Cys) и способности к эффективной детоксикации ксенобиотиков (GSTT1 «0/0»). Однако влияния генотипов ферментов детоксикации (GSTM1, GSTT1) и репарации ДНК (hOGGl, XPD) на частоту ХА у рабочих
выявлено не было, что свидетельствует о приоритетной роли экологических факторов в повреждении хромосом.
Литер атур а
1. Измеров Н.Ф. // Медико-экологические проблемы здоровья работающего населения. - М.; Новокузнецк, 2000. - С. 3-11.
2. Минина В.И. // Мед. генетика. - 2011. - № 9. - С.11-19.
3. Минина В.И., Дружинин В.Г., Лунина А.А. и др. // Экол. генетика. - 2011. - Т 9, № 2. - С. 74-79.
4. Савченко Я.А., Дружинин В.Г., Минина В.И. и др. // Генетика. - 2008. - Т 44, № 6. - С. 857-862.
5. Bruning Т., Lammert M., Kempkes M. et al. // Arch. Toxicol. -1997. - Vol. 71, N 9. - P. 596-599.
6. Dherin C., Radicella J. P., Dizdaroglu M. et al. // Nucl. Acids Res. - 1999. - Vol. 27, N 20. - P. 4001- 4007.
7. Huang C.Y., Huang K.L., Cheng T.J. et al. // Arch. Toxicol. -1997. - Vol. 71, N 8. - P. 482-488.
8. Lee K.H., Lee J., Ha M. et al. // J. Toxicol. Environ. Health. -2002. - Vol. 65, N 5-6. - P. 355-363.
9. Skjelbred C. F., Svendsen M., Haugan V. et al. // Mutat. Res. -2006. - Vol. 602, N 1-2. - P. 151-162.
10. Sram R.J. // Environ. Health Perspect. - 1998. - Vol. 106 (suppl. 1). - P. 231-239.
11. Villarini M., Moretti M., Fatigoniet C. et al. // J. Toxicol. Environ. Health. - 2008. - Vol. 71, N 21. - P. 1430-1439.
12. Vodicka P., Soucek P., Tates A. D. et al. // Mutat. Res. - 2001. -Vol. 482, N 1-2. - P. 89-103.
Поступила 10.02.12
© В.И. ТЕЛЬНОВ, 2012 УДК 614.876:577.21
В.И. Тельнов
взаимодействие генетических и радиационных факторов в реализации эффектов облучения у людей
Южно-Уральский институт биофизики ФМБА России, Озерск Челябинской области
Представлены результаты изучения взаимодействия генетических и радиационных факторов в реализации эффектов облучения у людей, подвергшихся внешнему и (или) внутреннему радиационному воздействию. Установлено, что в большинстве случаев при относительно меньшем радиационном воздействии генотипические различия в эффектах облучения отсутствуют. При большей интенсивности радиационного воздействия, напротив, эти различия, как правило, имеют достоверный характер. Взаимодействие генетических и радиационных факторов проявлялось в широком диапазоне: от взаимного стимулирования первично недействующих факторов до взаимодействия выше мультипликативного.
Ключевые слова: генетический полиморфизм, радиационное воздействие, детерминированные и стохастические эффекты, взаимодействие факторов
VI. Tel’nov - INTERACTION OF GENETIC AND RADIATION FACTORS IN THE REALIZATION OF EFFECTS OF RADIATION IN HUMANS
Federal State Unitary Enterprise Southern Urals Biophysics Institute of the Federal Medical and Biological Agency of Russia, Ozersk, Chelyabinsk region, Russia
The results of the study of the interaction of genetic and radiation factors in the effects of radiation in humans exposed to external and (or) internal radiation are presented. In most cases, with relatively less radiation exposure genotypic differences in the effects of exposure were established to be absent. At high intensities of radiation exposure, however, these differences as a rule have reliable character. Interaction of genetic and radiation factors manifested in a wide range: from the mutual stimulation of primarily inactive factors to the higher than multiplicative one.
Key words: genetic polymorphism, radiation exposure, deterministic and stochastic effects, interaction offactors
Известно, что при воздействии неблагоприятных
_____________ факторов внешней среды не у всех индивидов развива-
Тельнов В.И. - ст. науч. сотр., канд. мед. наук, зам. дир. по на- ются шрушения или заб°левания. Эт° обст°ятельств°
учной работе (tvi@subi.su). является отражением неодинаковых индивидуальных
75
