CC BY
12
Хроматомасс-спектрометрическое определение внутриутробной инфицированности плода по материалам беременных с фетоплацентарной недостаточностью
З.М.Османлы
Азербайджанский государственный институт усовершенствования
врачей им. А.Алиева, г.Баку
Фетоплацентарная недостаточность (ФПН) - это клинико-морфологический симптомоко-мплекс, возникающий как результат сочетан-ной реакции плода и плаценты на различные нарушения состояния материнского организма [1].
Инфекция у беременных является одной из ведущих причин, приводящей к формированию плацентарной недостаточности и определяющей состояние здоровья новорожденных [2, 3]. В этой связи следует отметить, что женщины с хроническими очагами гени-тальной инфекции имеют исходную гипофункцию яичников, что приводит к формированию неполноценного фетоплацентарного комплекса. В последующем инфекционные агенты проникают в плодные оболочки и плаценту вызывая нарушение ее функций и, естественно, обусловливает внутриутробное инфицирование (ВУН) плода [4, 5, 6].
В настоящее время не существует прямых (неинвазивных) методов диагностики, доказывающих наличие активного инфекционного процесса у плода.
В связи с отмеченным встает вопрос о поиске косвенных достоверных методов прогнозирования развития инфекционного процесса у новорожденного на основании результатов обследования матери. Наиболее важным вопросом является прогнозирование внутриутробного инфицирования во время беременности с целью своевременного лечения данной категории пациенток и тем самым снижения младенческой заболеваемости и смертности.
Целью настоящего исследования была отработка и внедрение метода хроматомасс-спектрометрии по детекции бактериальной
флоры на материале от беременных и родильниц с фетоплацентарной недостаточностью и хронической инфекцией гениталий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Исследовался мазок с вагины беременной с ФПН с разведением содержимого 1:1 физиологическим раствором. С целью определения инфицированности плаценты была исследована суспензия из плацентарной ткани родильницы с ФПН.
Детекция бактериальной флоры и в вагине и в плаценте у пациенток с ФПН осуществлялась с применением метода хроматомасс-спектрометрии [7, 8, 9] на аппарате: хроматомасс-спектрометр газовый GCMS -QP2010SE, Shimadzu (рис. 1).
Суть метода. Газово-жидкостная хроматография -универсальный метод разделения смесей разнообразных веществ, испаряющихся без разложения. При этом компоненты разделяемой смеси перемещаются по хроматографической колонке с потоком инертного газа (газа-носителя).
Разделяемая смесь многократно распределяется газом-носителем (подвижной фазой) и нелетучей неподвижной жидкой фазой, нанесенной на инертный материал (твердый носитель), которым заполнена колонка. Принцип разделения - неодинаковое сродство органических веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке.
Компоненты смеси селективно удерживаются неподвижной фазой, а затем выходят из колонки и регистрируются детектором.
Сигналы детектора записываются в виде хрома-тограммы и регистрируются на экране компьютера.
Рис. 1. Хроматомасс-спектрометр газовый GCMS-QP2010SE, Shimadzu
Рис. 2. Спектр маркеров микроорганизмов, детектированных в вагинальной
жидкости беременной с ФПН
Хроматомасс-спектрометрия - новый этап в развитии хроматометрии.
Применение масс-спектрометра в качестве детектора газового хроматогрофа потребовало самостоятельного наименования. Эта комбинация была названа хроматомасс-спектрометрией. Масс-спектрометр обладает способностью не только зарегистрировать появление в нем разделяемого компонента, но и установить его структуру. Широкое применение хромато-масс-спектрометров вызвало необходимость создания гигантских библиотек - баз данных спектров всевозможных соединений.
В основе метода лежит использование химического состава клеток микроорганизмов для целей медицинской диагностики.
В процессе метаболизма микробные клетки производят низшие карбоновые кислоты, являясь как бы "визитной карточкой" того или иного микроорганизма.
Идентификация проводится в соответствии со списком веществ банка данных с отнесением к микроорганизмам, у которых наиболее часто встречаются (NIST) (National Institute Standart Technology) [10].
Вещества в отмеченном списке приведены в порядке возрастания числа атомов углерода в цепи молекулы, что соответствует хроматографическому времени удерживания (tr) (Retention time).
Определение качественного состава смеси проводится путем сопоставления времени удерживания данного компонента и эталона вещества известной структуры. Совпадение времени удерживания эталона и определяемого компонента указывает на их идентичность.
Каждому компоненту смеси на хроматограмме соответствует отдельный пик.
Время от начала хроматограммы до появлении вершины пика называется временем удерживания.
Определение количественного состава смеси основано на допущении того, что интенсивность пика
каждого компонента пропорциональна его содержанию в смеси.
Анализу предшествовал период пробоподготовки - выделение фракции жирных кислот и перевод их в соединения, удобные для хроматографического анализа [8]. После биоподготовки пробу в количестве 0,4 мл высушивали при добавлении метанола в количестве 0,2 мл.
Далее добавляли 0,2 мл 1,7 M HCL в метаноле и проводили метанолиз при температуре 80 градусов в течение 1 часа.
В результате реакции метанолиза жирные кислоты (ЖК) освобождаются в виде метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК).
Вышеуказанные компоненты двукратно экстрагировали гексаном по 200 мкл. Реакционную смесь в количестве 2 мкл вводили в инжектор хроматомасс-спектрометра.
Хроматографическое разделение осуществляли на капиллярной колонке длиной 50 м, диаметром 0,32 мм, с толщиной пленки фазы 0,53 мкм (микрон).
Режим хроматографирования 120 град. - 2 мин 15 град/мин до 230 град.
Масс-спектрометр квадрупольный ионизацией электронным ударом (70 экв). Режим - scan.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Результаты хроматомасс-спектрометрии содержимого вагины обследуемой беременной с ФПН выявил наличие маркеров: Pentadеca-noic acid, 14-methyl, methyl ester; Octadeca-noic acid, methyl ester; 11-Octadecеnoic acid, methyl ester; 9-12-Octadecadienoic acid, methyl ester (EE) (рис. 2).
Выявленные маркеры сверяются по времени удерживания (tr) по смеси стандартов метиловых эфиров жирных кислот фирмы Supelko (США) - 37 компонентов (Mix Stan-
Рис. 3. Характеристический спектр ионов пентадекановой кислоты Pentadecanoic acid, 14 methyl, methyl ester
Рис. 4. Характеристический спектр ионов пентадекановой кислоты Pentadecanoic acid, 14 methyl, methyl ester no NIST (стандарт)
Рис. 5. Спектр маркеров микроорганизмов, детектированных в плаценте у
родильницы с ФПН
dart Fat 37 component).
К примеру на рисунке 3 представлен характеристический спектр ионов пентадекановой кислоты (Pentadecanoic acid, 14 methyl, methyl ester), который сравнивается со стан-
дартом (рис. 3, 4).
В таблице 1 дан спектр жирных кислот и соответствующих им микроорганизмов, детектированных в вагине.
Результаты исследования суспензии пла-
Name Ret.time Area
Pentadecanoic acid, 14 - methyl, methyl ester 31.726 4177908
Octadecanoic acid, methyl ester 35.752 612794
9-Octadecenoic acid, methyl ester, (E) 37.003 3697742
9-Octadecenoic acid (Z)-, methyl ester 37.087 84273
9,12-Octadecadienoic acid, methyl ester, (E,E) 38.803 6524308
Eicosanoic acid, methyl ester 39.584 84153
12,15-Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z) 40.580 112574
Рис. 6. Характеристический спектр ионов пентадекановой кислоты Pentadecanoic acid, methyl ester
Рис. 7. Характеристический спектр ионов Pentadecanoic acid, 14 methyl, methyl ester no NIST (стандарт)
центы обследуемой родильницы с ФПН выявил наличие маркеров: Pentadecanoic acid, 14 methyl-methyl ester, Octadecanoic acid, methyl ester, 9-Octadecenoic acid, methyl ester (E), 9 Octadecenoic acid (Z), methyl ester, 9,12 Octadecadiеnoic acid, methyl ester(E,E); Eico-sanoic acid, methyl ester; 12,15 Octadecatri-enoic acid, methyl ester (Z,Z,Z) (Рис. 5).
На рисунках 6 и 7 представлены характеристический спектр ионов Pentadecanoic acid, 14 methyl-methyl ester, сравниваемый со стандартом данной кислоты по Mix standart Fat (37 component).
В таблице 2 представлен спектр жирных кислот и соответствующих им микроорганизмов, детектированных в плаценте.
Таким образом, при исследовании случая беременности с угрозой прерывания ее при ФПН и хронической инфекции гениталий была выявлена инфекция в вагине и инфици-рованность плаценты, что, возможно говорит о восходящем и гематогенном пути внутриутробного инфицирования.
Резюмируя вышеотмеченное, следует вывод о том, что спектр детектированных микроорганизмов говорит о возможности
Таблица 1. Спектр жирных кислот в клеточной стенке с отнесением их к микроорганизмам, выявленным в вагине беременных женщин с фетоплацентарный
недостаточностью (ФПН)
№ Обозначение Название кислот Микроорганизмы
Жирные кислоты
1 С 15:0 i Pentadiecanoic acid, 14-methyl, methyl ester (Изопентадекановая) Propionibacterium, Bacteroides
2 С 18:0 Octadecanoic acid, methyl ester. (Стеариновая) Многие организмы
С 18:1 11-Octadecanoic acid, methyl ester Afipia, Helicobacter mustelae
(11-метилоктадеценовая кислота)
4 С 18:2 9-12-Octadecanoic acid, methylester (EE) (Линолелаидиновая) Грибы, дрожжи
Таблица 2. Спектр жирных кислот в клеточной стенке с отнесением их к микроорганизмам, выявленным в плаценте у родильниц с фетоплацентарный
недостаточностью (ФПН)
№ Обозначение Название кислот Микроорганизмы
1 С 15:0 Pentadiecanoic acid, 14-methyl, methyl ester (Изопентадекановая) Propionibacterium, Bacteroides
2 С 18:0 Octadecanoic acid, methyl ester. (Стеариновая) Многие организмы
3 С 18:1 11-Octadecenoic acid, methyl ester (E) (Олеиновая) Все организмы
4 С 18:1 9- Octadecanoic acid (Z) -, methyl ester (Элаидиновая) Грибы, дрожжи
5 С 18:2 9-12- Octadecenoic acid, methyl ester, (E.E) (Линолелаидиновая) Грибы, дрожжи, простейшие
6 С 20:0 Eicosanoic acid, methyl ester (Эйкозановая кислота) Actinomyces
7 С 18:3 12,15 - Octadecanoic acid, methyl ester(Z,Z,Z) (Линоленовая кислота) Грибы, дрожжи, простейшие
выявления не только аэробов, но и факультативных анаэробов, капсульных бактерий, факультативных внутриклеточных паразитов при использовании хроматомасс-спектро-метрии.
Кроме того, использование методов ГХ -МС экономит время (9,5 час) по сравнению с традиционными методами посевов и пересевов, особо при диагностике анаэробов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Милованов А.П., Кирюшенков П.А., Шмаков Р.Г. и др. Плацента - регулятор гемостаза матери. //Акуш. и гинек. 2001, N.3, с.3-5.
2. Цинзерлинг А.В., Шабалов Н.П. Внутриутробные инфекции (частота и диагностика). // Арх. патол., 1992, N.1, с 24-30.
3. Bricxer L., Farquharson R.C. Types of pregnancy loss in recurrent miscarriage: impl^adon for research and clinical practice. // Human Reprodaction, 2002, v. 17, N.5, p. 1345-1350.
4. Сидельникова В.М., Невынашивание беременности. М., Медицина, 1986, 175 с.
5. Сидорова И.Е., Макаров И.О. Фетоплацентарная недостаточность. Клинико-диагностические аспекты. М., Знание, 2000, с. 126.
6. Бубнова Н.И., Тютюнник В.Л., Михайлова О.И. Репродуктивные потери при декомпенсированной плацентарной недостаточности, вызванной инфекцией. // Акуш. и гинек., 2010, N.4 с.55-58.
7. Зеленин К.Н. "Газовая хроматография в медицине". ("Военно-медицинская академия"), Санкт-Петербург, 1996 г
8. Осипов Г.А. Хромато-масс-спектрометрические исследование микроорганизмов и их сообществ. Докт. дисс.... д.б.н.. Москва, 1996 г
9. Осипов Г.А., Демина А.М. Хромато-масс-спектрометричес-кое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах. Вестник РАМН, 1996, т.13, N.2, с.15-27.
10. Струкова Е.Г., Ефремов А.А., Гонтова А.А., Осипов Г.А., Сарматова Н.И. Определение микроэкологического статуса и диагностика инфекций организма человека с использованием метода хромато-масс-спектрометрии. "Journal of Siberian Federal University". Chemistry 4 (2009, 2), 351-358.
SUMMARY
Chromatography-spectrometric determination intrauterine infection of the fetus based on pregnant women with placental insufficiency Z.Osmanli
A.Aliyev's Azerbaijan State Medical Institute for physician's improvement, Baku
The method of gas chromatography - spectroscopy of fatty acids - markers of microorganisms in the vaginal contents and extract the placenta in parturient women with threatened mis-
carriage with placental insufficiency (FPI) revealed the population of bacterial flora from the vagina of pregnant (FPI) detection markers bacterial genera Francisella, Bacillus, Serratia marcescens, Selemonos, Clostridium sporoge-nes, Bacteroides succinogenes, Bact. Ruminicola, Pseudomonas stutzeri. The correlation of the markers of microorganisms in the vagina and in the placental extract, with some additions of microorganisms in the placenta - mushrooms and yeast.
Поступила 27.08.2012
