CC BY
159
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦВЕТКОВ ДЕВЯСИЛА ВЫСОКОГО
ДЕРГАЧЁВА Ж.М., ТУРИНА Н.С.
УО «Витебский государственный медицинскийуниверситет»
Резюме. Одним из распространенных растений европейской флоры является девясил высокий (Inula helenium). Сложноцветные (Asteraceae), официнальным лекарственным растительным сырьем (ЛРС) которого являются корневища и корни. В статье представлены результаты качественного анализа нового вида ЛРС - цветков девясила высокого. Для цветков девясила высокого разработаны критерии подлинности, включающие качественные реакции на флавоноиды и тонкослойную хроматографию (ТСХ). Проведен анализ хлороформной, эфирной, этилацетатной фракций извлечения из цветков девясила высокого методом бумажной хроматографии в системе 15% уксусная кислота. Обнаружено, что во всех исследованных фракциях цветков девясила высокого содержится кверцетин.
Проведено изучение флавоноидного состава цветков методом ТСХ на пластинках со слоем силикагеля в системах: А. толуол -этилацетат - уксусная кислота (36:12:5), Б. этилацетат - муравьиная кислота - уксусная кислота - вода (100:11:11:26); а также на целлюлозных пластинках методом двумерной хроматографии в системе растворителей: первое направление - н-бутанол - кислота уксусная -вода (6:8:3); второе направление - 15%-ная уксусная кислота.
Ключевые слова: девясил высокий, хроматографическое
исследование.
Abstract. One of the widespread plants of the European flora is Inula helenium (fam. Compositae), medicinal vegetative raw materials of which are rhizomes and roots. The results of the qualitative analysis of a new kind of
medicinal vegetative raw materials - of Inula helenium flowers are presented in this article. The criteria of authenticity for Inula helenium flowers including qualitative reactions to flavonoids and thin-layer chromatography (TLC) have been developed. The analysis of chloroformic, etheric, ethyl acetatic fractions of extraction from Inula helenium flowers has been carried out by the method of paper chromatography in the system of 15% acetic acid. Quercetine has been found to be present in all investigated fractions of Inula helenium flowers. The flavonoids composition of Inula helenium flowers has been investigated by TLC method on plates with a layer of silicagel in the systems: A. toluene - ethyl acetate - acetic acid (36:12:5), B. ethyl acetate - formic acid - acetic acid - water (100:11:11:26); and also on cellulose plates by the method of two-dimensional chromatography (2D-TLC) in the system of solvents: the first direction - n-butanol - acetic acid - water (6:8:3); the second direction - 15% acetic acid.
Адрес для корреспонденции: Республика
Беларусь, 210023, г. Витебск, ир.Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра фармакогнозии, тел. 37- 09- 29 - ГуринаН.С.
С каждым годом растёт интерес современной медицины к лекарственным растениям. Расширяется и углубляется изучение целебных растений, растёт их заготовка, всё больше выпускается лекарственных средств растительного происхождения [1, 2].В настоящее время изучение лекарственных растений невозможно представить без хроматографических методов анализа [3, 4] .В анализе биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения наибольшее
распространение получили методы хроматографии на бумаге, в тонких слоях сорбента и газожидкостная хроматография.
Из перечисленных хроматографических методов первым получил официальное признание в фармацевтическом анализе метод хроматографии на бумаге. Однако, бумажная хроматография (БХ) имеет ряд существенных недостатков (большая затрата времени - от 5 до 36 ч, малая разделяющая способность и др.) и поэтому в настоящее время используется сравнительно редко.
Недостатки метода хроматографии на бумаге, отмеченные выше, легко устранимы при использовании метода хроматографии в тонких слоях сорбента. Преимуществами данного метода перед БХ является не только быстрота, но и более четкое разделение (меньшее расширение пятен), открытие пятен путем обработки хроматограмм агрессивными проявителями при повышенных температурах [5].Хроматографические методы анализа используется как для обнаружения и идентификации, так и для количественного определения БАВ растительного происхождения [6, 7].Одним из распространенных растений
европейской флоры, требующим тщательного изучения является девясил высокий (Inula helenium) сем. Сложноцветные (Asteraceae), широко применяемый как в научной, так и в народной медицине.
Девясил высокий - многолетнее травянистое растение, высотой до 250 см, с толстым, коротким, многоглавым корневищем, от которого отходят довольно длинные (до 50 см), немногочисленные придаточные корни. Стебель (один или несколько) прямостоячий, бороздчатый, опушенный короткими, густыми, белыми волосками, в верхней части коротковетвистый.
Листья очередные крупные, сверху жестко-волосистые, снизу мягкие, серо-войлочные, по краям неравнозубчатые. Прикорневые листья продолговато-эллиптические, крупные - до 50 см длиной и 25 см
3
шириной, с суженным в длинный черешок основанием. Стеблевые листья продолговато-яйцевидные полустеблеобъемляющие с сердцевидным основанием, нижние на черешках, верхние сидячие. Цветки собраны в соцветия - корзинки до 8 см в диаметре. На верхушке главного стебля и ветвей корзинки образуют рыхлые кисти или щитки. Цветки золотисто-желтые, с грязно-белым хохолком волосков. Обертка полушаровидная из многочисленных черепитчато-расположенных листочков. Плод - четырехгранная, бурая, гладкая семянка, 4-5 мм длиной, с хохолком из одного ряда буровато-белых зазубренных волосков, превышающих в два раза длину плода. Цветет девясил высокий в июле-августе, плоды созревают в августе-сентябре [8, 9].
В медицинской практике применяют корневища и корни девясила высокого (rhizomata et radices Inulae helenii). Цветки девясила высокого содержат различные действующие вещества, благодаря чему нашли свое широкое применение в народной медицине. Чай из цветков пьют от удушья, истощения. Имеются литературные данные о том, что водноспиртовые вытяжки из листьев и из цветочных корзинок с семенами обладают противовирусной активностью, угнетают рост золотистого стафилококка и мицелиевых грибов. Перспективно применение цветков девясила высокого при сахарном диабете [10, 11].
Однако, цветки девясила высокого не являются официнальным ЛРС, хотя его сырьевые ресурсы в Беларуси достаточны и доступны: девясил высокий возделывается плантационно ради заготовки корневищ и корней. При этом сбор соцветий не ведет к угнетению растений, а наоборот, стимулирует рост вегетативной массы растения. Поэтому актуальным является разработка нормативной документации на новый вид ЛРС - цветки девясила высокого. Целью данной работы было хроматографическое исследование цветков девясила высокого. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
4
1) Предварительный анализ основных групп БАВ цветков девясила высокого с использованием качественных реакций.
2) Качественный анализ БАВ цветков девясила высокого:
а) Методом бумажной хроматографии;
б) Методом тонкослойной хроматографии.
Методы. Объектами исследования служили цветки девясила высокого, которые были заготовлены на учебно-полевом участке в п. Улановичи (окрестности г.Витебска) в июле - августе 2008 г.Фитохимический анализ проводился по общепринятым методикам с использованием качественных химических реакций, бумажной и тонкослойной хроматографии [12].Для хроматографического анализа 1,0 г цветков девясила высокого, измельчённых до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром 2 мм, экстрагировали 20 мл метанола на горячей водяной бане в течение 1,5 часов. Полученный экстракт фильтровали (экстракт А). 10,0 г цветков девясила высокого (2 мм) экстрагировали 100 мл метанола при 60 °С под воздействием ультразвука в течение 20 мин. Полученный экстракт фильтровали (экстракт В1). К оставшемуся сырью добавили 100 мл метанола и экстрагировали при тех же условиях, что и экстракт В1. Полученный экстракт фильтровали (экстракт В2). К этому же сырью добавили 55 мл 50% метанола и провели экстракцию при выше описанных условиях (экстракт В3).
Полученные экстракты исследовали методом бумажной хроматографии в системе 15% уксусная кислота. Хроматограммы просматривали в УФ-свете до и после проявления. Хроматограммы проявляли следующими реагентами: 0,5% метанольным NEU-реагентом (P-aminodiethylester of diphenylboric acid); 1% метанольным AlCl3; смесью сульфаниловой кислоты, нитрита натрия и 20% раствора карбоната натрия [13]. Экстракты А, В1, В2, В3 объединяли и
5
выпаривали на роторном аппарате до полного отсутствия запаха метанола. Полученный остаток переносили в мерный цилиндр и доводили водой до 100 мл. Этих 100 мл последовательно обрабатывали хлороформом, диэтиловым эфиром и этилацетатом в делительной воронке. Из полученных фракций удаляли под вакуумом растворители, сухие остатки растворяли в метаноле и использовали их для анализа фенольных соединений. Полученные фракции исследовали хроматографическими методами в тонком слое сорбента и на бумаге в различных системах растворителей. В системе 15% уксусная кислота исследование проводили методом бумажной хроматографии, хроматограмму проявляли КЕЦ-реагентом, просматривали в УФ-свете до и после проявления.
Таблица
Последовательность пятен на бумажной хроматограмме после обработки NEU-peaгeнтoм
Линия старта
Эталонные растворы Испытуемые растворы
Хлороформная фракция Эфирная фракция Этилацетатная фракция Водная фракция
Кверцетин: желтое пятно (Ъ=0,03) Желтое пятно (^=0,02-0,04) Насыщенное желтое пятно (^=0,15-0,17) Желтое пятно (^=0,02-0,04) Насыщенное желтое пятно (^=0,15-0,17) Желтое пятно (^=0,02-0,04) Темное фиолетовое пятно (^=0,04-0,06) Оранжевое пятно (^=0,15-0,17) Желтое пятно (^=0,02-0,04) Оранжевое пятно (^=0,15-0,17)
Оранжевожелтое пятно (^=0,34-0,36) Лимонножелтое пятно (^=0,48-0,52) Оранжевожелтое пятно (^=0,34-0,36) Лимонножелтое пятно (^=0,48-0,52) Оранжевожелтое пятно (^=0,34-0,36) Лимонножелтое пятно (^=0,48-0,52)
Фиолетовое пятно (^=0,66-0,69) Голубое пятно (^=0,86-0,89) Голубое пятно (^=0,86-0,89) Голубое пятно (^=0,75-0,77) Коричневое пятно (^=0,87-0,89)
Хроматографическое исследование химического состава цветков девясила высокого в тонком слое сорбента проводили с использованием пластинок «Silica gel 60» фирмы «Merck» восходящим способом в системах растворителей:
А. толуол - этилацетат - уксусная кислота (36:12:5).
Б. этилацетат - муравьиная кислота - уксусная кислота - вода (100:11:11:26).
Испытуемый раствор получали следующим образом. В коническую колбу вместимостью 50 мл помещали 1,00 г измельченного сырья (2 мм), прибавляли 20 мл спирта (96%, об/об) и нагревали на водяной бане с обратным холодильником 30 мин. Охлаждали и фильтровали через бумажный фильтр. Для приготовления раствора сравнения около 0,025 г (точная навеска) кверцетина помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и растворяли в спирте (96%, об/об), доводили объем раствора этим же растворителем до метки, перемешивали.
Наносимый объем пробы: 30 мкл испытуемого раствора в виде полосы длиной 2 см и 5 мкл раствора сравнения в виде точки. Фронт подвижной фазы составлял не менее 15 см от линии старта. Высушивание проводили в течение 10 мин при 100-105°С, затем охлаждали на воздухе. Хроматограммы проявляли с помощью 2% раствора алюминия хлорида в спирте (96%, об/об). Просматривали в ультрафиолетовом свете при 365 нм.
Описанные условия являлись одинаковыми для двух испытуемых систем растворителей А и Б (см. выше).Спектр фенольных соединений изучали методом двумерной хроматографии на целлюлозных пластинках фирмы «Merck» в системе растворителей: первое
направление - н-бутанол - кислота уксусная - вода (6:8:3); второе направление - 15%-ная уксусная кислота. Детектирование фенольных соединений проводили в УФ-свете до и после проявления хроматограмм 2% спиртовым раствором алюминия хлорида. Во всех случаях
идентификацию веществ проводили по свечению в УФ-свете до и после проявления хроматограмм 2% спиртовым раствором алюминия хлорида и по величинам Rf в сравнении со стандартными веществами.
Результаты и обсуждение.
На предварительном этапе нами было установлено наличие основной группы БАВ в цветках девясила высокого - флавоноидов с использованием качественных реакций. По общепринятым методикам проведены следующие качественные реакции на флавоноиды:
1) Цианидиновая проба: появление розово-оранжевого
окрашивания.
2) Реакция с раствором едкой щелочи: появление желтого окрашивания (флавоны, флавонолы, флаваноны).
3) Реакция комплексообразования с хлоридом алюминия: появление лимонно-желтого окрашивания, флюоресцирующего в УФ-свете.
4) Реакция осаждения раствором основного ацетата свинца: наблюдалось образование желто-оранжевого осадка.
С целью подтверждения результатов качественных реакций дальнейшую идентификацию флавоноидов проводили бумажной хроматографией восходящим способом.. Установлено, что наиболее подходящим реагентом для детектирования, при котором разнообразие и количество пятен на хроматограмме наибольшее, является NEU-реагент.Можно сделать вывод о том, что в цветках девясила высокого содержится большое разнообразие веществ фенольной природы, имеющих специфическую для флавоноидов и фенольных кислот окраску с NEU- реагентом. Идентифицирован кверцетин.
Результаты хроматографического исследования химического состава цветков девясила высокого в тонком слое сорбента с использованием пластинок «Silica gel 60» фирмы «Merck» восходящим
8
способом в системах растворителей толуол - этилацетат - уксусная кислота (36:12:5) (далее система А) и этилацетат - муравьиная кислота -уксусная кислота - вода (100:11:11:26) (далее система Б) приведены на рисунках 1, 2.
На хроматограмме раствора свидетеля обнаруживается зона адсорбции кверцетина желтого цвета (4) с ЯГ от 0,32 до 0,34. На хроматограмме спиртового извлечения из цветков девясила обнаруживается зона фиолетового цвета (1) с ЯГ от 0,37 до 0,39, зона желтого цвета (2) с ЯГ (относительно кверцетина) от 0,32 до 0,34, зона желто-коричневого
цвета (3) с ЯГ от 0,29 до 0,31. Основываясь на сопоставлении значений ЯГ и окраске зон адсорбции раствора свидетеля и извлечения из цветков девясила , в цветках девясила высокого идентифицирован кверцетин. Приведена хроматограмма для извлечения из цветков девясила высокого в системе А. иБ.
Рис. 1,2 Хроматограмма для извлечения из цветков девясила высокого в системе А и системе Б.
На хроматограмме идентифицирована последовательность зон адсорбции: 1 - зона На адсорбции желтого цвета (ЯТ ~ 0,37-0,39);2-зонаадсорбции фиолетового цвета (ЯТ ~ 0,32-0,34); 3 - зона адсорбции голубого цвета (ЯТ ~ 0,29-0,31); 4 - зона адсорбции желтого цвета (И ~ 0,32-0,34), 5 - зона адсорбции желтого цвета (ЯТ ~ 0,32-0,34), 6 - зона адсорбции фиолетового цвета (ЯТ ~ 0,32-0,34);7- зона адсорбции ГСО кверцетина (ЯТ ~ 0,32-0,34) желтого цвета.
Таким образом, основываясь на полученных данных, подтверждено наличие кверцетина в цветках девясила высокого.
Схематический вид двумерной хроматограммы приведен на рисунке 3.
Рис. 3. Двумерная хроматограмма для извлечения из цветков девясила
высокого
Первое направление: н-бутанол - кислота уксусная - вода (6:8:3) (К^); второе направление: 15%-ная уксусная кислота (КТ2).
На двумерной хроматограмме после обработки 2% раствором алюминия хлорида обнаружены зоны адсорбции: 1 - зона адсорбции желто-салатового цвета (ЯГ ~ 0,18-0,22); 2 - зона адсорбции желтосалатового цвета (ЯГ ~ 0,4-0,5); 3 - зона адсорбции желтого цвета (ЯГ ~
0,65-0,8); 4 - зона адсорбции желтого цвета (ЯГ ~ 0,15-0,25); 5 - зона адсорбции желтого цвета (ЯГ ~ 0,2-0,4); 6 - зона адсорбции голубого цвета (НТ2 ~ 0,2-0,3); 7 - зона адсорбции голубого цвета (ЯГ ~ 0,3-0,5); 8
- зона адсорбции фиолетового цвета (ЯГ ~ 0,4-0,5); 9 - зона адсорбции голубого цвета (НТ2 ~ 0,55-0,7); 10 - зона адсорбции голубого цвета (ЯГ ~ 0,7-0,85).
До обработки двумерной хроматограммы 2% раствором алюминия хлорида пятна 1 и 2 имели желтую окраску, пятно 3 - коричневую, а пятна 4 и 5 не обнаруживались.
Таким образом, на полученной хроматограмме обнаружено 10 пятен, что может использоваться для качественного анализа извлечения из цветков девясила высокого. Основываясь на значениях и окраске полученных пятен можно предполагать, что вещества 1, 2, 3, 4, 5 относятся к флавоноидам, а 6, 7, 8, 9, 10 - к фенолкислотам.
Заключение
Установлено наличие основной группы БАВ в цветках девясила высокого - флавоноидов с использованием качественных химических реакций.
На основании проведенного анализа методом бумажной хроматографии можно утверждать, что во всех исследованных фракциях (хлороформная, эфирная, этилацетатная) цветков девясила высокого содержится кверцетин.
Проведены исследования по выбору оптимальных условий тонкослойного хроматографирования, позволяющие эффективно
разделить основные компоненты сырья и однозначно идентифицировать одно из доминирующих БАВ - кверцетин.
Обнаружено множество неидентифицированных веществ, имеющих при обработке раствором алюминия хлорида в УФ-свете окраски, характерные для фенольных соединений (флавоноиды, фенолкислоты). Полученные результаты являются предпосылкой для дальнейшего исследования цветков девясила высокого как возможного источника БАВ и введения его в номенклатуру официнальных растений.
Литература
1. Фитохимическое исследование растений флоры Сибири / Д.Л. Макарова [и др.] // Фармация. - 2008. - №3. - С. 19-22.
2. Фогт, В.П. Содержание флавоноидов в противодиабетическом экстракте / В.П. Фогт, Т.А. Степанова // Фармация. - 2007. - №4. - С. 2425.
3. Soczewinski, E. Retention behavior of some flavonoids in 2D-TLC systems on cyano bonded polar phases / E. Soczewinski, M. A. Hawryl, A. Hawryl // Chromatographia. - 2001. - Vol. 54, № 11/12. - P. 789-793.
4. Budzianowski, J. Chromatographic and spectrophotometric analyses of the DPPH free radical scavenging activity of the fractionated extracts from Lamium album L., Lamium purpureum L. and Viscum album L. / J. Budzianowski, A. Budzianowski // Herba Polonica. - 2006. - Vol. 52, № 1/2.
- P. 51-57.
5. Георгиевский, В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук - Новосибирск: Наука, 1990. - 333 с.
6. Vanhaelen, M. Quantitative determination of biologically active constituents in crude extracts of medicinal plants by thin-layer chromatography - densitometry / M. Vanhaelen, R. Vanhaelen // J. of Chromatography. - 1984. - 312. P. 497-503.
12
7. Comparison between high-performance thin-layer chromatography -densitometry and high-performance liquid chromatography for the determination of ajmaline, reserpine and rescinnamine in Rauwolfia vomitoria root bark / P. Duez, [et al.] // J. of Chromatography. - 1986. - 356. P. 334340.
8. Курганская, С.А. Девясил высокий / C.A. Курганская // Биология. - 2004. - № 9. - C. 19-20.
9. Лекарственные растения. Энциклопедия / сост. И.Н. Путырский,
В.Н. Прохоров. - Мн.: Книжный Дом, 2003. - С. 118-120.
10. Николайчук, Л.В. Растения-целители / Л.В Николайчук, Е.С Козюк. - Мн.: Ураджай, 1996. - С. 75-77.
11. Носаль, М.А. Лекарственные растения и способы их применения в народе / М.А. Носаль, И.М. Носаль. - Мн.: Полымя, 1997. - С. 82-85.
12. Коноплева, М.М. Фармакогнозия: природные биологически активные вещества: Учеб. пособие. 2-е издание, дополненное / М.М. Коноплева. - Витебск, ВГМУ, 2007. - 273 с.
13. Wagner, H., Plant drag analysis / H. Wagner, S. Bladt // Springer. -2000. -362 p.
