CC BY
26
УДК 543.544
ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПАРАЦЕТАМОЛ, НА ОБРАЩЕННО-ФАЗОВЫГХ СОРБЕНТАХ
А.В. Иванов, В.Г. Десяткин
(кафедра аналитической химии; e-mail: [email protected])
Техника хроматофокусирования впервые использована для формирования линейных и квазилинейных восходящих градиентов рН внутри колонок с обращенно-фазовыми сорбентами Ди-асорб Д-130-С18 и Диасорб-100-С^моно. Оптимальный состав подвижных фаз: стартовый раствор - 25 мМ KH2PO4 + 25% CH3CN (рН 3,0) элюент - 3,15 мМ KHjPO,, + 25% CH3CN (рН 6,8-7,0). Проведено разделение компонентов лекарственных препаратов "Максиколд" и "Эф-фералган-С" методом хроматофокусирования на сорбенте Диасорб-100-С^моно.
Ключевые слова: хроматофокусирование, внутренний градиент рН, обращенно-фазовые сорбенты, лекарственные препараты.
К настоящему времени хроматофокусирование -хорошо разработанный, широко применяемый метод разделения белков и других биполярных соединений на ионообменных сорбентах при элюировании с внутренним градиентом рН [1-3]. Для формирования внутреннего градиента ионообменный сорбент в колонке предварительно уравновешивают стартовым буферным раствором до начального значения рН, а затем пропускают буферный элюент при рН, соответствующем конечной точке градиента. В результате за счет буферных свойств ионообменной системы в колонке происходит практически линейное изменение рН. Такой подход не требует градиентного насоса, а для регенерации колонки после эксперимента достаточно снова пропустить стартовый раствор, что сокращает продолжительность анализа и создает другие преимущества по сравнению с внешними ступенчатыми или линейными градиентами рН [2, 3]. Хроматофокусирование - не только метод разделения, но и способ формирования градиента рН внутри хроматографической колонки [2]. В слабоосновных анионообменных системах формируют, как правило, нисходящий градиент рН, в слабокислотных системах - восходящий. Разделение биполярных соединений происходит в соответствии с их изоэлек-трическими точками [3].
Хроматофокусирование - настолько устоявшийся метод, что с 2004-2007 гг. он даже включен в программу кандидатских экзаменов в вузах России и Беларуси, в частности, по специальности 02.00.10 -"биоорганическая химия" [4, 5]. Однако, если в 19851998 гг. значительная доля публикаций была посвя-
щена развитию метода, например поиску новых подвижных фаз [6, 7], то в настоящее время большинство статей посвящено рутинному применению хроматофокусирования. Между тем, по нашему мнению, хроматофокусирование можно развивать по ряду направлений, например для применения метода в новых хроматографических системах (в том числе не обладающих буферными свойствами) для разделения новых объектов [8]. Так, нами предложено использовать технику хроматофокусирования для градиентного разделения ионов металлов на комплексообразую-щих анионитах [9] и катионитах [10] или пептидных смесей, полученных трипсинолизом белков, на сильнокислотных сорбентах с сульфогруппами [8].
Внешние ступенчатые и линейные градиенты рН успешно используют при анализе лекарственных препаратов на сорбентах с обращенными фазами [1113]. С учетом преимущества техники хроматофокуси-рования интересно проверить возможность применения внутренних градиентов рН для разделения лекарственных препаратов.
Экспериментальная часть
Аппаратура. Использовали хроматографическую систему, включающую насос высокого давления "Beckman 114M" (США); инжектор "Rheodyne 7125" (США) (объем петли 100 мкл); стальную хро-матографическую колонку; спектрофотометрический детектор "MicroUvis 20" ("Carlo Erba", США); цифровой рН-метр НМ 20-S ("TOA Electronics", Япония) с комбинированным стеклянным электродом GST-5211C. Сигнал СФМ-детекгора регистрировали
на персональном компьютере с АЦП и обрабатывали с помощью программы "Мулътихром 1.52" (ЗАО "Амперсенд", Россия), сигнал рН-метра регистрировали на самописце "LKB-2210" ("LKB-Bromma", Швеция).
Хроматографические колонки (50x4,6 мм, корпус из нержавеющей стали) заполняли сорбентами Диа-сорб Д-130-С18 (диаметр частиц 6 мкм) или Диа-сорб-100-СН-моно (диаметр частиц более 120 мкм)*.
Реагенты и растворы. Для создания внутренних градиентов рН в качестве активных компонентов стартовых растворов и элюентов использовали KH2PO4 ("Wako Chemical Industries", Япония, "ч.д.а."), в некоторых случаях в элюент добавляли Трис ("Merck", Германия, "ч.д.а."). Оптимальную кислотность создавали: в стартовом растворе (рН 3,0) добавлением 1 М HCl, в элюенте (рН 6,8-7,1) -добавлением 1 М KOH. Растворы HCl и KOH готовили из фиксаналов ("Germed", ГДР). Для снижения гидрофобных взаимодействий в подвижные фазы добавляли 5-25 об.% CH3CN ("Лаверна", Россия). В отдельных случаях для создания ионной силы в подвижные фазы добавляли рассчитанное количество 1 M NaCl, приготовленного из фиксанала ("Germed", ГДР).
Объекты исследования. Использовали ряд лекарственных препаратов: парацетамол (ПФК "Обновле-
ние", г Новосибирск и ОАО "ICN Лексредства", г. Курск) и средство от кашля "Максиколд" (ОАО "Фармстандарт-Лексредства", г. Курск); "Эффе-ралган-C" ("Bristol-Myers Squibb", Франция) и аскорбиновую кислоту ("Merck", Германия, "ч.д.а."). Характеристики препаратов представлены в табл. 1. Навески лекарственных средств (0,40-0,50 г) растворяли в 100 мл бидистиллята.
Методика эксперимента. Пропускали стартовый раствор при рН 3,0-3,1 до уравновешивания сорбента в колонке (до совпадения рН на входе и выходе колонки) и установления постоянной базовой линии детектора при 220 нм, а затем меняли стартовый раствор на буферный элюент (рН 6,8-7,1) и регистрировали сигналы рН-метра и СФМ-детектора. При разделении лекарственных препаратов вводили в колонку 5-15 мкл пробы либо после замены стартового раствора на элюент, либо в момент начала градиента рН. Объемная скорость подвижных фаз составляла 1 мл/мин.
Результаты и их обсуждение
Внутренние градиенты рН на сорбенте с при-витьми группами С18. Для анализа жаропонижающих лекарственных препаратов, таких, как панадол, эффералган, парацетамол или многокомпонентных средств от кашля, обычно применяют вариант ОФ
Т а б л и ц а 1
Характеристики лекарственных препаратов на основе парацетамола
Препарат Производитель Активное вещество (масса) на 1 таблетку или пакет Вспомогательные вещества
Парацетамол ПФК "Обновление", г. Новосибирск парацетамол (0,50 г) нет данных
Парацетамол ОАО "ICN Лексредства", г. Курск парацетамол (0,50 г) нет данных
Максиколд ОАО "Фармстандарт-Лексредства", г. Курск парацетамол (0,75 г), аскорбиновая кислота (0,06 г), гидрохлорид фенилэфрина (0,01 г) БЮ2, лимонная кислота, сахаринат и цитрат натрия, крахмал, краситель хинолиновый желтый, ароматизатор, лактоза
Эффералган-С "Bristol-Myers Squibb ", Франция парацетамол (0,33 г), аскорбиновая кислота (0,20 г) сорбитол, лимонная кислота, №НС03, КНС03, бензоат натрия и др.
*Сорбенты любезно предоставлены проф. П.Н. Нестеренко.
ВЭЖХ. В качестве сорбентов используют кремнеземы, модифицированные фазами С8-С18 или нитриль-ными группами [11-13], в качестве элюентов - водно-органические смеси, содержащие буферный реагент, например КН2Р04 или На2НР04. Внешний градиент рН, создаваемый градиентным насосом по заданной программе, позволяет повысить эффективность и разрешающую способность системы [12, 13]. Мы выбрали предложенные условия [12] за основу при создании внутренних градиентов с использованием техники хроматофокусирования. Поскольку сорбенты с обращенными фазами не проявляют буфе-рирующей способности, то роль стартового раствора и элюента в формировании внутреннего линейного градиента рН чрезвычайно важна. Для упрощения системы в целом в качестве активных, т.е. рН-оп-ределяющих, компонентов стартового раствора и элюента выбрали КН2Р04 при равных концентрациях (25 мМ). Полученный градиент состоит из двух участков: первый практически линеен в течение 7 мин в интервале рН от 3,1 до 6,1. Конечное значение (рН 6,8) на втором участке достигается за 11-12 мин (табл. 2). Профиль этого градиента неприемлем для использования в хроматофокусировании, так как изменение рН на основном участке довольно резкое (рис. 1, кривая 1). Необходимо сделать изменение рН в области 3,1-6,1 более продолжительным. Снижение концентрации элюента до 12,5 мМ практически не изменило наклона первого участка, тогда как время достижения конечной точки градиента (рН 6,8) несколько увеличилось (табл. 2). Наиболее плавный, линейный градиент в интервале рН 3,1-6,8 получен при использовании 6,25 мМ КН2Р04 в качестве элюента (рис. 1, кривая 2; табл. 2) - время его выхода составляет около 30 мин, а наклон градиента практически постоянен на всем диапазоне. Таким образом, техника хроматофокусирования впервые применена для формирования линейного градиента рН на обра-щенно-фазовом сорбенте.
Кроме варьирования концентрации активных компонентов подвижных фаз, для управления профилем градиента можно использовать добавки так называемых "инертных компонентов", например №С1 или других сильных электролитов, в стартовый раствор и элюент. Возможности этого подхода были показаны как для слабых анионо- и катионообменных систем [2, 10], так и для сульфокатионообменников, не проявляющих буферной емкости [8]. В случае неионогенного сорбента с группами С18 создание с помощью №С1 ионной силы (до 0,1-0,3) в подвижных фазах не привело к существенному изменению градиента рН (табл. 2).
Наоборот, на профиле градиента появились малозаметные ступени, особенно при создании ионной силы (0,1) в элюенте. Однако добавки сильного электролита позволили снизить концентрации активного компонента (КН2Р04) в подвижных фазах до 2,5-5 мМ (табл. 2). Градиент в этом случае практически совпадает с представленным на рис. 1 (кривая 1).
Наиболее плавный линейный градиент получен за счет добавления в элюент соединения Трис в качестве второго активного компонента при создании одинаковой ионной силы (0,1) в обеих подвижных фазах (табл. 2). Конечное значение рН достигается за 14-15 мин, а наклон градиента постоянен в интервале рН 3,2-7,0. Такой градиент вполне подходит для разделения веществ в хроматофокусировании. Дальнейшее повышение ионной силы (до 0,3) практически не влияет на профиль градиента. Полученный результат косвенно подтверждает сделанные нами ранее выводы [2, 10]: ионная сила влияет существеннее на ионизацию функциональных групп полиэлектролитного сорбента, чем растворенных в подвижной фазе веществ, что и способствует более плавному изменению рН. В данном случае на поверхности сорбента нет ионоген-ных групп, он не может проявлять свойства полиэлектролита, а константы ионизации компонентов в подвижной фазе меняются в пределах не более одного порядка даже при высокой ионной силе [14].
Рассмотренные условия применили для хроматофо-кусирования парацетамола и средства от кашля "Максиколд" на сорбенте Диасорб Д-130-С18. Однако все компоненты элюировались практически в течение "мертвого" времени при рН 3,1 в виде узкого и симметричного хроматографического пика, несмотря на плавное изменение рН. Вероятно, сказалась высокая ионная сила (0,1) обеих подвижных фаз. Наоборот, при использовании системы 25 мМ КН2Р04 (стартовый раствор) - 6,25 мМ КН2Р04 (элюент) в отсутствие №С1 парацетамол элюировался в течение достаточно продолжительного времени, что иллюстрируется симметричным пиком при рН 3,4-3,7, частично совпадающим с системным пиком. Появление системного пика совпадает с изменением рН в области 3,5-5,5. Похожий результат получен и при использовании системы 25 мМ КН2Р04 (стартовый раствор) - 3,15 мМ КН2Р04 - 2,5% СН3СН (элюент), хотя добавки ацетонитрила позволили улучшить форму пика парацетамола. Следовательно, УФ-детекги-рование других компонентов лекарственных средств, например аскорбиновой кислоты, входящей в состав "Максиколда", может также затрудняться в данных условиях. Возможным решением для хроматофокуси-
Т а б л и ц а 2
Восходящие градиенты рН на обращенно-фазовых сорбентах
№ Стартовый раствор (рН) Элюент (рН) Линейный интервал градиента Время градиента, мин*
1 25 мМ КН2Р04 (3,0) 25 мМ КН2Р04, 20% СН3СЫ (6,8) 3,1-6,1 6-7
2 Тот же 12,5 мМ КН2Р04, 10% СН3СЫ (6,8) 3,1-6,3 8-10
3 Тот же 6,25 мМ КН2Р04, 5% СН3СЫ (6,8) 3,1-6,7 ~30
4 5 мМ КН2Р04, 0,1 М ЫаС1 (3,1) 10 мМ КН2Р04, 6 мМ Трис (7,1) 3,3-6,7 5-6
5 Тот же 2,5 мМ КН2Р04, 1,5 мМ Трис (7,1) 3,3-6,8 12-14
6 Тот же 5 мМ КН2Р04, 1,5 мМ Трис, 0,1 М ЫаС1 (7,1) 3,3-6,5 7-8
7 5 мМ КН2Р04, 0,3 М ЫаС1 (3,1) тот же 3,3-6,9 15-17
8 Тот же 5 мМ КН2Р04, 1,5 мМ Трис, 0,3 М ЫаС1 (7,1) 3,3-6,7 8-10
9 25 мМ КН2Р04 (3,0) 3,15 мМ КН2Р04, 2,5% СН3СЫ (6,8) 3,3-6,6 ~35
10 25 мМ КН2Р04 (3,0) 3,15 мМ КН2Р04, 2,5% СН3СЫ (6,8) 3,4-6,6 ~45
11 25 мМ КН2Р04, 25% СН3СЫ (3,0) 3,15 мМ КН2Р04, 25% СН3СЫ (7,0) 3,3-4,1; 4,2-6,8 20-22; 15-17
* Время выхода линейного или квази-линейного участка градиента рН.
рования на сорбенте С18 лекарственных средств, содержащих парацетамол, может быть создание невысокой ионной силы (до 0,01-0,02) в элюентах на основе 2,5 мМ КН2Р04 и Трис.
Градиенты рН на сорбенте с нитрильными группами. В дальнейших исследованиях от кремнезема с привитыми группами С18 отказались и перешли к сорбенту Диасорб Д-100-СН-моно. Нитр ильные группы в зависимости от хроматографических условий могут проявлять себя как нормальная или обращенная фаза [15]. Нельзя отрицать у таких сорбентов способности к частичной ионизации, что упрощает их использование в качестве неподвижной фазы для хроматофокусирования. Удерживание парацетамо-
ла (шра-ацетоаминофенол) на нитрильных группах сорбента может быть обусловлено образованием водородных связей с амино- или гидроксигруппой. При использовании системы 25 мМ КН2Р04 (стартовый раствор) - 3,15 мМ КН2Р04 - 2,5% СН3СН (элю-ент) наблюдали градиент, состоящий из двух протяженных участков с отличающимся наклоном в области рН 3,5-4,5 и 4,5-6,0. Участки плавно соединяются между собой (рис. 1, кривая 3), из-за чего градиент имеет плавную вогнутую форму. В данных условиях значительный системный пик на базовой линии при 220 нм частично перекрывается с пиком парацетамола, поэтому для улучшения разделения было решено добавить ацетонитрил (до 25 об. %) в старто-
Рис. 1. Восходящие градиенты на обращенно-фазовых сорбентах Диасорб Д-130-С18 (1, 2) или Диасорб-100-СК-моно (3, 4). Стартовый раствор: 25 мМ КН2Р04 (1-3), 25 мМ КН2Р04 + 25% СН3СК (4); элюент: 25 мМ КН2Р04, 20% СН3СК (1), 6,25 мМ КН2Р04, 5% СН3СК (2) 3,15 мМ КН2Р04, 2,5% СН3СК (3), 3,15 мМ КН2Р04 + 25% СН3СК (4). Остальные условия приведены в табл. 2
вый раствор и элюент (табл. 2). При этом на профиле градиента наблюдали два линейных участка (рН 3,34,1 и 4,2-6,8), плавно соединяющиеся между собой
(табл. 2, рис. 1, кривая 4). Такой градиент называют квазилинейным [7, 8]. Системный пик на базовой линии сдвигается в область рН 4,3-5,5, а пик парацетамола, несмотря на достаточно большой диаметр частиц сорбента (120 мкм), становится еще более узким и симметричным, что подтверждает фокусирующий эффект системы (рис. 2). Пробу парацетамола вводили либо при замене стартового раствора на элюент, либо в момент изменения рН (т.е. через 10-12 мин после замены растворов); в обоих случаях наблюдали пик при рН 3,3-3,4. В выбранных условиях получили хроматог-раммы парацетамола от различных производителей (рис. 2, а, б), параметры удерживания практически совпадали (максимум пика наблюдали через 16,2-16,5 мин после замены стартового раствора на элюент).
В состав лекарственных препаратов "Максиколд" и "Эффералган-С" входит аскорбиновая кислота, поэтому проверили ее удерживание на сорбенте Ди-асорб Д-100-СК-моно в условиях восходящего градиента рН. В качестве стартового раствора использовали 25 мМ КН2Р04 + 25% СН3С^ в качестве элюента - 3,15 мМ КН2Р04 + 25% СН3СК Пик аскорбиновой кислоты наблюдали при рН 3,15 через 14,2 мин после замены стартового раствора на элю-
Рис. 2. Хроматофокусирование парацетамола производства: а - ПФК "Обновление ", б - ОАО "1СЫЛексредства" Объем пробы 10 мкл. Колонка: Диасорб-100-СК-моно (504,6 мм), стартовый раствор: 25 мМ КН2Р04 + 25% СН3СК, рН 3,0; элюент: 3,15 мМ КН2Р04 + 25% СН3СК, рН 7,0 (детектирование 220 нм)
Рис. 3. Хроматограф ический пик аскорбиновой кислоты. Объем пробы 15 мкл. Условия приведены в подписи к рис. 2
ент (рис. 3). Узкая и симметричная форма пика свидетельствует о фокусирующем эффекте в условиях градиента рН.
Хроматофокусироеание препаратов "Макси-колд" и "Эффералган-С". В выбранных хромато-графических условиях провели хроматофокусирование трехкомпонентного средства от кашля "Максиколд". Поскольку при растворении лекарственного препарата в бидистилляте остается незначительное количество взвеси (видимо, это вызвано присутствием 8Ю2 среди вспомогательных веществ в составе препарата), то раствор перед введением в инжектор хроматографа фильтровали через мембранный фильтр (диаметр пор 0,45 мкм). На хроматограмме получили два узких пика при рН 3,15-3,30, относящиеся к аскорбиновой кислоте и парацетамолу (рис. 4). Отметим, что максимумы этих пиков отличаются всего на 0,15 ед. рН, что сопоставимо с результатами, достигнутыми в класическом варианте хроматофокусирования [3-5] и свидетельствует о широких возможностях предложенного подхода. На хроматограмме есть системный пик (максимум при рН 5,2), более интенсивный, чем полученный ранее для элюента, содержащего 2,5% аце-тонитрила (табл. 2, система 10). Это подтверждает высказанные выше предположения, что системный пик вызван достаточно резким изменением рН в об-
ласти 4,5-5,5, тем более что в случае подвижных фаз, содержащих 25% СИ3СК, значение рН в этой области повышается быстрее. Кроме того, на системный пик может накладываться сигнал гидрохлорида фенилэфрина и вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственного средства.
Жаропонижающее средство "Эффералган-С" хроматографировали в тех же условиях. Навеска препарата растворяется в бидистилляте без образования видимой взвеси, тем не менее во избежание попадания мельчайших механических примесей пробу перед введением в инжектор фильтровали через мембранный фильтр. На хроматограмме получено 3 пика (рис. 5). Интенсивные пики при рН 3,17 и 3,30 относятся к аскорбиновой кислоте и парацетамолу соответственно. Соотношение интенсивностей первых двух пиков изменилось, пик аскорбиновой кислоты заметно увеличился, поскольку в препарате "Эффералган-С" соотношение парацетамола и аскорбиновой кислоты составляет по массе примерно 3:2, а в "Максиколде" - 12:1. На хроматограмме при значении рН, равном 3,5, появился новый пик, вызванный, вероятно, элюированием вспомогательных веществ препарата (предположительно, сорби-тол). Все три пика имеют узкую и симметричную форму, как и в классическом хроматофокусировании.
Рис. 4. Хроматофокусирование лекарственного препарата "Максиколд": 1 - аскорбиновая кислота, 2 - парацетамол, 3 - системный пик. Объем пробы 10 мкл. Условия приведены в подписи к рис. 2
t, мин
Рис. 5. Хроматофокусирование "Эффералгана-С": 1 - аскорбиновая кислота, 2 - парацетамол, 3 - наполнитель (сорбитол), 4 - системный пик. Объем пробы 10 мкл. Условия приведены в подписи к рис. 2
Широкий системный пик в области рН 4,5-5,5 имеет практически такую же интенсивность, как и для "Максиколда". При повторных (до 3-4 раз) вводах пробы лекарственных препаратов "Максиколд" и "Эффералган-С" значения рН, соответствующие максимумам хроматографических пиков, изменялись не более чем на ±0,02 ед. рН.
Таким образом, впервые с применением техники хроматофокусирования получены линейные и квазилинейные восходящие градиенты рН внутри обра-щенно-фазовых колонок. Возможности нового варианта хроматофокусирования показаны на примере разделения компонентов лекарственных препаратов "Максиколд" и "Эффералган-С".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sluyterman L.A.Ae, Kooistra C. // J. Chromatogr. 1989. 470. P. 317.
2. Иванов A.B. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2005. 46. С. 203.
3. Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing: Principles and Methods. Uppsala: Amersham Biosciences, 2004.
4. Сайт Института биоорганической химии РАН. Программа-минимум кандидатских экзаменов. http://www.ibch.ru/ dprtms/PostGrad/020010k_6.html
5. Сайт ВАК Республики Беларусь. Программа-минимум кандидатских экзаменов. http://www.vak.org.by/ index.php?go=Box&in=view&id=519
6. MurelA., Vilde S., PankM. et al. // J. Chromatogr. 1985. 347. P. 325.
7. BatesR., Frey D.D. // J.Chromatogr.A. 1998. 814. P. 43.
8. Иванов А.В., ВакштейнМ.С. // Молекулярные технологии. 2007. 1. С. 15.
9. Меь1егепко Р.К, 1уапоуА. V. // I СЬгошаЮяг. 1994. 671. Р. 95.
10. Иванов А.В., Смирнова Н.Ю., Вакштейн М.С. // ЖФХ. 2007. 81. С. 704.
11. Голубицкий Г.Б., Будко Е.В., Басова Е.М. и др. // ЖАХ. 2007. 62. С. 636.
12. Голубицкий Г.Б., Иванов А.В., Басова Е.М., ИвановВ.М. // ЖАХ. 2007. 62. С. 969.
13. Голубицкий Г.Б., Будко Е.В., Иванов В.М. // ЖАХ. 2006. 61. С. 74.
14. Мчедлов-Петросян Н. О. Дифференцирование силы органических кислот в истинных и организованных растворах. Харьков, 2004.
15. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М., 1986.
Поступила в редакцию 28.06.08
CHROMATOFOCUSING OF THE DRUGS, CONTAINING PARACETAMOL, ON THE REVERSED-PHASE SORBENTS
A.V. Ivanov, V.G. Desyatkin
(Analytical Chemistry Division)
The chromatofocusing technique was applied for linear and quasi-linear pH-gradient formation within the reversed-phase columns, packed with Diasorb D-130-C18 h Diasorb-100-CN-mono for the first time. The optimal mobile phases are: the start buffer - 25 mM KH2PO4 + 25% CH3CN, pH 3,0, the eluent - 3,15 mM KH2PO4 + 25% CH3CN, pH 6,8-7,0. The chosen chromatographic conditions were used for separation of drugs "Maxicold" and "Efferalgan-C" by chromatofocusing technique on the sorbent Diasorb-100-CN-mono.
Key words: chromatofocusing, internal pH gradient, reversed-phase sorbents, drugs.
Сведения об авторах: Иванов Александр Вадимович - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук ([email protected]); Десяткин Виктор Григорьевич - студент 3 курса химического факультета МГУ ([email protected]).
