CC BY
15
Бекбауов С.А., Липницкий Е.М., Истратов В.Г. ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ БОЛЬНЫХ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХОЙ
ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ БОЛЬНЫХ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХОЙ
Бекбауов С.А.1, Липницкий Е.М.1, Истратов В.Г.2 УДК: 616.36-008.5-07
1 Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ
2 Институт Хирургии им. А.В. Вишневского, г. Москва
Резюме
В статье авторами изучены возможности хромато-масс-спектрометрического анализа и проанализированы ее диагностическая и прогностическая оценка для определения степени печеночной недостаточности у 120 больных механической желтухой.
Ключевые слова: механическая желтуха, токсические кишечные метаболиты, хромато-масс-спектрометрический анализ, печеночная недостаточность.
CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRIC ANALYSIS OF PERIPHERAL BLOOD FOR DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC EVALUATION OF PATIENTS WITH OBSTRUCTIVE JAUNDICE
Lipnitsky E.M., Bekbauov S.A., Istratov V.G.
In this paper the authors studied the possibility of gas chromatography-mass spectrometry analysis and analyzed itsdiagnostic and prognostic assessment to determine the degree ofliver failure in 120 patients with obstructive jaundice.
Keywords: obstructive jaundice, intestinal toxic metabolites, gas chroma-tography-mass spectrometry analysis, liver failure.
Введение
Известно, что у больных механической желтухой происходят выраженные изменения не только в печеночном звене (холестаз, холемия,холангит, печеночная энцефалопатия), но и глубокие дисбиотические нарушения вследствие ахолии, токсические метаболиты которых приводят к бактериальной транслокации и эндотоксемии, усугубляя при этом печеночную недостаточность.
Целью исследования - изучить возможности хрома-то-масс-спектрометрического анализа периферической крови для диагностической и прогностической оценки больных механической желтухой.
Газохромато-масс-спектрометрические исследования токсических кишечных метаболитов проводили у 120 больных разного пола и возраста по 4-м направлениям: (1) исследование летучих жирных кислот (жирные кислоты с короткой цепью, далее, короткоцепочечные жирные кислоты - КЖК) и токсических метаболитов в сыворотке крови с определением хроматографического показателя интоксикации; (2) определение производных билирубина и короткоцепочечных жирных кислот непосредственно в желчи у больных; (3) выявление аммиака и его токсических производных в сыворотке крови и (4) определение сигнальных молекул чувства кворума (Quorum Sensing) - активаторов кооперативного поведения микроорганизмов: лактонов, хинолонов, фурановых эфиров и родственных соединений в сыворотке крови.
Предварительно была разработана рабочая схема хроматографического и масс-спектрометрического исследования биологического материала у больных механической желтухой различного генеза. При исследовании периферической крови осуществляли пробоподготовку с экстракцией соединений с помощью диэтилового эфира
и гексана. Этим методом определяли КЖК и метаболиты группы фенолов и крезолов, фенилкарбоновые и оксифе-нилкарбоновые кислоты, ди- и полиамины, ароматические амины, изожирные высшие кислоты.
Для определения молекул QS-системы использовали масс-селективный детектор MSD- 5375 с определением масс-спектров сигнальных соединений и скрининговым исследованием больных (лактоны, хинолоны и фурано-вые эфиры). Желчь больных исследовали с помощью экстракции на твердофазном носителе и экстракцией диэтиловым эфиром с прямым вводом в хромотографах, также осуществляли перевод в триметил-силильные соединения (ТМС) с последующей хромато-масс-спектро-метрией метаболитов билирубина. Аммиак и его производные определяли по методике Branhova М. et а1. (1978) в модификации Ежелевой А.Е с соавт. (1978).
Результаты и обсуждение
На основании использования методов многомерной статистики был выстроен приоритетный ряд хромато-графических показателей, используемых нами в данной работе (табл. 1).
По величине удельного веса (на основании факторного анализа) на первые 15 мест претендуют следующие хроматографические показатели: на места 1-е, 3-е и 5-е с величинами удельного веса - 0,976, -0,943 и 0,937 соответственно определены оксифенилкарбоновые кислоты, ароматические амины и изожирные высшие кислоты, определяющие по нашему мнению степень гипоксиче-ских изменений в ткани печени (оксифенилкарбоновые кислоты), а также метаболические нарушения на фоне печеночной недостаточности (ароматические амины) и наличием септического компонента (изожирные высшие
Бекбауов С.А., Липницкий Е.М., Истратов В.Г.
ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ БОЛЬНЫХ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХОЙ
Табл. 1. Приоритетный ряд основных хроматографических показателей у больных механической желтухой (по данным факторного анализа)
№ Наименование показателя Величина удельного веса
1 оксифенилкарбоновые кислоты 0,976
2 пропионовая кислота 0,958
3 ароматичесие амины 0,943
4 масляная кислота 0,941
5 изожирные высшие кислоты 0,937
6 изовалериановая кислота 0,923
7 фурановые эфиры 0,911
8 изокапроноая кислота 0,907
9 2-пропанамид 0,893
10 фенилкарбоновые кислоты 0,878
11 хинолоны 0,871
12 лактоны 0,865
13 аммиак 0,856
14 фенолы 0,841
15 крезолы 0,836
16 коэффициент анаэроб\аэроб 0,822
17 метионин сульфат 0,819
18 уксусная кислота 0,811
19 ди-и полиамины 0,803
20 1\1-1\1-диметил-алкил-амин 0,798
21 ассоциир.с альбумином билирубин 0,767
22 билирубин диглюкоронид 0,763
23 валериановая кислота 0,758
24 билирубин-моно-2-глюкоронид 0,732
25 капроновая кислота 0,726
26 мезобилирубин 0,721
27 комплекс билирубина+фосфолипиды 0,711
28 комплекс билирубина+ пироллы 0,703
кислоты). На 2-ое, 4-ое, 6-ое и 8-ые места с величинами удельного веса - 0,958; 0,941; 0,923 и 0,907 соответственно определены КЖК - пропионовая, масляная, изовалери-ановая и изокапроновая, являющиеся классическими метаболитами анаэробной микрофлоры, четко присутствующими в данном биотопе анаэробной инфекции в организме (речь идет о кишечной микрофлоре, определяющей преобладание микробных анаэробных метаболитов одонтогенной микрофлоры типа фузобактерий и ротовых трепонем). На места 9-е, 10-е и 13-е с величиной удельного веса 0,833; 0,878 и 0,856 соответственно претендовали 2-пропанамид, фенилкарбоновые кислоты и аммиак, которые также в определенной степени свидетельствовали о нарушениях метаболизма в гепатогастродуоденальной зоне. На 7-е, 11-е и 12-е места с величиной удельного веса 0,911; 0,871 и 0,865 соответственно претендовали такие показатели как фурановые эфиры, хинолоны и лактоны - представители микробных сигнальных соединений - ау-тоиндукторов - активаторов кооперативной чувствительности, определяющие готовность к обьединению разных групп грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (включая условно-патогенные и сапрофиты), при запуске с помощью QS-системы «Quorum Sensing»
генов патогенности и развития генерализованного инфекционного процесса 14-е и 15-е места с величинами удельного веса 0,841 и 0,836 соответственно занимает фенолы и крезолы, определяющие степень развития почечной недостаточности.
Существенную роль в патогенезе септических процессов у больных механической желтухой играет полиорганная недостаточность, и прежде всего печеночно-почечная (фенолы и крезолы), а также ди-, и полиамины , и N-N-диметил-алкил-амин, которые претендовали на 19-е и 20-е места с величинами удельного веса - 0,803 и 0,798 соответственно. На 21-е, 22-е, 24-е, 26-е, 27-е и 28-е места претендовали ассоциированные с альбумином формы билирубина, билирубин диглюкоронид, билирубин моно-2-глюкоронид, мезобилирубин, комплексы билирубина с фосфолипидами и комплексы билирубина с пироллами с величинами удельного веса - 0,767; 0,763; 0,732; 0,721; 0,711 и 0,703 соответственно. Эти соединения определяли достаточно сложные механизмы связывания и выведения билирубина из организма, особенности его метаболизма в организме.
Заключение
Таким образом, хроматографические и хромато-масс-спектрометрические исследования периферической крови у больных механической желтухой позволяют оценить степень печеночной недостаточности, участие токсических метаболитов кишечной микрофлоры в патологическом процессе с опасностью развития генерализованной инфекции активизированной собственной дисбиозной грампо-ложительной и грамотрицательной микрофлорой.
Литература
1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника как клинико-лабо-раторный синдром: современное состояние проблемы. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.
2. Петров Л.Н., Бондаренко В.М, Вахитов Т.Я., Воробьев А.А. QS-системы у бактерий и перспективы разработки новых метаболитных пробиотических препаратов. Вестн. РАМН, 2006, 1: 38-45.
3. Ежелева А.Е., Малыгина Л.С., Чурбанов М.Ф. Журн. аналит. химии, 1978, Т. 35.
4. Хромотография. Практическое приложение и методы. Под ред.Э.Хартмана, М., Мир. 1986, - 422с.
5. Branhova M., Minarovie G., Blahovec B. Chem.Prim. 1978, Vol. 28, - P. 568.
6. Eberhard A., Burlingame A.L., C. Eberhard et al. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase // Biochemistry. - 1981. - Vol. 20
- p. 2444-2449.
7.Federle M.J., Bassler B.L. Interspecies communication in bacteria // J. Clin. Invest.
- 2003. - Vol. 112, № 9. - Р. 1291-1299.
8.Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacteriol.
- 1994. - Vol. 176, № 2. - P. 269-275.
9. Parsek M.R., Val, D.L., Hanzelka, B.L. et al. Acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal generation // PNAS USA - 1999. - Vol.96. - P. 4360-4365.
10. Schauder S., Shokat K., Surette M. G. et al. The LuxS family of bacterial autoi-nducers: biosynthesis of a novel quorum sensing signal molecule // Mol. Microbiol.
- 2001. - Vol. 41, № 2. - Р. 463-476.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Бекбауов С.А.
тел.: +7 (925) 059-19-95, е-mail: [email protected]
