Хинолизидиновые алкалоиды maackia amurensis Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Хинолизидиновые алкалоиды тааск1а ашиге^э

Соколова Л. И. (1) (sokolova@dvgu.chem.ru), Горовой П. Г. (2),

Молчанова А. И. (1)

(1)Дальневосточный государственный университет, (2)Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения

Российской академии наук

Интерес к изучению алкалоидов вызывается, прежде всего, тем, что многие из них являются незаменимыми лекарственными веществами. Особое место занимают хинолизидиновые алкалоиды, которые оказывают на организм человека и животных возбуждающее или парализующее действие [1]. Наиболее известными веществами этой группы являются:

цитизин (1) - мощный возбудитель дыхания и кровообращения, является возбудителем нервного дыхательного центра [2,3];

пахикарпин (2) - ганглиоблокатор, применяется главным образом, при спазмах периферических сосудов, а также при ганглионитах, улучшает функцию мышц при миопатии [4] (Рис.1).

Рис. 1. Основные хинолизидиновые алкалоиды М. amurensis

Хинолизидиновыми алкалоидами богаты растения семейства ЕаЪаееае (Leguminosae), среди которых особое место занимает ЫааеЫа amurensis - единственный аборигенный древесный представитель бобовых флоры Дальнего Востока.

По данным исследований, проведенных в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук, запасы ЫааеИа amurensis достаточны для промышленных заготовок с последующим получением лекарственных препаратов [5].

Ранее в М. amurensis исследовали содержание хинолизидиновых алкалоидов в различных частях растения (стебли, листья, семена, плоды (бобы), цветки, кора ствола и

(1)

ветвей, корни). В 50-е годы были обнаружены только цитизин и /-лупанин, но уже в 80-е годы были идентифицированы: цитизин, N-метилцитизин, спартеин, анагирин, люпанин, 5,6-дегидролюпанин, люситанин, ромбифолин, аммодендрин, камоенсидин, маакиамин и 13-ß-гидроксимамиинин [6,7,8]. Наиболее высоким содержанием алкалоидов отличаются семена растения [6].

Актуальность этого исследования вызвана тем, что молодые побеги растения, как правило, являются отходами при использовании Maackia amurensis в производстве лекарственного препарата "Максар", обладающего гепатозащитным действием [5,9].

Нами предприняты попытки исследования состава хинолизидиновых алкалоидов молодых побегов Maackia amurensis и выявления возможностей увеличения суммарного выхода этих веществ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Экстракция алкалоидов из растительного сырья

1.Экстракция алкалоидов смесью аммиак - хлороформ. Навеску сырья массой 5,0 г измельчали и экстрагировали раствором аммиака в хлороформе (5:100v/v). Хлороформенный экстракт упарили, остаток нейтрализовали и подкисляли 1%-ным раствором HCl до рН 2. Солянокислый раствор экстрагировали диэтиловым эфиром для удаления липидов и пигментов. Очищенный экстракт подщелачивали 10%-ным раствором K2CO3 до рН 11. Алкалоиды экстрагировали хлороформом в виде свободных оснований. Упаренный хлороформенный экстракт использовали для хроматографического анализа [1].

2.Экстракция этиловым спиртом. Для выделения хинолизидиновых алкалоидов навеску измельченного сырья (5,0 г) трехкратно экстрагировали 75%-ным этиловым

о

спиртом. Экстракты объединяли, спирт отгоняли на водяной бане (t=70 С). Остаток подкисляли 1 %-ным раствором соляной кислотой до рН 2 и экстрагировали диэтиловым эфиром для удаления липидов и других примесей. Водный слой подщелачивали 1 0%-ным раствором K2CO3 до рН 11, алкалоиды экстрагировали хлористым метиленом в виде свободных оснований. Упаренный хлорметиленовый экстракт использовали для хроматографического анализа [10].

З.Гидролиз 2н соляной кислотой. Навеску измельченного растительного материала массой 5,0 г обрабатывали 2н раствором HCl при нагревании (водяная баня) в течение 2-х часов. Солянокислый экстракт отфильтровывали и экстрагировали диэтиловым эфиром для удаления примесей. Эфирные фракции отбрасывали, а водный слой подщелачивали 1 0%-ным раствором K2CO3 до рН 11 и экстрагировали алкалоиды хлористым метиленом в виде

свободных оснований. Упаренный хлорметиленовый экстракт использовали для хроматографического анализа.

ГХ-МС-анализ проводили на приборе фирмы Agilent 5973N GC/MSD с масс-селективным детектором, колонка HP-5 (30мх0,32мм), программирование температуры от 150°С до 270°С, скорость программирования 10°/мин. Фрагментацию разделенных пиков проводили в режиме электронного удара (70 эВ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение методик извлечения хинолизидиновых алкалоидов

В литературе описаны разнообразные методики выделения алкалоидов из растительного сырья [1,10,11,12,13,14]. Мы выбрали две наиболее часто применяемые:

а) экстракция смесью аммиак - хлороформ (извлечение алкалоидов в виде оснований)

б) экстракция этиловым спиртом (извлечение алкалоидов в виде солей).

Данные, полученные при использовании различных методов экстракции, представлены в таблице 1 .

Таблица 1 .

Суммарное содержание алкалоидов (мг/г сухого образца) в различных частях молодых побегов Maackia amurensis

Исследуемая Экстрагирующий Содержание алкалоидов (мг/г) (среднее из 3-х измерений)

Maackia часть растения растворитель

amurensis Заболонь а) NH4OH+ CHCl3 0,95 ± 0,04

Заболонь б) C2H5OH 1,56 ± 0,05

Кора Ядровая древесина б) C2H5OH 0,97 ± 0,07 0,58 ± 0,06

При сравнении методик использовали данные, полученные для заболони, так как содержание алкалоидов в этой части растения оказалось максимальным. При экстракции этиловым спиртом содержание алкалоидов примерно в 1 ,6 раз больше, чем при экстракции аммиак - хлороформ. Это позволило выбрать метод спиртовой экстракции как основной для выделения алкалоидов из различных частей растения.

Максимальное содержание алкалоидов отмечено в заболони (0,16% от массы навески), в коре и ядровой древесине - 0,10% и 0,06% соответственно (табл.1).

В растениях алкалоиды находятся в основном в виде солей, эфиров или ионных ассоциатов с органическими и минеральными кислотами или их солями и поэтому

целесообразно было исследовать влияние гидролиза исходного сырья на суммарный выход алкалоидов.

Для этого мы использовали реакцию кислотного гидролиза древесины. Методику гидролиза отрабатывали, используя заболонь молодых побегов М. amurensis. Применение гидролиза позволило увеличить выход алкалоидов от 1,56 до 1,81 мг/г сухого образца. Таким образом, предварительный гидролиз исходного сырья позволил в 1,2 раза увеличить выход алкалоидов, по сравнению с экстракцией этиловым спиртом, и в 1 ,9 раз, по сравнению с экстракцией смесью аммиак - хлороформ.

Влияние ионной силы на суммарный выход алкалоидов

Выделение алкалоидов методом экстракции сопровождалось определенными трудностями: образование обильной пены, отсутствие четкой границы раздела водного и органического слоев. Для "гашения" пены и лучшего разделения слоев, использовали добавление сухого хлорида натрия. Однако этот прием делал невоспроизводимыми результаты выделения. Поэтому хлорид натрия добавляли в виде раствора (электролит), т.е. изменяли ионную силу (I) экстрагирующего растворителя. Для исследования влияния ионной силы на выход алкалоидов проводили экстракцию равных навесок исходного материала растворителем с различными значениями I.

Ионную силу растворов рассчитывали, используя уравнение [15]:

I = £ 0,5^?, где

1

I - ионная сила раствора

Сг - концентрация каждого иона, входящего в состав электролита И - заряд иона

Раствор электролита использовали как один из компонентов экстракционной системы. Значения ионной силы раствора варьировали от 0,01 до 5,00 моль/л. Полученные данные приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Выход алкалоидов при различных значениях ионной силы раствора

Ионная сила раствора электролита (I) (моль/л) - 0,01 0,05 0,2 0,5 1,0 2,0 3,5 5,0

Масса алкалоидов (мг/г сухого образца) 1,82 2,03 2,72 5,30 5,52 5,06 5,79 6,57 *

* - не определялось

Суммарный выход алкалоидов увеличивается с увеличением ионной силы раствора, но происходит это до значения I = 3,5 моль/л, затем начинается процесс «высаливания» алкалоидов на кристаллах хлорида натрия, что не позволяет оценить полученные результаты. Таким образом, было выбрано оптимальное значение ионной силы раствора, которое составило 3,5 моль/л.

Анализ смеси хинолизидиновых алкалоидов и их идентификация В табдице 3 представлен качественный состав алкалоидов идентифицированных в различных частях растения.

Таблица 3.

Хинолизидиновые алкалоиды, идентифицированные по результатам ГХ-МС анализа

Объект исследования Время удерживания Ы Название алкалоида М Пять наиболее интенсивных ионов

Кора 12,52 Аммодендрин* 208 165 110 1 23 136 191

13,72 К-метилцитизин* 204 58 204 1 46 160 205

14,17 Цитизин* 190 190 146 147 134 160

11,57 Маакиамин* 194 1 23 151 136 166 177

17,51 К-ацетилцитизин^ 232 146 218 147 44 160

Заболонь 11,97 Пахикарпин* 234 137 234 98 193 136

13,72 К- метилцитизин* 204 58 204 1 46 160 205

17,76 Анагирин* 244 98 244 97 1 46 243

11,39 ¡-Спартеин* 234 137 234 98 193 136

12,06 1,2-Дегидромаакиамин* 192 149 192 122 43 135

12,52 Аммодендрин* 208 165 110 1 23 136 191

14,17 Цитизин* 190 190 1 46 1 47 134 160

11,57 Маакиамин* 194 1 23 151 136 166 177

17,51 К-ацетилцитизин^ 232 1 46 21 8 1 47 44 160

Ядровая 13,72 К-метилцитизин* 204 58 204 1 46 160 205

древесина 17,76 Анагирин* 244 98 244 97 146 96

17,51 К-ацетилцитизин^ 232 146 218 147 44 160

* - по данным библиотеки №БТ

■ - идентифицированы предположительно

Особое внимание с точки зрения качественного разнообразия алкалоидов привлекает заболонь и кора молодых побегов М. amurensis. В заболони содержится 9 идентифицированных алкалоидов, а в коре -5. Кора M.amurensis может служить источником хинолизидиновых алкалоидов. В экстракте ядровой древесины обнаружено 3 алкалоида, но общее их содержание невелико. Ядровая древесина растения используется для производства полифенольного препарата "Максар", обладающего гепатозащитным действием и применение ее для количественного выделения хинолизидиновых алкалоидов нецелесообразно.

Анализ и идентификацию алкалоидов проводили методом хромато-масс-спектрометрии, в режиме электронного удара (70 эВ). По характерным фрагментам делали

предположение о структуре выделенных алкалоидов. Полученные масс-спектры сравнивали с данными библиотеки NIST и опубликованными масс-спектрами известных хинолизидиновых алкалоидов [16].

На рис. 2, 3 и 4 приведены хроматограммы смеси хинолизидиновых алкалоидов, выделенных из коры, заболони и ядровой древесины.

Abundan

IpCKWOO еооооо

60СИК» 700000 еооооо SOOOOO 400000

эоаооо

гооооо

ЮОрОО

17.49

I 19.С1

8. СЮ

Ю.СО 12.00 1-4-00 1S.OO ШОВ 20.D0 22.ОО 2Л.ОО 26.00 2В.ОО ЗО.ОО

Рис. 2. Хроматограмма экстракта коры

Abuntance

6000000

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000

о

10.67

9.58 9,93

12.53.

11.»11,й?'

ацк

12.90

14.85

14.23

13.23

t 13,73

.1449

| i ■ I i i I'iH I i i i [1'Н1 I'^'I I I I ¡» t f'i'i i'l i1^ i IVifl'i I'I'VI'I M j РГ(*11 I I i i 11 II I'| i > I fi4 i 0 Г1Ч I'I i l'i i

Ti™ 9.SC 1Q.D0 10.60 11.DO 1Ш 12.00 IZ5Q 13.00 1Ш 14.CQ 1Ш 16.00 16JQ 16.00 1Ш 17.00 17.00 1Ш

17.55

17.7«

16.23

Рис. 3. Хроматограмма экстракта заболони

Рис. 4. Хроматограмма экстракта ядровой древесины

Кроме ранее известных хинолизидиновых алкалоидов, в М. amurensis нами были впервые идентифицированы 1,2-дегидромаакиамин и К-ацетилцитизин. Их структурные формулы представлены на рис. 5, масс-спектры на рис. 6 и рис. 7 соответственно.

СН3СО

N

1,2-дегидромаакиамин

О

К-ацетилцитизин

Рис. 5. Хинолизидиновые алкалоиды, впервые идентифицированные в М. amurensis

Рис. 6. Масс-спектр пика с tR=12.06

Рис. 7. Масс-спектр пика с ^=17.49

№метилцитизин идентифицирован в коре, заболони и ядровой древесине молодых побегов М. amurensis. Цитизин, аммодендрин и маакиамин обнаружены только в коре и заболони. 1,2-дегидромаакиамин, 1-спартеин и пахикарпин были идентифицированы нами в заболони, анагирин обнаружен в заболони и ядровой древесине.

В молодых побегах М. amurensis мы не обнаружили люпанин, люситанин, 13-^-гидроксимаманин и ромбифолин, которые ранее были идентифицированы в стволе, цветках и семенах М. amurensis [6,8,17].

ВЫВОДЫ

1. При сравнении методик выделения хинолизидиновых алкалоидов ЫааеИа amurensis выбрана наиболее эффективная, включающая кислотный гидролиз исходного сырья.

2. Исследовано влияние ионной силы экстрагирующего растворителя на выход хинолизидиновых алкалоидов. Показано, что максимальный выход достигается при значении ионной силы 3,5 моль/л.

3. Методом ГХ-МБ-анализа в М. amurensis идентифицировано 9 хинолизидиновых алкалоидов, впервые в М. amurensis были обнаружены алкалоиды 1,2-дегидромаакиамин и №ацелцитизин.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Мироненко А.В. Методы определения алкалоидов. Минск: 1966. 179 с.

2. МашковскийМ.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1993. т. 2. С. 157

3. ЦаревМ.В. // Труды ВИЛАР. 1950. вып. 10. С.138

4. Семенов А.А. Очерк химии природных соединений. Новосибирск: Наука, 2000. С.472

5. Максимов О.Б., Кулеш Н.И., Горовой П.Г. // Растительные ресурсы. 1992. т. 28. вып.3. С.157

6. Никонов Г.К. // Тр. ВИЛАР. 1959. вып.11. С.38

7. Шретер А.И. Лекарственная флора Советского Дальнего Востока. М.: Медицина, 1975. 328 с.

8. Saito K., Yoshino T., Sekine T., Ohmiya S., Kubo H., Otomasu H., Murakoshi I. // Phytochemistry. 1989. V.28. No.9. P.2533

9. Максимов О.Б., Кривощекова О.Е., Степаненко Л.С. и др. Способ получения растительных полифенолов, обладающих гепатозащитным действием: А.с. №151147 СССР. 1989

10. Murakoshi I., Kidoguchi E., Haginiwa J., Ohmiya S., Higashiyama K., Otomasu H. // Phytochemistry. 1982. V.21. No.9. P.2379

11. Химический анализ лекарственных растений. М.: 1983. 175 с.

12. Орехов А.П., Норкина С.С. // Журнал общей химии. 1937. т. VII. вып. 3-4. С.743

13. Сафронич Л.Н. // Труды ВИЛАР. 1959. вып. 11. С. 30

14. Xiao P., Kubo H, Komiya H. // Phytochemistry. 1999. V.50. P. 189

15. Основы аналитической химии / Под ред. Золотова Ю.А. М.: "Высшая школа". 1996. т. 1. С. 105

16. Cho Y.D., MartinR..O. // Analytical Biochemistry. 1971. V.44. P.19

17. Saito K., Tsai S., Ohmiya S., Kubo H., Otomasu H., Murakoshi I. // Chem. Pharm. Bull. 1986. V.34. No.9. P. 3982